Method Article

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os recentes avanços no software de instrumentação e processamento de imagens tornaram a microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) o método preferido para biólogos estruturais determinarem estruturas de alta resolução de uma grande variedade de macromoléculas. Vários pacotes de software estão disponíveis para usuários novos e experientes para processamento de imagens e cálculo de estrutura, que simplificam o mesmo fluxo de trabalho básico: filmes adquiridos pelos detectores de microscópio passam por correção para estimativa da função de transferência de movimento e contraste (CTF) induzida pelo feixe. Em seguida, as imagens de partículas são selecionadas e extraídas de quadros de filme medianos para classificação iterativa 2D e 3D, seguidas de reconstrução 3D, refinamento e validação. Como vários pacotes de software empregam algoritmos diferentes e exigem diferentes níveis de experiência para operar, os mapas 3D que eles geram muitas vezes diferem em qualidade e resolução. Assim, os usuários transferem regularmente dados entre uma variedade de programas para obter resultados ideais. Este artigo fornece um guia para que os usuários naveguem em um fluxo de trabalho através dos pacotes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma estrutura de resolução quase atômica do vírus associado ao adeno (AAV). Primeiro detalhamos um pipeline de processamento de imagem com o crioSPARC v3, pois seus algoritmos eficientes e gui fácil de usar permitem que os usuários cheguem rapidamente a um mapa 3D. Na etapa seguinte, usamos pyem e scripts internos para converter e transferir coordenadas de partículas da melhor reconstrução 3D de qualidade obtida em crioSPARC v3 para RELION-3 e Scipion 3 e recalcular mapas 3D. Finalmente, delineamos etapas para maior refinamento e validação das estruturas resultantes, integrando algoritmos do RELION-3 e Scipion 3. Neste artigo, descrevemos como utilizar efetivamente três plataformas de processamento para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados para determinação de estrutura de alta resolução.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia crio-elétron (crio-EM) e a análise de partículas únicas (SPA) permitem a determinação da estrutura de uma grande variedade de conjuntos biomoleculares em seu estado hidratado, ajudando a iluminar os papéis dessas macromoléculas em detalhes atômicos. Melhorias na óptica de microscópio, hardware de computador e software de processamento de imagens tornaram possível determinar estruturas de biomoléculas em resolução que ultrapassassem 2 Å1,2,3. Mais de 2.300 estruturas crio-EM foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) em 2020, em comparação com 192 estruturas em 20144, indicando que o crio-EM tornou-se o método de escolha de muitos biólogos estruturais. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que combina três programas SPA diferentes para determinação da estrutura de alta resolução (Figura 1).

O objetivo da SPA é reconstruir volumes 3D de um espécime alvo a partir de imagens 2D ruidosas registradas por um detector de microscópio. Os detectores coletam imagens como filmes com quadros individuais do mesmo campo de visão. Para preservar a amostra, os quadros são coletados com uma dose eletrônica baixa e, portanto, têm uma má relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a exposição a elétrons pode induzir o movimento dentro das grades crio-EM vitrificadas, resultando em desfoque de imagem. Para superar esses problemas, os quadros estão alinhados para corrigir o movimento induzido pelo feixe e médios para produzir um micrografo com um SNR aumentado. Esses micrografos passam então pela estimativa da Função de Transferência de Contraste (CTF) para explicar os efeitos do desfoco e das aberrações impostas pelo microscópio. A partir dos micrografos corrigidos pelo CTF, as partículas individuais são selecionadas, extraídas e classificadas em médias de classe 2D representando diferentes orientações adotadas pelo espécime em gelo vítreo. O conjunto homogêneo resultante de partículas é usado como entrada para a reconstrução 3D ab iniciado para gerar um modelo ou modelos grosseiros, que são então refinados iterativamente para produzir uma ou mais estruturas de alta resolução. Após a reconstrução, são realizados refinamentos estruturais para melhorar ainda mais a qualidade e a resolução do mapa crio-EM. Finalmente, ou um modelo atômico é diretamente derivado do mapa, ou o mapa é equipado com coordenadas atômicas obtidas em outros lugares.

Diferentes pacotes de software estão disponíveis para realizar as tarefas descritas acima, incluindo Appion5, cisTEM6, crioSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, entre outros. Embora esses programas sigam etapas semelhantes de processamento, eles empregam diferentes algoritmos, por exemplo, para colher partículas, gerar modelos iniciais e refinar reconstruções. Além disso, esses programas exigem um nível variado de conhecimento e intervenção do usuário para operar, pois alguns dependem do ajuste fino de parâmetros que podem atuar como um obstáculo para novos usuários. Essas discrepâncias geralmente resultam em mapas com qualidade e resolução inconsistentes em todas as plataformas14, levando muitos pesquisadores a usar vários pacotes de software para refinar e validar resultados. Neste artigo, destacamos o uso de crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma reconstrução 3D de alta resolução do AAV, um vetor amplamente utilizado para terapia genética15. Os pacotes de software acima mencionados são gratuitos para usuários acadêmicos; crioSPARC v3 e Scipion 3 exigem licenças.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Criação de um novo projeto crioSPARC v3 e importação de dados

NOTA: Os dados foram adquiridos na Oregon Health and Science University (OHSU) em Portland usando um microscópio eletrônico Titan Krios de 300 kV equipado com um detector de elétrons direto Falcon 3. As imagens foram coletadas em um modo de contagem com uma dose total de 28,38 e−/Å2 fracionados em 129 quadros, e uma faixa de desfocus de -0,5 μm a -2,5 μm, a um tamanho de pixel de 1.045 Å usando EPU. A amostra de AAV-DJ foi fornecida pela equipe da OHSU.

  1. Abra o crioSPARC v3 em um navegador da Web e clique no cabeçalho Projetos . Selecione + Adicionar para criar um novo projeto. Título do projeto de acordo e forneça um caminho para um diretório existente onde empregos e dados serão salvos.
  2. Crie um espaço de trabalho para o projeto abrindo o projeto, clicando em + Adicionar e selecionando o Novo Espaço de Trabalho. Título do espaço de trabalho e clique em Criar.
  3. Navegue até o novo espaço de trabalho e abra o Job Builder no painel direito. Esta guia exibe todas as funções disponíveis no crioSPARC v3. Clique em Importar Filmes e forneça o caminho dos filmes, ganhe o caminho do arquivo de referência e defina parâmetros de aquisição da seguinte forma: Tamanho do Pixel Bruto 1.045 Å, Acelerando tensão de 300 kV, Aberração Esférica 2,7 mm, Dose de Exposição Total 28.38 e-/Å^2.
  4. Clique em Fila, selecione uma faixa para executar o trabalho e um espaço de trabalho e clique em Criar.
    NOTA: Os parâmetros de aquisição são dependentes de amostra e microscópio.

2. CryoSPARC v3 - alinhamento de filme e estimativa de CTF

  1. Abra a correção de movimento de patch (Multi). Este trabalho requer os filmes importados na etapa 1.3 como entrada. Abra a carteira de trabalho de filmes de importação no espaço de trabalho e arraste a saída Imported_movies para o espaço reservado para filmes no novo trabalho. Faça fila no trabalho.
    NOTA: Para obter mais informações sobre os métodos crioSPARC descritos neste artigo, consulte o tutorial crioSPARC16.
  2. Para realizar a estimativa do CTF, abra a Estimativa de Patch CTF (Multi). Insira os micrografos gerados na etapa 2.1 e enfilira o trabalho.
  3. Para inspecionar os micrografos médios e corrigidos por CTF e selecionar um subconjunto para posterior processamento, abra as Exposições de Cura e insira as exposições obtidas na etapa 2.2. Faça fila no trabalho.
  4. Após a entrada do trabalho , clique na guia Interação na carteira de trabalho, ajuste os limites dos parâmetros e aceite ou rejeite micrografos individuais para posterior processamento. Aceite micrografias com CTFs estimados e experimentais bem combinados (Figura 2) e descarte aqueles com alta astigmatismo, ajuste ctf pobre e gelo espesso.
  5. Durante o processamento dos dados atuais, defina o limiar superior do Astigmatismo para 400 Å, a resolução de ajuste ctf para 5 Å e a espessura relativa do gelo para 2. Clique em Feito para selecionar os micrografos para processamento a jusante.

3. CryoSPARC v3 - coleta manual e de partículas baseada em modelos

  1. Abra o Escolhido Manual, insira as exposições aceitas das etapas 2.4-2.5 e faça fila no trabalho. Clique na guia Interativo , defina o Tamanho da Caixa (px) para 300 e clique em algumas centenas de partículas em vários micrografos e evite selecionar partículas sobrepostas. Aqui, foram selecionadas 340 partículas em 29 micrografos. Quando terminar, clique em "Done Picking"! Extrair partículas.
    NOTA: Este protocolo usa a coleta manual de partículas para gerar modelos para seleção automática. No entanto, outros métodos também estão disponíveis17.
  2. Para gerar modelos para a colheita automatizada de partículas, clique em Classificação 2D e insira as picaretas de partículas geradas na etapa 3.1. Alterar o número de Classes 2D para 10 e Fazer fila no trabalho.
  3. Abra as classes 2D da Select. Insira as partículas e as médias de classe obtidas na etapa 3.2 e clique na guia Interativo . Selecione classes 2D representativas com bom SNR e clique em Feito.
    NOTA: As médias das classes refletem diferentes pontos de vista de partículas. Selecione as médias de classe que refletem cada exibição. O objetivo é produzir modelos bem definidos representando diferentes pontos de vista do espécime para a colheita automatizada.
  4. Escolha de modelo aberto e insira as classes 2D selecionadas na etapa 3.3 e micrografos das etapas 2.4-2.5. Defina o diâmetro da partícula (Å) para 220 Å e faça fila no trabalho.
  5. Para inspecionar as picaretas automatizadas, abra Select Particle Picks, insira as partículas e micrografias geradas na etapa 3.4 e faça fila no trabalho.
  6. No cartão de trabalho Select Particle Picks, clique na guia Interativo e defina o tamanho da caixa (px) para 300. Clique em um micrografo individual, ajuste o filtro lowpass até que as partículas estejam claramente visíveis e defina o Limiar de Correlação Cruzada Normalizada (NCC) para 0,41 e limiar de energia entre 54000 e 227300 .
  7. Inspecione vários micrografos e, se necessário, ajuste limiares de modo que a maioria das partículas sejam selecionadas sem incluir falsos positivos. Quando terminar, clique em ""Escolha"! Extrair partículas.
    NOTA: Partículas verdadeiras normalmente têm um NCC alto e escore de energia, indicando que são semelhantes ao modelo e têm um SNR alto, respectivamente.
  8. Abra o extrato de Micrografias e insira os micrografos e partículas da etapa 3.7. Defina o tamanho da caixa extrativída (px) para 300 e faça fila no trabalho.

4. CryoSPARC v3 - Classificação 2D

  1. Clique na Classificação 2D e insira as partículas extraídas da etapa 3.8. Defina o número de classes 2D para 50 e faça fila no trabalho.
  2. Para selecionar as melhores classes 2D para processamento posterior, abra selecionar classes 2D. Insira as partículas e as médias de classe obtidas na etapa 4.1. Clique na guia Interativo e escolha classes 2D com base na resolução e no número de partículas da classe (Figura 3). Não selecione as classes que contenham artefatos. Após a seleção, clique em Feito.
    NOTA: Normalmente, várias rodadas de classificação 2D são necessárias para remover partículas, que não convergem para classes distintas e bem definidas. Execute quantas rodadas de classificação 2D são necessárias para remover tais partículas do conjunto de dados (Figura 3).

5. CryoSPARC v3 - reconstrução ab-initio e refinamento homogêneo

  1. Para gerar um volume 3D inicial, abra a Reconstrução Ab-initio e insira as partículas obtidas na etapa 4.2 ou na classificação 2D final. Ajuste a simetria ao icosaedral. Faça fila no trabalho.
    NOTA: A simetria é dependente da amostra e deve ser alterada em conformidade. Se não for desconhecido, use simetria C1.
  2. Abra refinamento homogêneo. Insira o volume da etapa 5.1 e partículas a partir de 4,2 ou a classificação 2D final. Mude a simetria e enfie o trabalho. Quando o trabalho estiver concluído, inspecione a curva Fourier Shell Correlation (FSC) e baixe o volume para examinar na UCSF Quimera18.

6. Exportar coordenadas de partículas a partir de crioSPARC v3 e importá-las para RELION-3 usando PyEM

NOTA: As coordenadas de partículas carregam informações sobre a localização de partículas individuais em cada micrografo. A transferência de coordenadas em vez de pilhas de partículas para RELION-3 permite executar etapas de refinamento que de outra forma não estariam disponíveis. Por exemplo, o polimento de partículas requer acesso aos quadros iniciais do filme. Assim, antes de exportar coordenadas de partículas de crioSPARC v3 para RELION-3, importe filmes e realize a correção de movimento e estimativa de CTF em RELION-3. Consulte o tutorial RELION-319 para obter detalhes.

  1. Navegue até o diretório do projeto RELION-3 e inicie o RELION-3.
  2. Abra a importação do navegador tipo trabalho e especifique o caminho para os filmes e parâmetros de aquisição como na etapa 1.3.
  3. Para realizar a correção de movimento, use o UCSF MotionCor220 através da GUI RELION-3, abra a Correção de Movimento e defina os parâmetros padrão como no manual UCSF MotionCor221. Insira o caminho para os filmes importados na etapa 6.2. Na guia Moção, especifique o caminho para o motioncor2 executável.
    NOTA: O MotionCor2 pode ser executado em paralelo usando várias GPUs.
  4. Realize a estimativa ctf usando CTFFIND-4.122 através da GUI RELION-3. Abra a estimativa ctf e insira os micrografos.star gerados na etapa 6.3. Na guia CTFFIND-4.1, especifique o caminho para CTFFIND-4.1 executável e defina parâmetros como no tutorial RELION-3.119.
  5. Para importar pilhas de partículas do cryoSPARC v3 para o RELION-3, primeiro devem ser exportadas do crioSPARC v3. No crioSPARC v3, abra a carteira de trabalho da classe Select 2D a partir da etapa 4.2 ou a classificação 2D final. Na guia Detalhes , clique em Export Job. O trabalho de exportação produz o arquivo particles_exported.cs.
  6. Antes de importar coordenadas de partículas do crioSPARC v3 para o RELION-3, o arquivo particles_exported.cs da etapa 6.5 deve ser convertido para formato .star. Usando o PyEM23, converta o arquivo particles_exported.cs para o formato .star executando o seguinte comando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. No RELION-3, clique na guia Escolha manual e na guia I/O , insira os micrografos do refinamento CTF descritos na etapa 6.4. Na guia Exibir , insira os seguintes parâmetros: Diâmetro das partículas (A): 220, Filtro Lowpass (A): -1 , Escala para imagem CTF: 0,5. Corra o trabalho. Um diretório chamado ManualPick é gerado na pasta doméstica RELION-3.
    NOTA: Esta etapa é realizada para criar uma estrutura manual de pasta de colheita no RELION-3. Durante a execução da coleta manual, um único arquivo .star contendo coordenadas de partículas colhidas é criado para cada micrografo médio usado para colher na GUI RELION-3.
  8. Navegue até a pasta contendo o arquivo particles_exported.star da etapa 6.6 e execute um script escrito em casa produzindo um único arquivo manualpick.star para cada micrografo mediano usado para a colheita de partículas crio-SPARC v3, o que contribuiu para a classificação 2D final exportada na etapa 6.5. Os arquivos de coordenadas resultantes são salvos na pasta ManualPick/Movies.
  9. Retorne ao RELION-3 e reasse o trabalho de Escolha Manual . Clique em Continuar. Isso exibirá partículas previamente colhidas no crioSPARC v3 na GUI RELION-3. Inspecione alguns micrografos para verificar se a transferência de coordenadas de partículas foi realizada e se as partículas estão devidamente selecionadas.

7. RELION-3 - Extração de partículas e classificação 2D

  1. Clique em Extração de Partículas. Na guia I/O , insira os micrografos corrigidos pelo CTF a partir da etapa 6.4 e coordenadas da etapa 6.9. Clique na guia Extrato e altere o Tamanho da Caixa de Partículas (pix) para 300. Corra o trabalho.
  2. Realize a classificação 2D para limpar ainda mais o conjunto de partículas gerado no crioSPARC v3 para obter uma reconstrução de maior resolução. Clique na Classificação 2D e na guia I/O , insira o arquivo particles.star gerado na etapa 7.1. Na guia Otimização , defina o número de classes para 50 e o diâmetro da máscara (A) para 280. Corra o trabalho.
    NOTA: A máscara deve abranger toda a partícula.
  3. Para escolher as melhores classes 2D, clique no método Subset Selection , insira o arquivo _model.star a partir da etapa 7.2 e execute o trabalho. Selecione as classes descritas na etapa 4.2.
  4. Repita as etapas 7.2 e 7.3 para remover partículas não convergentes.

8. RECORÊ-3 - Refinamento 3D, criação de máscaras e pós-processamento

  1. Use o mapa gerado no crioSPARC v3 (etapa 5.2) como modelo inicial para refinamento 3D no RELION-3. Selecione o método De importação e defina os seguintes parâmetros na guia I/O : Importe filmes brutos/micrografos: Não, Arquivos de Entrada Bruta: Filmes/*.mrc.
  2. Forneça o arquivo MTF e insira os parâmetros de aquisição do filme conforme descrito na etapa 1.3. Na guia Outros , selecione o mapa cryoSPARC v3 como o arquivo de entrada, altere o Tipo de nó para referência 3D (.mrc) e execute o trabalho.
  3. Selecione 3D Auto-Refine e na guia I/O , defina Imagens de Entrada como o arquivo particles.star da etapa 7.3 ou do último trabalho de seleção. Dê a reconstrução crioSPARC v3 como mapa de referência. Clique na guia Referência e altere o filtro inicial low-pass (Å) para 50 e Simetria para icosaedral. Na guia Otimização , altere o diâmetro da máscara (Å) para 280 e execute o trabalho.
  4. Após o término da corrida, abra run_class001.mrc na UCSF Quimera.
  5. Na Quimera UCSF, clique em Ferramentas e em Dados de Volume, selecione Visualizador de volume. Isso abrirá uma nova janela para ajustar as configurações de volume. Altere o Passo para 1 e ajuste o controle deslizante até atingir o valor de nível onde o mapa não tem ruído. Registo este valor, pois ele será usado para a criação de máscaras na próxima etapa.
  6. O mapa produzido a partir do refinamento automático não reflete o verdadeiro FSC, pois o ruído do solvente circundante reduz a resolução. Antes do pós-processamento, crie uma máscara para distinguir o espécime da região do solvente.
    1. Clique em Criação de máscaras e entrada run_class001.mrc a partir da etapa 8.3.
    2. Clique na aba Máscara e ajuste os parâmetros da seguinte forma: Lowpass Filter Map (Å): 10, Pixel Size (Å): 1.045, Limiar inicial de binarização: o valor de nível obtido na etapa 8.5, Estender Mapa Binário estes muitos Pixels: 3, e Adicionar uma Borda Macia destes muitos Pixel: 3. Executar o trabalho.
  7. Examine a máscara na Quimera ucsf. Se a máscara estiver muito apertada, aumente o Mapa Binário de Extensão com muitos Pixel e/ou Adicione uma borda macia desses muitos Pixels. É importante criar uma máscara com bordas macias, pois uma máscara afiada pode levar a um ajuste excessivo.
  8. Clique em Pós-Processamento e na guia I/O, insira os meio-mapas criados na etapa 8.3 e mascara a partir de 8.6. Ajuste o Tamanho do Pixel Calibrado para 1.045 Å. Na guia Nitidez, insira o seguinte: Estimar o fator B automaticamente?: Sim, Menor Resolução para Ajuste Auto-B (A): 10, Use seu próprio fator B?: Não. Na guia Filtro, defina Pular Fsc-Weighting?

9. RELION-3 - Treinamento de polimento e polimento de partículas

  1. Antes de corrigir o movimento induzido pelo feixe de partículas por peça, primeiro use o modo de treinamento para identificar as faixas de movimento ideais para o conjunto de dados. Abra o polimento bayesiano e na guia I/O , insira os micrografos corrigidos por movimento a partir da etapa 6.3, partículas da etapa 8.3 e arquivo pós-processo .star da etapa 8.8. Clique na guia Treinamento e defina os seguintes parâmetros: Treine parâmetros ideais: Sim, Fração de Pixels Fourier para testes: 0.5, Use estas muitas Partículas: 5000. Corra o trabalho.
    NOTA: Este script produzirá opt_params_all_groups.txt arquivo na pasta polonesa RELION-3 contendo parâmetros de polimento otimizados necessários para executar a seguinte etapa.
  2. Uma vez terminado o trabalho de treinamento, clique no polimento bayesiano. Clique na guia Treinamento e defina Parâmetros Ótimos do Trem? Selecione a guia Polonesa e no Arquivo parâmetro otimizado e especifique o caminho para o arquivo opt_params_all_groups.txt da etapa 9.1. Clique em Executar.
  3. Repita o refinamento 3D (etapa 8.3) e pós-processamento (etapa 8.8) com um conjunto de partículas polidas.

10. RELION-3 - Refinamentos CTF e perpeculação

  1. Para estimar aberrações de ordem mais alta, abra o Refinamento CTF e, na guia I/O em Partículas, selecione o caminho para o arquivo .star contendo partículas polidas do recente trabalho 3D do Refine (run_data.star).
    1. Em PostprocessAr Star File, defina o caminho para a saída do trabalho pós-processamento mais recente (etapa 9.3).
    2. Selecione a guia Fit e defina os seguintes parâmetros: Estimativa (Ampliação Anisotropic): Não, Realize o Encaixe do Parâmetro CTF? Não, estimativa de feixe: Sim, também estimar Trefoil? Sim, estimar abberações de 4ª Ordem? Sim. Corra o trabalho.
  2. Repita o passo 10.1 usando como partículas de entrada (do Refine3D) geradas no trabalho anterior (particles_ctf_refine.star). Na guia Fit , altere Estimativa (Ampliação Anisotrópico) para Sim e Execute o trabalho.
  3. Repita o passo 10.2 usando como partículas de entrada (do Refine3D) produzidas no trabalho anterior (particles_ctf_refine.star). Na guia Fit , defina os seguintes parâmetros: Estimativa (Ampliação Anisotropic): Não, Realize o Encaixe do Parâmetro CTF?: Sim, Fit Defocus?: Partícula per-partícula, Fit Astigmatismo? Por micrografo, Fator B de ajuste?: Não, Ajuste de Fase-Shift: Não, Estimativa de Feixe?: Não, Estimar Aberrações de 4ª Ordem?: Não. Executá-lo .
    NOTA: Dado que a partícula tem contraste suficiente, a guia Fit Astigmatism? pode ser definida como Per-partícula. Para este conjunto de dados, o refinamento de astigmatismo per partícula não melhorou a qualidade e a resolução do mapa.
  4. Repita o refinamento 3D com as partículas da etapa 10.3 e na guia I/O, defina FSCs achatados por solventes? Quando terminar de executar, execute um trabalho pós-processamento (etapa 8.8) e examine o mapa na Quimera UCSF (passo 5.2).

11. Transferir coordenadas de partículas RELION-3 e mapa 3D para Scipion 3

  1. Para refinar e validar ainda mais o mapa RELION-3, primeiro importe o volume e as partículas do último trabalho pós-processamento (etapa 10.4) para OCipion 3. Inicie o Scipion 3 e crie um novo projeto.
  2. No painel Protocolos esquerdos , selecione a queda das importações e clique em Partículas de Importação. Alterar os seguintes parâmetros: Importação de: RELION-3, Arquivo Estelar: postprocess.star e especificar parâmetros de aquisição como na etapa 1.3. Clique em Executar.
  3. Clique na lista de importações e selecione Volumes de Importação. Sob importação de dar o caminho para o mapa RELION-3. Alterar o tamanho do pixel (taxa de amostragem) Å/px para 1.045 e Executar.

12. Scipion 3 - Refinamento de alta resolução

  1. Primeiro, realize um alinhamento global. Selecione a lista desistência do Refine no painel Protocolos e clique em Xmipp3 - highres24. Insira as partículas e volumes importados das etapas 11.2 e 11.3 como Imagens em Tamanho Real e Volumes Iniciais, respectivamente e defina o Grupo Simetria como icosaedral. Na guia Alinhamento de imagem em Atribuição Angular, escolha Global e defina a Resolução de Alvo Máxima para 3 Å e execute o trabalho.
  2. Quando o trabalho estiver concluído, clique em Analisar resultados. Na nova janela, clique no ícone UCSF Quimera para examinar o volume refinado. Além disso, clique em 'Gráficos de Resolução de exibição'(FSC) para ver como o FSC mudou após o refinamento, bem como plote histograma com alterações angulares para ver se as atribuições de ângulo de Euler foram alteradas.
    NOTA: Dependendo da resolução da estrutura relion-3 de entrada, esta etapa pode ser repetida várias vezes com valores diferentes definidos para a Resolução de Alvos Máximos na guia Atribuição Angular . Para obter mais informações, consulte o tutorial Scipion25.
  3. Repita o passo 12.1 com um alinhamento local. Copie o trabalho anterior e altere Select Previous Run para Xmipp3 - highres Global. Na guia Atribuição angular , altere o alinhamento da imagem para local. Defina a Resolução máxima de metas para 2.1 Å.
  4. Examine o mapa refinado na Quimera UCSF e analise a mudança no FSC e atribuições angulares (etapa 12.2). Repita o refinamento local até que a resolução não melhore e as atribuições angulares tenham convergido, ajustando a Resolução de Alvos Máximas conforme necessário.
  5. O mapa de saída do Scipion 3 pode ser modificado e aguçado em Phenix26.

13. Scipion 3 - Validação do mapa

  1. Examine a resolução local do mapa final gerado em Xmipp3 - highres. Abra Xmipp - MonoRes27 local e insira o volume final do trabalho anterior e máscara gerada na etapa 8.6. Definir faixa de resolução de 1 a 6 Å com intervalo de 0,1 Å e Executar o trabalho.
  2. Quando terminar de executar, clique em Analisar resultados e examine a resolução de histogramas e fatias de volume coloridas por resolução.
  3. Para ver se as partículas estão bem alinhadas, abra a Capacidade de Alinhamento multirreferencial28 e insira as partículas e o volume da etapa 12.3. Clique em Analisar resultados para exibir o plot de validação. Idealmente, todos os pontos devem ser agrupados em torno de (1,0,1,0).
  4. Abra Xmipp3 - Valide o Overfitting. Insira as partículas e volumes da etapa 12.3. Quando terminar de rodar, analise os resultados e inspecione o gráfico de overfiting. A travessia do ruído gaussiano alinhado e das curvas de partículas alinhadas indica o excesso de adaptação.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um pipeline SPA abrangente para obter uma estrutura de alta resolução usando três plataformas de processamento diferentes: crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. As figuras 1 e figura 4 resumem o fluxo de trabalho geral de processamento e a Tabela 1 detalha os protocolos de refinamento. Estes protocolos foram usados durante refinamentos de uma estrutura de 2,3 Å de AAV, alcançando perto da resolução nyquist.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste artigo, apresentamos um fluxo de trabalho ROBUSTO spa para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software para alcançar reconstruções 3D de alta resolução (Figura 1). Este fluxo de trabalho é aplicável a uma grande variedade de macromoléculas biológicas. As etapas subsequentes do protocolo estão descritas na Figura 4, incluindo pré-processamento de filmes, coleta e classificação de partículas e múltiplos métodos para refinamentos de estru...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Carlos Oscar Sorzano pela ajuda na instalação do Scipion3 e kilian Schnelle e Arne Moeller por ajuda na transferência de dados entre diferentes plataformas de processamento. Parte desta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U24GM129547 e realizada na PNCC da OHSU e acessada através da EMSL (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental. Este estudo foi apoiado por uma bolsa inicial da Universidade Rutgers para Arek Kulczyk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotecnologia Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical Schoolhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2UCSF Macromolecular Structure Grouphttps://msg.ucsf.edu/software
PhenixComputational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)http://www.phenix-online.org/
Universidade PyEMda Califórnia, São Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
Laboratório de Biologia EstruturalRELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing, Visualização e Informáticahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
MRC Centro de Processamento de Imagens

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194(2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMCryoSPARC WorkflowRELION ProcessingScipion Integration3D ReconstructionMotion CorrectionCTF EstimationParticle Picking2D ClassificationAdeno Associated Virus

Related Articles