Summary
En protokoll som skisserer dannelsen av menneskelige blastoider som effektivt, rettidig og sekvensielt genererer blastocyst-lignende celler.
Abstract
En modell av den menneskelige blastocysten dannet av stamceller (blastoid) ville støtte vitenskapelige og medisinske fremskritt. Imidlertid vil dens prediktive kraft avhenge av dens evne til effektivt, rettidig og trofast å rekapitulere sekvensene av blastocystutvikling (morfogenese, spesifikasjon, mønster) og å danne celler som reflekterer blastocyststadiet. Her viser vi at naive menneskelige pluripotente stamceller dyrket under PXGL-forhold og deretter triply hemmet for, transformerer vekstfaktor- β, og ekstracellulære signalregulerte kinaseveier gjennomgår effektivt morfogenese for å danne blastoider (>70%). Matchende med utviklingsmessig timing (~ 4 dager), ruller blastoider ut blastocyst-sekvensen av spesifikasjon ved å produsere analoger av trofoblaster og epiblastomer, etterfulgt av dannelsen av analoger av det primitive endodermet og de polare trofoblaster. Dette resulterer i dannelse av celler transkripsjonelt lik blastocyst (>96%) og et mindretall av post-implantasjon analoger. Blastoider effektivt mønster ved å danne embryonal-abembryonic aksen preget av modning av polarregionen (NR2F2+), som får det spesifikke potensialet til retningsbestemt feste til hormonell stimulert endometrial celler, som i utero. En slik menneskelig blastoid er en skalerbar, allsidig og etisk modell for å studere menneskelig utvikling og implantasjon in vitro.
Introduction
Mangel på eksperimentelle modeller har begrenset forståelsen av tidlig human embryogenese. Dagens kunnskap om menneskespesifikke aspekter ved embryonal utvikling er avledet fra overskudd in vitro befruktning (IVF) embryoer donert til forskning. Imidlertid hindrer den begrensede tilgjengeligheten, vanskelighetene med eksperimentelle manipulasjoner og variabel kvalitet på embryoene vitenskapelige undersøkelser. Tvert imot ville en trofast in vitro-modell av menneskelige embryoer tillate komplekse eksperimentelle manipulasjoner, og dermed gi en etisk mulighet til å utfylle forskningen på menneskelige embryoer 1,2,3,4. En tidligere utviklet modell av mus blastocysts kombinert mus embryonale stamceller og trophoblast stamceller5. I denne detaljerte protokollen beskrives en metode for å generere en modell av den menneskelige blastocysten fra naive pluripotente stamceller som er trofaste mot elementære blastocystkriterier6.
Fire kriterier for menneskelige blastoider. Her, i et forsøk på å etablere en standardisert definisjon av menneskelige blastoider, foreslår vi fire minimale kriterier. Selv om de ikke er uttømmende, kan disse kriteriene tjene som grunnlag for å evaluere parametrene som tillater dannelse av menneskelige blastoider (figur 1A). (1) Blastoider bør dannes effektivt når det gjelder morfologi og generering av analogene til de tre slektene nemlig epiblass (Epi), trophectoderm (TE) og primitive endoderm (PrE). Ineffektivitet vil sannsynligvis peke på en utilstrekkelig innledende celletilstand eller / og kulturtilstand (f.eks. blastoidmedium). (2) Blastoider bør generere analoger av de tre avstamninger i henhold til utviklingssekvensen (Epi / TE først, PrE / polarTE sist) 7,8 og timing (induksjon ~ 3 dager; embryonale dager 5-7)7,9. (3) Blastoider skal danne analoger av blastocyststadiet, men ikke av postimplantasjonsstadier (f.eks. epiblastomer etter implantasjon, trophoblast eller amnionceller). (4) Til slutt bør blastoider være i stand til å recapitulatere funksjonelle egenskaper ved blastocystimplantasjon og utvikling. Ved hjelp av denne protokollen dannes menneskelige blastoider effektivt ved hjelp av flere cellelinjer (>70%), er i stand til å generere blastocyst cellulære analoger sekvensielt og innen 4 dager, og analogene er transkripsjonelt lik blastocyststadiet (>96% basert på flere analyser)6,10,11. Til slutt genererer blastoider robust den embryonale abembryoniske aksen, noe som gjør at de kan samhandle med hormonelt stimulerte endometrieceller gjennom polarområdet, og robust utvide avstamninger ved utvidet kultur (tidsekvivalent: embryonal dag 13).
Betydningen av den opprinnelige celletilstanden. Humane pluripotente stamceller (hPSCer) kan stabiliseres i forskjellige tilstander som forsøker å fange presise utviklingsstadier. Disse tilstandene opprettholdes av kulturforhold som, selv om de fortsatt er suboptimale, begrenser celler i en preimplantasjon- (~ embryonale dager 5-7) eller postimplantasjonslignende (~ embryonale dager 8-14) epiblasttrinn12. Transkripsjonsanalyse viste at hPSCer dyrket i PD0325901, XAV939, Gö6983 og leukemihemmerfaktor (LIF; PXGL naive hPSCer)13,14 er mer lik blastocyst epiblast sammenlignet med hPSCer dyrket i fibroblast vekstfaktor (FGF) 2 og aktivin15 (betegnet primed hPSCs12) og til humane utvidede pluripotente stamceller (hEPSCs)16 (se analyse i referanser17, 18,19). Følgelig passer transkripsjonen av primede hPSCer best med en postimplantasjon / pre-gastrulation cynomolgus ape epiblast20. Ytterligere molekylære kriterier, som transposonuttrykk, DNA-metylering og X-kromosomtilstand, bekreftet at variasjoner av den naive tilstanden ligner mer på blastocyst-epiblasteret sammenlignet med den primede tilstanden 17,21. Til slutt har linjer med naive hPSCer blitt vellykket avledet direkte fra blastocysts ved hjelp av PXGL kulturforhold22.
Menneskelige tidlige blastocystceller er ennå ikke begått. Murine avstamningsspesifikasjon skjer fra morulastadiet som går forut for blastocysttrinnet23. Tvert imot har dissosiasjons- og reaggregeringsforsøk vist at de menneskelige trophectoderm-cellene til tidlige blastocytter ennå ikke er begått24. Følgelig har analyse av cellene i menneskelige blastocyster ved encellet RNA-sekvensering (scRNAseq) vist at den første avstamningsspesifikasjonen (trophoblast / epiblast) oppstår etter dannelsen av blastocysthulen7. Denne utsatte menneskelige spesifikasjonen korrelerer med observasjoner om at hPSCer er potente for å danne trophoblasts 25,26,27 når musen PSCs er i stor grad forpliktet til epiblast avstamning. Disse kombinerte observasjonene førte til muligheten for at naive hPSCer reflekterer et blastocyst stadium og beholder potensialet til å danne de tre blastocyst-avstamningene. I det siste har styrken til hPSCer for å spesifisere ekstraembryoniske analoger blitt foreslått å skifte fra trophectoderm til amnion under progresjon fra naiv til primet tilstand27. Dermed er naive hPSCer mer lik preimplantasjonstrinnet 17,18,21 og har en forbedret kapasitet til å danne trofoblaster sammenlignet med primede hPSCer27, hEPSC16 eller mellomliggende omprogrammerte tilstander28, som er tilbøyelige til å danne postimplantasjonsanaloger 10 (figur 1B ). Den opprinnelige celletilstanden er dermed avgjørende for å danne de riktige ekstraembryoniske analogene. Selv om en grundig side-ved-side analyse av konverterte trophectoderm analoger gjenstår å gjøre, en PXGL naiv tilstand som reflekterer tidlig blastocyst synes viktig å danne high-fidelity blastoids.
Tilskyndende spesifikasjon og morfogenese ved å signalisere veier hemming. Hemmingen av Hippo-signalveien er en bevart mekanisme som driver trophoblastspesifikasjon hos mus, kyr og mennesker 9,29,30. Også siden 2013 er det kjent at hemmingen av NODAL (A83-01) og den ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK; PD0325901 eller tilsvarende) og aktiveringen av signalveiene for benmorfogenetisk protein (BMP) utløser primede hPSCer for å aktivere transkripsjonsnettverket forbundet med trophoblast-linjen 25,31,32,33,34. Videre bekreftet flere rapporter nylig også at hemming av både NODAL og ERK-bane og aktivering av BMP letter trofolastdifferensiering fra naive hPSCer 25,31,32,33,34. Til slutt, hvis trophoblast spesifikasjon utløses fra en naiv tilstand, celler rekapitulere aspekter av utviklingsprogresjonen av trophectoderm26. Imidlertid har selvfornyende linjer som reflekterer blastocyst trophectoderm ikke blitt stabilisert in vitro. Etter trophoblast spesifikasjon, induksjon av epidermal vekstfaktor (EGF) og Wnt signalveier sammen med HDAC hemming kan lette trophoblast utviklingsprogresjon34,35 og stabilisere celler i linjer av humane trophoblast stamceller (hTSCs) reflektere post-implantasjon cytotrophoblasts18,35. Slike linjer kan avledes både fra blastocysts og placental vev35.
Den andre ekstraembryoniske slektslinjen, kalt PrE, er spesifisert etter trofoblaster og stammer fra epiblast 7,9. I motsetning til murine PrE36, antas den menneskelige motparten å være uavhengig av FGF som signaliserer 37,38. Linjer som reflekterer den ekstraembryoniske endodermen (kalt nEnd) ble etablert fra naive hPSCer ved induksjon av signalveier ved hjelp av aktivin A, Wnt og LIF39. Ikke i samsvar med embryoinhiberingsforsøk, har ERK-hemming vist seg å forhindre dannelse av slike nEND-celler in vitro39. Inntil nå har slike linjer ikke blitt avledet direkte fra blastocysts.
I det siste har modeller av det tidlige embryoet blitt dannet ved å kombinere variasjoner av media som tidligere er utviklet for hTSCs35 og nEND-celler39 og dermed ved hjelp av aktivatorer av den transformerende vekstfaktoren- β (TGF-β), EGF og Wnt signalveier28,40. Disse embryomodellene dannes ved lav effektivitet (10%-20%) og danner celler som ligner på post- i stedet for preimplantasjonsstadium10, inkludert analoger av postimplantasjonsepilelast, trophoblast, amnion, gastrula, mesodermalt vev (~ embryonal dag 14) og cytotrophoblaster10. Tvert imot, en trippel hemming av Hippo, ERK og TGF-β veier effektivt styrer dannelsen av blastoider som består av blastocyst-lignende celler41. Sammen med den første celletilstanden foreslår vi at trippelveier hemming (Hippo, ERK, TGF-β) er den andre essensielle parameteren for å danne høy-troskap blastoider (figur 1B).
Evaluere celletilstanden og reflektert stadium ved hjelp av scRNAseq. Tilstandene til celler som komponerer blastoider kan evalueres gjennom scRNAseq-analyse. Deres transkripsjonelle likhet med spesifikke embryonale stadier kan måles ved hjelp av blastoidceller alene og sammenlignet med primede hPSCer eller hTSCer som gjenspeiler postimplantasjonsstadier20,35. Å utføre klyngeanalyser ved hjelp av ulike definisjonsnivåer avslører hvordan delbefolkninger gradvis smelter sammen når definisjonen reduseres, og dermed avslører klyngers likheter. Selv om optimalitet i antall klynger kan måles42, informerer høyoppløselig klynge også om eventuell tilstedeværelse av små unormale subpopulasjoner, for eksempel som reflekterer postimplantasjonsstadiene10. Genene som differensialt uttrykkes mellom klynger kan gi informasjon om sine analoger i utviklingsprosessen ved å vurdere uttrykksnivåene til referansegensett som definerer scenespesifikke avstamninger. Dette gjør det mulig å måle berikelsen av blastoide subpopulations enten gjennom uovervåkede avstandskart (f.eks. ved hjelp av toppberikede gener) eller ved gensettberikelsesanalyse (GSEA)43. Ved hjelp av denne blastoidprotokollen dannes bare tre hovedklynger som transkripsjonsmessig gjenspeiler de tre blastocyste avstamninger. En klynge inkluderer både de første naive hPSCene og epiblastanalogen til blastoidene. Analyse av celler på forskjellige tidspunkter viste den sekvensielle karakteren av avgrensningsspesifikasjon (trofoblaster begynner å spesifisere innen 24 timer, og primitive endodermceller innen 60 timer). En klynge med høy oppløsning fanget en subpopulasjon av celler (3,2%) som uttrykte gener som er spesifikke for gastrulation stadium embryoer (muligens mesoderm eller amnion). Vær oppmerksom på at de første naive hPSCene også besto av 5% av postimplantasjonslignende celler, som tidligere beskrevet44. I en annen analyse kan blastoidceller slås sammen i silico med referanseceller isolert fra concepti på forskjellige stadier 45,46,47 for å utlede stadium ekvivalens. Her ble celler isolert fra preimplantasjonskonsepti45,46, in vitrokulturerte blastocytter45, og gastrulation-stage embryoer47 brukt som referansepunkter. Ved hjelp av denne protokollen ble det kvantifisert at de ikke samsvarende blastoidcellene avslørt av høyoppløselig klynge faktisk klynge med postimplantasjon mesoderm og amnion. I fremtidige trinn bør transkripsjons benchmarking suppleres med analyse av transposonuttrykk, DNA-metylering og X-kromosomstatus som også gir landemerker av utviklingsstadier21.
Evaluering av aksedannelse og andre funksjoner i menneskelige blastoider. En moden blastocyst er preget av dannelsen av embryonal-abembryonisk akse som mønstrer trofoblaster for implantasjon. Ved hjelp av denne blastoidprotokollen dannes en akse robust eksemplifisert ved modning av de proksimale trofoblaster (f.eks. NR2F2+/CDX2-) som får kapasitet til å feste seg til endometriale organoidceller bare når de er hormonelt stimulert48,49. Sammenligning med trofosfærer som ikke danner epiblasten viser at disse indre cellene induserer tilstøtende trofoblaster for å modnes for å formidle det første vedlegget til endometriumet. Når det dyrkes i et utvidet kulturmedium designet for cynomolgus monkey blastocysts50, utvides alle tre avstamninger fra blastoiden konsekvent i seks ekstra dager (tidsekvivalent med dag 13), selv om organisasjonen deres ikke gjenspeiler det utviklingsstadiet.
Implikasjonen av høy effektivitet og high-fidelity menneskelige blastoider. Bevaring av utviklingsprinsipper som ble oppdaget i modellorganismer er iboende vanskelig å teste i det menneskelige konseptus på grunn av begrenset tilgang og til de tekniske vanskelighetene ved genetisk og fysisk manipulering av det. En høyeffektiv og høy-troskap blastoid modell ville tillate høy gjennomstrømning genetiske og narkotika skjermer, som er på grunnlag av vitenskapelige og biomedisinske funn. I tillegg vil inkorporering av komplekse genetiske modifikasjoner for å endre og registrere biologiske prosesser utfylle slike studier. Totalt sett foreslår vi at trippelinhibering (Hippo, TGF-β, ERK) av naive PXGL hPSCer er ledende for effektiv dannelse av high-fidelity menneskelige blastoider som overholder de fire minimale kriteriene. Den skalerbare og allsidige karakteren til denne protokollen gjør den egnet til å generere målrettede hypoteser som deretter kan valideres ved hjelp av menneskelige blastocytter. Som sådan vil menneskelige blastoider ikke erstatte bruken av menneskelig conceptus for in vitro-forskning , men kan fungere som en kraftig måte å trakte forskning gjennom tidligere utilgjengelige eksperimentelle tilnærminger i hjertet av den vitenskapelige og biomedisinske oppdagelsesprosessen. Protokollen viser hvordan man danner menneskelige blastoider og også hvordan man analyserer cellene som finnes i blastoiden.
Protocol
Retningslinjene for stamcelleforskning og klinisk oversettelse av International Society for Stem Cell Research (ISSCR) anbefaler at forskning på humane blastoider bare er tillatt etter gjennomgang og godkjenning gjennom en spesialisert vitenskapelig og etisk gjennomgangsprosess 3,4. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført ved å følge retningslinjene fra den menneskelige forskningsetiske komiteen for Institutt for molekylær bioteknologi ved Det østerrikske vitenskapsakademiet (IMBA) under godkjenning Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Overholdelse av disse retningslinjene er nødvendig for å publisere forskningsresultater i vitenskapelige tidsskrifter.
1. Kultur av menneskelig naiv embryonal stamcelle i PXGL-tilstand
MERK: Naive hPSCer kan fås fra relevante laboratorier. Linjer som ble brukt her ble hentet fra laboratoriene til Yasuhiro Takashima (for tiden ved CiRA, Kyoto, Japan) og Austin Smith (for tiden ved Living Systems Institute, Exeter, UK). Alternativt kan naive hPSCer tilbakestilles internt fra linjer med primede hPSCer som beskrevet tidligere13,14. Naive hPSCer ser stabile ut for flere passasjer (> 15), men kvaliteten på kulturen kan variere over tid. Hvis kvaliteten på naiv hPSC reduseres, tiner du et nytt hetteglass med celler eller genererer de novo naive hPSCer fra primede PSCer. For alle mediesammensetninger se Supplerende tabell 1.
- Fremstilling av bestrålet mus embryonal mater (MEFs) lag
- Dagen før passering av naive hPSCer, lag en 6-brønns cellekulturplate med bestrålede MEF-lag ved å følge trinnene beskrevet nedenfor.
- Belegge en 6-brønns cellekulturplate med 1 ml 0,1% gelatin i PBS per brønn. Inkuber platen ved 37 °C i 30 minutter. Fjern gelatinoppløsningen.
- Forbered MEF medium ved 37 °C.
- Tine MEF-er i et vannbad ved 37 °C til bare en liten isklump er igjen. Løs opp volumet av hetteglasset med 1 ml preparert MEF-medium ved hjelp av en P1000 pipette.
- Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Spinn ned suspensjonen ved 200 x g i 4 min. Aspirer supernatanten og resuspend MEF-pelletsen ved å tilsette friskt MEF-medium (tilstrekkelig for 1,5 ml per brønn).
- Tell cellene ved hjelp av celletellingslysbilder og tilsett 300 000 celler per brønn og overfør platen til en normoksyinkubator ved 37 °C.
MERK: Hvis MEFer løsner over tid, kan ferske MEFer legges til I PXGL-mediet under rutinemessig medieendring.
- Passivring av humane naive pluripotente stamceller
- Før du passerer hPSCer, sjekk deres morfologi under mikroskopet. Kolonier har vanligvis en kuppelformet morfologi med lyse, definerte grenser. Hvis de enkelte koloniene viser en flatere morfologi eller hvis differensierte kolonier begynner å dukke opp, følger du instruksjonene i trinn 1.2.8.
- Aspirer mediet og vask cellene med PBS en gang. Tilsett 500 μL celleavløsningsløsning per brønn av en 6-brønns plate.
- Inkuber cellene i 5 min ved 37 °C. Bruk en P1000 pipette og pipette cellene flere ganger for å dissosiere koloniene i enkeltceller.
- Samle cellene og overfør dem til et 15 ml rør som inneholder vaskebuffer (1 ml per brønn av en 6-brønns plate ). Snurr ned cellene ved 200 x g i 4 min.
- Aspirer supernatanten og resuspend pelletsen i friskt PXGL-medium (tilstrekkelig for 1,5 ml per brønn). Vurder et delingsforhold på 1:3-1:6 for rutinemessig passivring.
MERK: Etter hver 3-4 passasjer eller hvis kvaliteten på cellekulturen reduseres basert på cellemorfologien (f.eks. fremveksten av flate kolonier i befolkningen), legg til 10 μM Y-27632 og vekstfaktor kjellermembranekstrakt (5 μL / brønn) til mediet i løpet av de første 24 timer etter passivisering. - Før du repper hPSCene, klargjør platene med ferske MEFer ved å aspirere MEF-mediet og vaske cellene en gang med PBS. Bruk deretter en P1000 pipette til å overføre 1,5 ml hPSCs cellefjæring per brønn av en 6-brønns plate som inneholder MEF-ene.
MERK: Påse at pipettering fører til en homogen såing av cellene over brønnområdet. Dette vil sikre veksten av kolonier med homogene størrelser og relativ synkron av cellene. - Kultur hPSC under hypoksiske forhold ved 37 °C i et fuktig miljø. Etter 24 timer skal hPSCer festes. Et høyt antall ikke-tilhengerceller (eller flytende celler) gjenspeiler et problem med levedyktighet eller vedlegg ved passivisering.
- Bytt medium med 1,5 ml PXGL medium per brønn daglig. Passasje hPSCs hver 3-4 dager eller bruke dem til blastoid formasjon eksperimenter.
MERK: Etter tining av hPSCer, før du passerer dem i minst tre passasjer før du starter et blastoideksperiment.
2. Dannelse av blastoider
- Dannelse av naive PSC-aggregater
- Forbered og forvarm PXGL-mediet, N2B27 basale medier, vaskebuffer, PBS og aggregeringsmedier før du starter eksperimentet. Ekskluder MEFer fra hPSCs suspensjon for å danne blastoider ved å følge trinnene beskrevet nedenfor.
- For MEF-utelukkelse, lag en gelatinbelagt plate ved å tilsette 1 ml 0,1% gelatin i brønnen på en 6-brønns plate og inkubere ved 37 °C i 30-90 min.
- For å høste cellene, aspirer mediet og vask cellene med 1 ml PBS.
- Tilsett 500 μL celleavløsningsløsning (per brønn av en 6-brønns plate) og inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
- Kontroller cellene under mikroskopet for å følge dissosiasjonen av kolonier i enkeltceller (noen få multicellulære klumper kan dissosieres senere ved forsiktig pipettering).
- Fortynn celleavløsningsløsningen med 1 ml vaskebuffer. Samle cellene fra platen ved forsiktig pipettering 5 til 10 ganger. Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Snurr ned cellene ved 200 x g i 4 min.
- Aspirer supernatanten, resuspend cellene i 1,5 ml PXGL medium (per brønn av en 6-brønns plate) og frø cellene på gelatinbelagte plater for MEF-utelukkelse og inkubere ved 37 °C i 60-90 min.
- Når de naive cellene er sådd for MEF-utelukkelse, fjern PBS fra mikrowells og likevekt brønnene med 200 μL basal N2B27 medium (per 1 mikrowell chip) og inkuber i 60 min ved 37 °C.
- Samle supernatanten som inneholder de ikke-festet naive cellene, overfør den til et 15 ml rør, og spinn ned cellene på 200 x g i 4 minutter.
- Aspirer media og resuspend cellene i 1 ml N2B27 basale medier. Tell cellene ved hjelp av celletellingslysbilder. Snurr ned cellene ved 200 x g i 4 min.
- Aspirer mediet og legg til en passende mengde på 10 μM Y-27632 som finnes i N2B27-medier for å oppnå en celletetthet på 30 000 celler per 50 μL.
MERK: Optimalt første seedingcellenummer kan variere mellom de forskjellige cellelinjene. For eksempel, til frø 50-60 celler / mikrowell, blir 30.000 celler (inkludert overskudd med tanke på at noen celler faller utenfor mikrowell) frøet i 1 brønn på 96 brønnplater som inneholder 430 mikrowells. Et upassende startcellenummer kan resultere i den lille aggregerte formasjonen uten hulrom eller dannelse av kavitasjonsstruktur som når mer enn 250 μm. - Aspirer mediet fra likevektede mikrowellmatriser og tilsett 25 μL N2B27-medier med 10 μM Y-27632. Tilsett 50 μL celleoppheng og inkuber ved 37 °C i 15 minutter (til cellene faller ned i bunnen av mikrowellet). Tilsett deretter 125 μL N2B27 medium supplert med 10 μM Y-27632.
- Blastoid utvikling
- Innen 24 timer kan aggregater av naive hPSCer observeres (dag 0) på mikrowellbrikken. For å starte blastoiddannelse, forbered PALLY medium og følg trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Forvarm PALLY medium ved 37 °C i 30 minutter.
MERK: 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) og 10 μM Y-27632 må tilsetts like før bruk. Den optimale konsentrasjonen av LPA varierer mellom 0,5-5 μM. Dette må titreres for individuelle hPSC-linjer som brukes til blastoider. - Aspirer aggregasjonsmediet. Tilsett 200 μL forvarmet PALLY medium til mikrowells. Plasser cellekulturplaten tilbake i en hypoksisk inkubator ved 37 °C. Gjenta medieendringen på dag 1.
- På dag 2 fjerner du PALLY medium og tilsetter 200 μL N2B27 medium supplert med LPA og 10 μM Y-27632.
MERK: På dag 2 fortsetter de fleste aggregater å vokse. Noen aggregater danner imidlertid små hulrom. Kontinuerlig kultur blastoider i PALLY til dag 4 eller i in vitro kultur medium (IVC1) fra dag 2 og utover. Men etter denne medieendringen forbedrer dannelsen av PrE i modne blastoider. - Gjenta medieskiftet på dag 3. Fullstendig blastoiddannelse skjer etter dag 4.
MERK: Blastoider anses å ha utviklet seg fullt ut når de har gjennomgått fullstendig morfogenese basert på morfometri på dag 7 menneskelige blastocytter (f.eks. et diameterområde fra 150 -250 μm; en indre klynge omgitt av et epitel av trophectoderm-lignende celler) og har dannet polare trophectoderm-lignende celler (NR2F2 +/CDX2-) og PrE-lignende celler (GATA4+). Dette kan vurderes ved hjelp av immunfluorescensfarging eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
3. Dannelse av blastoider i 96-brønns ultralave festemikroplater
- Forbered naiv hPSCs celle suspensjon for blastoid formasjon ved å følge trinnene beskrevet ovenfor fra 2.1.1 - 2.1.11.
- Aspirer mediet og legg til en passende mengde N2B27-medier som inneholder 10 μM Y-27632 for å oppnå celletettheten til 70 celler per 100 μL av mediet.
MERK: Optimalt første seedingcellenummer kan variere mellom forskjellige cellelinjer. 70 celler/brønn kan for eksempel være det optimale cellenummeret for de fleste cellelinjer. - Sentrifuger platen ved 200 x g i 2 minutter ved romtemperatur til klyngeceller på bunnen av brønnene.
- Inkuber platen i en inkubator ved 37 °C under hypoksiske kulturforhold. Innen 24 timer kan det observeres aggregater av naive hPSCer (dag 0) på brønnene.
- Forbered 2x PALLY medium. Tilsett 100 μL forhåndsvarslet 2x PALLY medium til brønnene.
- Plasser cellekulturplaten tilbake i en hypoksisk inkubator ved 37 °C. Etter 24 timer aspirerer du halvparten av mediet (100 μL) og erstatter det med 100 μL forhåndsvarslet PALLY-medium. Gjenta trinnet til dag 4. Pass på at du ikke aspirerer aggregatene.
MERK: På dag 2 fortsetter de fleste aggregater å vokse. Noen aggregater har imidlertid små væskefylte hulrom. På dag 4 gjennomgår flertallet av de kaviterte strukturene fullstendig morfogenese for å danne blastocystlignende strukturer.
4. Dannelse av trofosfærer
- For trofosfæredannelse følger du blastoidformasjonsprotokollen fra trinn 2.1.1 (MEF-utelukkelse) til trinn 2.1.12 (siste trinn i såddprotokollen).
- Når aggregater av naive hPSCer har dannet seg etter 24 timer, bytt aggregasjonsmediet med PALY (uten LIF) supplert med 3 μM SC-144 for dannelsen av trofosfærer som representerer tidlig trofektoderm og PALLY supplert med 2 μM XMU-MP-1 for dannelse av trofosfærer som representerer moden trofooderm.
- Oppdater mediet daglig. Fullstendig trofosfæredannelse skjer etter dag 4.
5. Analyse av blastoidcelletilstanden og dens reflekterte stadium ved hjelp av scRNAseq
- For å plukke opp blastoider og utføre dissosiasjon, varm opp risting inkubatoren til 37 °C og sett den til 100 o/min.
- Samle blastoider fra den første 96-brønnsplaten og overfør dem til flere brønner på en U-bunn 96-brønnsplate ved hjelp av en munnpipet utstyrt med en glasskapillær.
MERK: Blastoider (> 70%) bør velges basert på morfometriske kriterier (størrelse = 150-250 μm med en unik indre klynge) for å unngå forurensning med ikke-blastoide strukturer (< 30%). - Vask én gang med 200 μL PBS ved hjelp av en P200 ved å se under et stereomikroskop. Overfør til en brønn som inneholder 50 μL kollagen og inkuber i 30 min i risting inkubatoren.
- Overfør blastoidene til en brønn med 100 μL 10x trypsin-EDTA og bland godt. Inkuber i 20 min i risting inkubatoren.
- Fjern blastoidene i encellede celler ved hjelp av P200 pipette. Overfør cellene til et 15 ml rør med FACS-buffer (1% FBS i PBS).
- For å fange spesifikke forhold mellom analogene til de tre avstamningsene, beise TE- og PrE-analogene med henholdsvis TROP2- og PDGFRa-antistoffer.
MERK: Antall PrE-celler i humane blastocytter er mindre sammenlignet med mus blastocysts, noe som kan gjenspeile utviklingsfeil av blastocysts dannet gjennom in vitro befruktning (IVF) eller en artforskjell. I blastoider er PrE-analogene mindre tallrike enn TE- og EPI-analogene og representerer 7,4% av cellene ved telling av GATA4+ celler ved immunfluorescensavbildning. Dissosiasjonsprosessen kan også indusere skjevheter i proporsjonene til de forskjellige celletypene som PrE-analoger for å representere 1%-2% av cellene ved blastoid dissosiasjon, PDGFRa-merking og FACS-analyse. - FACS-sorter celler fra alle tre avgrensningsanalogene til 384-plater som inneholder en lysisbuffer for smart-seq2-analyse. Utelat døde celler merket med DAPI-farging (utført i henhold til produsentens instruksjoner).
- Hvis du vil evaluere celletilstandene (celletype og utviklingsstadium), sammenligner du de transkripsjonsdataene fra blastoid med de riktige kontrollene.
6. Utvidet kultur for å vurdere blastoid utviklingsprogresjon
- Kultur menneskelige blastoider på kjellermembranmatrisebelagte plater (glassbunn).
- Belegge platen med kjellermembranmatrise.
- Inspiser blastoidene visuelt for å vurdere og registrere morfologi.
MERK: Bare blastoider som viser den klassiske hollow-ball blastocyst morfologien med kompakt ICM har potensial til å vokse og utvikle seg videre. - Tilsett 100 μL CMRL medium-1 per en brønn av 96-brønnsplaten, og legg platen i inkubatoren minst 2 timer før blastoider overføres for likevekt.
- Ved hjelp av et stereomikroskop, identifiser blastoidene visuelt med god morfologi, overfør de valgte blastoidene i en brønn på 96-brønnsplate som inneholder 100 μl CMRL medium-1 for å fjerne sporene av blastoidmedier.
- Overfør blastoidene til brønnen som inneholder forhåndslikevektede CMRL media-1. Plasser platen i inkubatoren og inkuber ved 37 °C over natten.
MERK: Opptil 5 blastoider kan dyrkes i en brønn på 96 brønnplater. Å ha for mange blastoider i en enkelt brønn kan føre til dannelse av aggregater av flere blastoider. - Neste dag inspiserer du blastoidene visuelt under et mikroskop. Hvis blastoidene er festet, tilsett 100 μL forhåndslikevektet CMRL media-1 supplert med 5% kjellermembranmatrise. Plasser platen i inkubatoren og inkuber ved 37 °C over natten.
- Neste dag, overvåke blastoidene under et mikroskop. Fjern halvparten av mediet (100 μL) og erstatt det med 100 μL forhåndstilveid CMRL media-2 supplert med 5% kjellermembranmatrise.
- På de følgende dagene, erstatt halvparten av mediet (100 μL) med forhåndslikevektet CMRL media-3 supplert med 5% kjellermembranmatrise. Plasser platen i inkubatoren og inkuber ved 37 °C over natten. Gjenta hver dag i opptil 4-6 dager med in vitrokultur .
MERK: Vi har dyrket blastoider i opptil 6 dager under utvidede kulturforhold som tilsvarer tidsekvivalenten til dag 13 av in vitrokulturerte menneskelige embryoer.
7. Immunostaining blastoider
- Aspirer mediet. Vask prøvene 3x med PBS i 5 min.
- Tilsett 200 μL kald 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS og fest prøver i 30 min ved romtemperatur. Fjern PFA-oppløsningen og vask prøvene 3x med PBS i 10 min.
MERK: Hvis blastoider ble dyrket på mikrowellflis, overfør blastoidene fra brikken til 96-brønns U-bunnplater for følgende trinn. - Permeabiliser og blokker blastoidene i 100 μL blokkeringsløsning per brønn (PBS som inneholder 0,3% Triton-X 100 og 10% normalt eselserum) i 60 min.
MERK: Avhengig av vertsartene til antistoffene, tilpass serumet tilsvarende. - Fjern blokkeringsløsningen. Tilsett 100 μL primære antistoffer fortynnet i fersk blokkeringsløsning og inkuber prøver over natten ved 4 °C.
MERK: Konsentrasjonene av primære antistoffer må bestemmes basert på produsentens instruksjoner. - Vask prøvene 3x med 0,1% Triton-X 100 i PBS (vaskeløsning) i 10 min. Tilsett 100 μL sekundære antistoffer i blokkeringsløsning sammen med 20 μg/ml Hoechst kjerneflekk og inkuber prøver i 1 time ved romtemperatur. Beskytt prøvene mot lys.
MERK: Konsentrasjonene av sekundære antistoffer må bestemmes basert på produsentens instruksjoner. - Vask prøver 3x med vaskeløsning i 10 min. For avbildning overfører du prøvene til glassbunnen μ-slide i PBS.
MERK: Monteringsmediet bør velges basert på målsettingen som brukes for bildet. For eksempel er 80% glyserol i PBS mulig å bruke til å montere prøvene mens du bruker oljemål.
Representative Results
Vanligvis er naive hPSCer dyrket i PXGL (figur 2A) aggregerte og kaviterte strukturer som oppstår mellom 48 og 72 timer etter PALLY-induksjon og når en diameter på 150-250 μm innen 96 timer (figur 2B). Ved hjelp av optimale (1) seeding celle tall, (2) varigheten av prekulturell aggregering med N2B27 (0 til 24 t), (3) konsentrasjon av individuelle kjemiske komponenter (spesielt LPA), og (4) varighet av PALLY-behandling, induksjonseffektiviteten når 70% -80% som definert basert på morfometriske parametere (total størrelse på 150-250 μm, enkelt vanlig hulrom, enkelt indre klynge; Figur 2C,D) og tilstedeværelsen av de tre avgrensninger. En suboptimal startcelletilstand og/eller induksjonsforhold vil resultere i mindre effektiv eller ingen blastoiddannelse. For å sikre maksimal effektivitet og bare danne preimplantasjonsanaloger, er det avgjørende å bruke en kultur av høy kvalitet av naive PXGL hPSCer. Dette kan vurderes ved å måle med FACS prosentandelen av celler som er positive for overflatemarkørene SUSD2 (naiv tilstand) og CD24 (primet tilstand). Ytterligere overflatemarkører som er spesifikke for off-target ekstraembryonic avstamninger (f.eks. amnion, extraembryonic mesoderm) vil også være nyttige, men etter beste evne er de for øyeblikket ikke tilgjengelige. Hvis formasjonseffektiviteten som oppnås er lavere enn resultatene som rapporteres, er det viktig å nøye sjekke alle komponentene i blastoidmediet, spesielt LPA som rekonstitueres i PBS, og at det som en GPCR-ligand kan være mer ustabilt sammenlignet med syntetiske molekyler rekonstituert i DMSO. I de fleste tilfeller, selv om utbyttet ikke er maksimalt, består de kaviterte strukturene fortsatt av de tre blastocyste avstamninger. Fremveksten av tre blastocyst-avstamninger og dannelse av embryonal-abembryonisk akse kan bekreftes av immunfluorescensfarging av markører (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figur 2E,G). Trofosfærer, som bare består av TE, bidrar til å ytterligere dissekere rollen som intercellulær kommunikasjon. Trofosfærer kan dannes ved 50% -60% effektivitet innen 96 t induksjon (figur 2H, I). Blastoiddannelse kan utføres ikke bare i hjemmelagde mikrowell-arrayer, men også i kommersielt tilgjengelige ultra-lave vedlegg 96 brønnplater med optimalisering av induksjonsforhold (se Protokoll og figur 2J). Blastoider har også kapasitet til å videreutvikle seg i ytterligere 6 dager, noe som tilsvarer dag 13 embryo, med in vitro differensieringsprotokoll (figur 2K).
For å ytterligere karakterisere celletilstanden til blastoidceller, må encellet RNA-sekvenseringsteknologi brukes. UMAP brukes vanligvis til å visualisere en fordeling av celletilstander, og klyngeanalyse uten tilsyn utføres på den for å evaluere nærheten til individuelle celletilstander. Ulike parametere i dataanalysen med én celle kan påvirke hvordan celler vises i UMAPene, og dermed føre til klynger med forskjellige romlige og relative posisjoner og former (figur 3A). I denne analysen viser cellene imidlertid markant reprodusert distinkte klyngeprofiler uavhengig av parametrene som brukes til å utføre klyngene og visualiseringen av dataene, noe som gjør det mulig å skille med høy tillit de tre blastocyst-avstamningene. Vi brukte celler fra embryoer høstet på ulike utviklingsstadier som referanse. Sammenslåingen av disse datasettene viser at mesteparten av trophectoderm-analogen fra blastoid klynget med preimplantasjonstrofektoderm, men ikke med postimplantasjonstrofoblaster (figur 3B). Disse resultatene ble også bekreftet av et uavhengig konsortium10.
Når Carnegie stadium 7 (CS7) gastrulaterende embryoer blir introdusert i referansekartet, klynges en liten populasjon av blastoidceller (3%) sammen med mesoderm og amnion av disse embryoene (figur 3C). Når amnion-lignende celler blir introdusert i referansekartet, klynges en liten populasjon av blastoidceller (< 2%) med slike amnionlignende celler.
Totalt sett er det bare strukturene som består av et enkelt vanlig hulrom, en enkelt indre celleklynge, en totalstørrelse som spenner fra 150-250 μm, bestående av transkripsjonsanaloger av de tre blastocyst-avstamninger, og i stor grad blottet for andre avstamninger (f.eks. amnion, mesoderm, ekstraembryonic mesoderm) betraktes som menneskelige blastoider.
Figur 1: Fire funksjoner og to tilnærminger for å generere high-fidelity blastoids. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Blastoid- og trofosfærer avledet fra aggregater av naiv hPSC. (A) Fasekontrastbilder som viser naive hPSCer dyrket i PXGL-medium, samkulturert med bestrålet MEF. Skalalinje: 50 μm. (B) Fasekontrastbilder som viser den morfologiske endringen av naive hPSCer aggregeres dyrket på et ikke-tilhenger hydrogelmikrowell array med 500 nM LPA (PALLY medium). Skalastang: 200 μm. (C) Humane blastoider dannet på et mikrowell array etter 96 timer. Skalastenger: 400 μm. (D) Kvantifisering av prosentandelen mikrowells som inneholder en human blastoid indusert av PALLY kulturtilstand med optimalisert LPA-konsentrasjon fra forskjellige naive hPSC-linjer (n = 3 mikrowell arrays). (E) Immunfluorescence farging av menneskelige blastoider med epiblast (EPI) markører (gul) NANOG og OCT4; TE-markørene (cyan) CDX2 og GATA3; og den primitive endodermmarkøren (magenta) SOX17 og GATA4. Skalastang: 100 μm. (H-I) Kvantifisering av cellenummeret (venstre) og prosentandelen celler (høyre) som tilhører hver avstamning i blastoid (96 h) basert på immunfluorescensfarging av OCT4, GATA3 og GATA4. (G) Immunfluorescensfarging av humane blastoider for CDX2 (cyan) og NR2F2 (magenta). (F) Fasekontrastbilder av tidlige og sene trofosfærer på mikrowellmatrise indusert ved tillegg av henholdsvis 3 μM SC144 (H) eller 2 μM XMU-MP-1 (I). (J) Fasekontrastbilder som viser den morfologiske endringen av naive hPSCer aggregerer dyrket i ultra-lav vedlegg 96 brønnplate med 500 nM LPA (PALLY medium). (K) Fasekontrastbilde (venstre) og immunfluorescensfarging (høyre) for OKT4 (gul), GATA3 (cyan) og GATA4 (magenta) i blastoid dyrket i postimplantasjonskulturtilstand i 6 dager. Skala bar: 100 μm. Dette tallet er tilpasset fra 6,10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av sammensetningen av blastoider ved sekvensering av enkeltceller. (A) Uovervåket klyngeanalyse med ulike parametere på UMAP av transkripsjonen av enkeltceller avledet fra de forskjellige tidspunktene blastoid (24 t, 60 h, 96 h), naive hPSCer, primede hPSCer og hTSC (representerer postimplantasjon cytotrophoblast). (B) UMAP av transkripsjonen av celler avledet fra blastoid (96 h), naive hPSCer og primede hPSCer integrert med publiserte datasett fra humane embryoer av preimplantasjon, peri-implantasjon (in vitrokulturerte blastocytter) og gastrulation (Carnegie stage 7, dvs. mellom E16-19) stadier. Individuelle celler er farget basert på opprinnelsen til menneskelige embryoer (venstre), blastoid-avledede celler eller stamceller (midten), og resultatet av uovervåket klyngeanalyse (høyre). (C) UMAPer av transkripsjonen av celler avledet fra blastoider, naive hPSCer, primede hPSCer og integrert med publisert datasett fra gastrulation (Carnegie stage 7, dvs. mellom E16-19) stadium embryo. Individuelle celler er farget basert på opprinnelsen til menneskelige embryoer (venstre), blastoid-avledede celler eller stamceller (midten), og resultatet av uovervåket klyngeanalyse (høyre). Dette tallet er tilpasset fra6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende tabell 1: All mediesammensetning som brukes i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
I den nåværende studien viser vi, trinnvis, hvordan man etablerer menneskelige blastoider med høy effektivitet ved hjelp av en enkel og robust protokoll. Ved aggregering av naive PXGL hPSCer og deres trippel inhibering dannes blastoider effektivt (> 70%) og genererer sekvensielt de 3 blastocystanalogene innen 4 dager. Begrensninger i effektiviteten og kvaliteten på blastoidene (f.eks. tilstedeværelse av off-target celler) kan oppstå hvis den opprinnelige tilstanden er sub-optimal. Vær oppmerksom på at vi har målt at PXGL hPSCer inneholder omtrent 5% av cellene som reflekterer postimplantasjonsstadiene. Disse cellene kan begrense dannelsen av høykvalitets blastoider. Utover den første naive PXGL-tilstanden som gjenspeiler blastocyst-epiblastomet, er en annen sentral faktor mediet som brukes til blastoiddannelse. For raskt å danne blastocyst-lignende celler og forhindre dannelse av off-target, post-implantasjon-lignende celler, foreslår vi at trippel veier hemming (Hippo, ERK, TGF-β) er viktig. Mens forskjellige cellelinjer gir forskjellige utbytter av blastoid på ERK / TGF-β-hemming (vanligvis rundt 10% -20%), resulterer eksponering for LPA i dannelsen av like høyt blastoid avkastning på tvers av alle cellelinjer, mens du bruker strenge morfometriske og avledningsspesifikasjonskriterier. LPA virker muligens på hemming av Hippo-banen, som spiller en kritisk rolle i den første avgrensningssegregeringen mellom epiblast og trophectoderm-avgrensninger i mus og menneske 8,51. Den betydelige forbedringen av blastoideffektiviteten fra LPA antyder at Hippo-banen-medierte indre-ytre cellespesifikasjonsmekanismer som spilles i blastocysten, er samvalgt under blastoiddannelse. En nåværende begrensning ligger i det faktum at på grunn av en sub-optimalitet av protokollene som brukes til å dyrke menneskelig blastocyst eller blastoider på tidsekvivalent dag 7-13 (etter blastocyst / blastoid formasjon), er vi ikke i stand til å vurdere i hvilken grad vi kan modellere etterimplantasjonsutvikling riktig.
Analyse av blastoidcellenes transkripsjonstilstand kan enkelt oppnås ved hjelp av scRNAseq, tilstrekkelige referansekart og bioinformatiske metoder. Tidligere viste den transkripsjonsanalysen at hPSCer dyrket i PXGL er mer lik blastocyst-epiblastomet sammenlignet med den primede tilstanden. Begrensninger i analysen av dataene kan oppstå hvis referansekartet bare består av blastocystfaseceller. Referansekartet bør inneholde celler som stammer fra embryoer etter implantasjon for å vurdere tilstedeværelsen av potensielle off-target celler. I fremtiden, for å måle blastoidceller, ville et referansekart inkludert alle vevene i pre- og postimplantasjons-menneskelige conceptus være ekstremt verdifullt. I tillegg vil multi-omics enkeltcellereferansekart, for eksempel transkripsjon, kromatintilgjengelighet og DNA-metylering, ytterligere hjelpe. Til slutt vil standardiserte bioinformatiske metoder for kvantitativt å vurdere likhetene mellom celler fra embryomodeller og referansekonsepti, og å identifisere off-target celler positivt bidra til å analysere og sammenligne resultater objektivt.
Til sammen har blastoider dannet av trippel inhibering av Hippo, TGF-β og ERK-veier de fire egenskapene til 1) svært effektiv morfogenese, 2) riktig sekvens av avstamningsspesifikasjon, 3) høy renhet av blastocystlignende celler på transkripsjonsnivå, 4) kapasitet til å modellere peri-implantasjonsutvikling. Disse egenskapene til blastoider vil lette bygging av hypoteser om blastocystutvikling og implantasjon, men de recapitulaterer ikke tidligere stadier av embryonal utvikling. I motsetning til den begrensede tilgjengeligheten og allsidigheten til menneskelig blastocyst, er blastoider mottagelige for genetiske og narkotikaskjermer for funksjonelle undersøkelser av blastocystutvikling og implantasjon. I fremtiden kan slik grunnleggende kunnskap bidra til å forbedre IVF-medieformuleringen, utvikle prevensjonsmidler etter befruktning og bedre håndtere tidlig graviditet.
Disclosures
Institute for Molecular Biotechnology, Austrian Academy of Sciences har levert en patentsøknad EP21151455.9 som beskriver protokollene for human blastoiddannelse og blastoid-endometrium interaksjonsanalysen. HK, AJ, HHK og NR er oppfinnerne av dette patentet. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (ERC-Co grant agreement No.101002317 'BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis'). H.H.K. støttes av Det østerrikske vitenskapsfondet (FWF), Lise Meitner Program M3131-B. Vi takker Yasuhiro Takashima for å ha delt cellelinjene H9 og H9-GFP, og Austin Smith, Peter Andrews og Ge Guo for å ha delt cellelinjene HNES1, Shef6, niPSC 16.2b og cR-NCRM2. Vi takker Hossein Baharvand for å ha delt endometrieoroidene. Vi takker Joshua M. Brickman for at han delte RNA isolert fra PrE-differensierte celler og nEND-celler. Vi takker Shankar Srinivas for å dele encellede RNA-sekvenseringsdata fra peri-gastrulation embryoet. Vi takker Aleksand Bykov og Luisa Cochella for teknisk assistanse for SMARTSeq2 bibliotekforberedelse. Vi takker NGS-, Biooptic- og Stem Cell-anlegget på IMBA for kritisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
References
- Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
- Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
- Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
- Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
- Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
- Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
- Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
- Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
- Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
- Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
- Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Guo, G., et al.
- Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501 (2018).
- Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
- Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
- Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
- Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
- Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
- Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
- De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
- Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
- Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
- Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
- Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
- Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
- Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
- Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
- Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
- Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
- Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
- Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
- Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
- Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).
