Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)

Glicogênio, usado como armazenamento de carbono e energia, é um homopolímero de glicose consistindo de cadeias lineares de unidades de glicosítil ligadas por (1 → 4)-α ligações e anexadas através de (1 → 6)-α títulos ou pontos de ramificação. Eles aparecem como β e α-partículas no citosol de uma ampla gama de organismos. β partículas são minúsculas partículas solúveis em água observadas principalmente em procariotes. Seu diâmetro varia de 20-40 nm, provavelmente ditado pelas enzimas metabolizantes glicogênio e obstáculos estéricos ^1,2.

Descritas pela primeira vez em células animais, as partículas α maiores exibem até 300 nm de diâmetro com uma forma semelhante a couve-flor. Esta organização em particular pode se originar da agregação de várias partículas β ou pode surgir brotando de uma única β-partícula³. Curiosamente, um estudo recente relatou a presença de α-partículas em Escherichia coli⁴. No entanto, ao contrário de α partículas de células animais, esta última se desfaz rapidamente durante o processo de extração, o que pode explicar a falta de dados na literatura⁴. O aparecimento de α partículas em eucariotes e procariotes envolve enzimas metabolizantes de glicogênio filogeneticamente não relacionadas⁵. Isso levanta questões sobre a função de tais partículas e a natureza de potenciais agentes transversais entre β-partículas⁵.

Embora dois modelos matemáticos opostos tenham sido propostos para a formação de moléculas^de glicogênio 6,7,8,9, é geralmente aceito que β partículas evoluíram em resposta à sua função metabólica como uma reserva de combustível altamente eficiente para a liberação rápida de grandes quantidades de glicose. Um grande conjunto de evidências indica que propriedades de glicogênio, como digestibilidade e solubilidade na água, estão correlacionadas com o comprimento médio da cadeia (ACL), que ditará a porcentagem de pontos de ramificação e o tamanho da partícula 2,6,7,8,10,11 . A LCA é definida pela razão entre o número total de resíduos de glicose e o número de pontos de ramificação. Normalmente, os valores da LCA variam de 11-14 e 7-23 resíduos de glicose em eucariotes e procariotes, respectivamente¹⁰. Em humanos, várias doenças de desordem glicogênio são devido ao acúmulo anormal de glicogênio. Por exemplo, a doença de Andersen está associada à atividade deficiente de uma enzima ramificada glicogênio, resultando no acúmulo de glicogênio anormal¹¹. Em procariotes, estudos cumulativos sugerem que a LCA é um fator crítico que impacta a taxa de degradação da capacidade de sobrevivência glicógena e bacteriana^12,13. Foi relatado que bactérias sintetizando partículas β com baixo valor de LCA degradam-se mais lentamente e, portanto, suportam as condições de fome por mais tempo. Assim, o conhecimento da arquitetura de β-partículas é essencial para entender a formação de partículas glicogênios anormais em doenças humanas de armazenamento de glicogênio e procariotes de sobrevivência em um ambiente deficiente de nutrientes.

Desde o primeiro isolamento do glicogênio do fígado de cachorro pelo fisiologista francês Claude Bernard no final do século XIX^, muitas técnicas foram desenvolvidas para caracterizar partículas de glicogênio em detalhes. Por exemplo, microscopia eletrônica de transmissão para morfologia glicogênio (α ou β-partículas)¹⁵, espectrometria de proton-NMR para determinar a porcentagem de α-1,6 ligações¹⁶, cromatografia de exclusão de tamanho com multi-detectores para inferir o peso molecular, Eletroforese de carboidratos assistido por fluorophore (FACE)¹⁷ ou cromatografia de troca de ânion de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) para distribuição de cadeia de comprimento (CLD) e ACL determinação¹⁸.

Este trabalho se concentra no método de eletroforese de carboidratos assistido por fluorophore, que se baseia na aminação redutiva do grupo hemiacetal pela função amina primária. Historicamente, 8-amino-1,3,6-ácido trissulfônico de naftalina (ANTS) foi usado pela primeira vez para rotulagem. Mais tarde, foi substituído pelo fluoróforo mais sensível, 8-amino 1,3,6 pireno trissulfônico ácido (APTS)¹⁹.

Figura 1: A reação de aminação redutiva com ácido trissulfônico de 8-amino 1,3,6 pireno (APTS). Reação de aminação redutiva do grupo hemiacetal pela função amina primária de 8-amino 1,3,6 pirene ácido trissulfônico (APTS) em condições redutivas Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como descrito na Figura 1, a função hemiacetal da extremidade redutora de uma cadeia glucana interage com a amina primária da APTS em condições de redução. Os grupos sulfônicos da APTS carregam cargas negativas que permitem a separação de cadeias glucanas de acordo com seu grau de polimerização (DP). A reação redutiva de amina é altamente reprodutível e eficiente. Uma rotulagem média de eficiência de 80% é obtida para DP3 a DP135 e até 88% e 97% para maltose (DP2) e glicose, respectivamente^17,20. Como uma molécula de APTS reage com a extremidade redutora de cada cadeia glucana, cadeias individuais poderiam ser quantificadas e comparadas umas com as outras em uma base molar.

1. Incubação com enzimas desbranching

1. Misture 200 μL de glicogênio purificado a 0,5-2 mg/mL com 200 μL de 100 mM de tampão de acetato (pH 4.8). Adicione 2 μL de isoamylase (180 U/mg de proteína) e 1,5 μL de pullulanase (30 U/mg de proteína) (ver Tabela de Materiais), misture suavemente por tubulação para cima e para baixo e incubar a 42 °C por 16 h em um tubo de 1,5 mL.
   NOTA: Pode ocorrer degradação ou contaminação por amilase durante o processo de purificação de glicogênio. Para apreciar a presença de malto-oligossacarídeos gratuitos, as amostras podem ser incubadas sem o coquetel enzimante desbranchante em paralelo. Uma norma (por exemplo, maltoheptaose) é incluída na análise para determinar a relação entre o tempo de elução e o grau de polimerização.
2. Pare as reações incubando a 95 °C por 5 min.
3. Centrifugar a 16.100 x g por 5 min à temperatura ambiente para pelotas e remover qualquer material insolúvel.
4. Remova os supernantes usando uma pipeta e transfira-os para novos tubos anotados. Desaltar os supernantes adicionando o equivalente a 100 μL de contas de resina de ânion/cá (AG-501-X8, ver Tabela de Materiais) e agitar.
   1. Agitar regularmente as contas por 5 minutos. Colete as amostras por pipetação e coloque-as em novos tubos anotados.
5. Congele ou use um evaporador a vácuo configurado (ver Tabela de Materiais) a 30 °C para secar as amostras.
6. Armazene amostras secas à temperatura ambiente ou a -20 °C.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas por 1 mês.

2. Aminação redutiva

1. Misture as amostras secas com 2 μL de 1 M de cianoboroidride de sódio em tetrahidrofurano (THF) e 2 μL de APTS (5 mg de APTS resuspended em 48 μL de ácido acético de 15%) (ver Tabela de Materiais).
2. Incubar a 42 °C por 16 h no escuro.
   ATENÇÃO: O cianoboroidido de sódio é tratado com equipamento de proteção pessoal adaptado e sob uma capa química. A inalação e o contato com a pele são altamente tóxicos e podem ser fatais, causando queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Gases altamente tóxicos podem ser gerados ao misturar cianoboroidride de sódio com ácido acético. Em contato com a água, o cianoboroidrride de sódio libera gases inflamáveis, que podem inflamar espontaneamente. As amostras concentradas são manuseadas sob uma capa química e utilizam equipamentos de proteção individual adaptados a partir desta etapa.

3. Análise FACE

1. Adicione 46 μL de água ultrauso a cada amostra.
2. Diluir as amostras diretamente para 1/50 em micro frascos de 100 μL adicionando 1 μL da amostra a 49 μL de água ultrapura. Mantenha as amostras no escuro enquanto estiver definindo o FACE (5-10 min).
3. Realize eletroforese de polaridade reversa com um instrumento de eletroforese capilar com detector de fluorescência induzida a laser (LIF). Defina a polaridade como "modo reverso" para separação, coloque o LIF em comprimento de onda de emissão de 488 nm e o detector em 512 nm.
4. Defina o tempo de injeção para 10 s e a pressão de injeção em 0,5 psi.
5. Realize a separação de glucanos rotulados pela APTS a 30 kV em um capilar de sílica fundido nu de 60,2 cm de comprimento com diâmetro interno de 50 μm (375 μm de diâmetro externo) no tampão de separação de carboidratos ligado a N diluído a 1/3 em água ultrapurada (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: O tampão de separação de carboidratos ligado a N é substituído a cada 20 corridas.

4. Processamento de DADOS

1. Exporte o ". ASC "e ". CDF "arquivos contendo o perfil de eletroferograma e dados de integração, respectivamente.
2. Abra o . Arquivo ASC e desenhe a unidade relativa de fluorescência de acordo com o gráfico de tempo.
3. Abra o . Arquivo CDF , proceda com uma primeira integração automática e ajuste os seguintes parâmetros: largura; vale para integração vale; área mínima.
4. Verifique e corrija qualquer evento de integração inadequado manualmente.

Determinação do comprimento médio da cadeia do glicogênio
A Figura 2 representa o fluxo de trabalho necessário para inferir a distribuição do comprimento da cadeia e o comprimento médio da cadeia (ACL) do glicogênio.

Figura 2: Fluxo de trabalho para determinar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD) e o comprimento médio da cadeia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 exibe os eletroferogramas de maltohexaose comercial e glicogênio bovino desbranchado. Os sinais de fluorescência observados entre 4,13-4,67 min em todos os experimentos originaram-se do APTS não redigido. O tempo de eluição do maltohexaose rotulado (DP6) foi estimado em 8,49 min (Figura 3A). Os glicos de glicogênio bovino rotulados pela APTS foram identificados com base no tempo de eluição de DP6 (Figura 3B). Nenhum traço de malto-oligossacarídeo livre foi detectado na amostra de controle (glicogênio não incubado com enzimas desbranchantes) (Figura 3C).

Figura 3: Eletroferógramas de um glicogênio hepático padrão e bovino. (A) A elução do tempo (8,49 min) de um padrão glucano, maltohexaose (DP6), foi utilizada como referência para determinar o grau de polimerização (DP) de glucanos rotulados pela APTS liberados do glicocógeno hepático bovino após a ação de atividades de enzimas desbranchantes (BB) ). O painel de entrada mostra uma separação de cadeias glucanas de até 44 DP. Em paralelo, o glicogênio bovino não tratado foi rotulado com APTS para detectar possíveis vestígios de malto-oligossacarídeos livres na amostra (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pode-se concluir que a liberação de glucano rotulado aPTS deve-se ao decote de pontos de ramificação tanto pelas atividades isoamylase quanto pullulanase. Deve-se notar que o perfil de eletroforese capilar pode ser redesenhado em um formato mais apropriado para criar uma figura de mosaico contendo vários perfis. Para isso, os arquivos DATA contendo valores de fluorescência são gerados com extensão "asc" e abertos no programa de planilhas escolhendo o formato CSV (valor separado por címula). Infelizmente, os valores de fluorescência exportada não estão associados ao tempo de eluição correspondente. Consequentemente, eles devem ser adicionados manualmente de acordo com a configuração de frequência de aquisição no aparelho FACE (4 Hz significa uma aquisição de valor a cada 0,25 s).

As áreas de pico foram então inferidas usando o aplicativo nativo do instrumento FACE ou exportadas como um arquivo DATA com uma extensão "cdf" para usar outro aplicativo. Os valores da área são exportados em um programa de planilha e normalizados expressando o DP como percentual da área total da superfície (Figura 4).

Figura 4: Normalização dos dados, distribuição do comprimento da cadeia e valor médio do comprimento da cadeia. As áreas de pico de fluorescência foram importadas e normalizadas em uma planilha. A distribuição do comprimento da cadeia é mostrada como o percentual de DP para cada DP. O comprimento médio da cadeia (ACL) é calculado somando cada porcentagem de cadeia vezes o grau correspondente de polimerização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, o comprimento médio da cadeia (ACL) é inferido calculando a soma de cada cadeia percentual vezes o grau correspondente de polimerização. Experimentos semelhantes foram realizados em triplicado em glicogênio de fígado de coelho (Figura 5A), em glicogênio bovino (Figura 5B) e glicogênio de ostra (Figura 5C).

Figura 5: Distribuição de comprimento da cadeia de glicogênio comercial. O fígado de coelho (A), o fígado bovino (B) e o glicogênio de ostra (C) foram incubados na presença de enzimas desbranching (isoamylase e pullulanase). Os glucas rotulados pela APTS foram então separados de acordo com seu grau de polimerização (DP) utilizando análise FACE. Maltose (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaose (DP7) representam os glucas mais abundantes em fígado de coelho, ostra e glicogênio bovino, respectivamente. O Erro Padrão de Média (SEM) foi inferido a partir de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A distribuição de comprimento de cadeia do glicogênio hepático de coelho mostrou claramente um maior teor de malto-oligossacarídeo curto (DP2) do que o glicogênio hepático bovino (DP 7) ou glicogênio de ostra (DP6). Como resultado, o glicogênio do fígado de coelho possui o menor comprimento médio da cadeia (ACL = 9,8) em comparação com o glicogênio hepático bovino (ACL = 11,9) e o glicogênio de ostra (ACL = 12,6). Deve-se notar que esses glicogênios comerciais são geralmente usados para avaliar a atividade de glicogen phosphorylase ou glicogen synthase. Isso sugere que a determinação de parâmetros cinéticos (Vmax e Km) das atividades de enzimas metabolizadoras de glicogênio variará de acordo com a fonte do glicogênio.

Análises subtrativas
A análise subtrativa é um método simples para comparar a distribuição das cadeias glucanas de duas amostras. Por exemplo, foram determinados CLDs de glicogênio produzidos pelo tipo selvagem (WT) Synechocystis PCC6803 e as cepas mutantes isogênicas únicas glgA1 e glgA2 (Figura 6A).

Figura 6: Comparação das distribuições de comprimento da cadeia utilizando análise subtrativa. (A) As distribuições de comprimento de cadeia de glicogênio purificadas a partir de cepas cianobacínias: synechocystis synechocystis PCC6803 e glgA1 e glgA2 mutantes únicos foram determinadas por meio da análise FACE. O Erro Padrão de Média (SEM) foi inferido a partir de três experimentos independentes. (B) As análises subtrativas foram realizadas subtraindo o % de cada DP de WT para o % de cada DP de ΔglgA1 e subtraindo o % de cada DP de WT para o % de cada DP de DP glgA2. Esta manipulação matemática simples mostra a alteração de correntes glucanas em cepas mutantes (linhas pretas). (C) As distribuições médias de comprimento da cadeia de glicogênio a partir de tipo selvagem e mutantes de Synechocystis foram normalizadas de acordo com o pico máximo observado para cada CLD (DP6 para todas as amostras). Dois componentes são evidenciados pela plotagem do CLD normalizado em escala logarítmica (Nde (DP)). Cada componente indica um mecanismo diferente de paralisação do crescimento (para mais informações, consulte Referência2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para recordar, a maioria das cepas de cianobactérias possui dois genes codificando atividades de sintetizador glicogênio: GlgA1 e GlgA221. Ambas as enzimas transferem a glicose resíduo de glicose ADP para as extremidades não redutoras das cadeias lineares de glucano. Como descrito na Figura 6A, é desafiador comparar amostras olhando apenas para os perfis de distribuição de comprimento da cadeia. A análise subtrativa consiste em subtrair o percentual de cada DP entre as amostras (Figura 6B). A análise subtrativa de %DP de WT menos % do mutante DP ΔglgA1 revela um excesso de DP3, 4 e 5 (valores negativos) e um teor reduzido de DP 10-20. Em contraste, a análise subtrativa entre %DP de WT e % de DP ΔglgA2 mutante indica um efeito oposto. Como os perfis de análise subtrativa são diferentes entre GlgA1 e GlgA2, isso sugere uma função específica de cada isoforme de sintetizador glicogênio na biosínteseglicógena 21.

É importante notar que a análise subtrativa só se aplica a experimentos que envolvam uma amostra de referência realizada em paralelo com as amostras. Caso contrário, a análise subtrativa pode ser empírica, uma vez que está no CLD normalizado da referência. Em 2015, Deng e colaboradores, que investigaram mecanismos de parada do crescimento do glicogênio em camundongos e humanos, propuseram uma conspiração alternativa e interpretação de CLDs de glicogênio para abordar essa questão. Este gráfico usa a área máxima de pico para normalizar cada CLD. Os dados são então plotados em uma escala logarítmica destacando dois componentes. Este último ilustra dois mecanismos diferentes para o alongamento da cadeiaparando 2. Ao desenhar linhas que se encaixam no componente DP mais alto, parâmetros absolutos (ou seja, inclinações e interceptações das linhas) podem ser usados para comparação cld sem normalização a um perfil de referência. ClDs do tipo selvagem (WT) Synechocystis PCC6803 e os mutantes isogênicos únicos glgA1 e glgA2 foram plotados em uma escala de tronco, e linhas de montagem foram determinadas para cada perfil (Figura 6C). O primeiro componente foi altamente semelhante entre as amostras, atingindo o máximo em DP 6. Isso ilustra que a enzima ramificada produz explicitamente o máximo de tais cadeias. O segundo componente apareceu como um ombro largo, que já estava descrito para camundongos e glicogênios humanos2. A inclinação do segundo componente surgiu em um DP mais alto em ΔglgA1 e a inclinação da linha de montagem correspondente (linha vermelha) foi inferior ao perfil do tipo selvagem. Assim, a falta de GlgA1 retarda a prisão de alongamento em cadeia durante a biossíntese que foi proposta para ocorrer por obstáculos estéricos para camundongos e glicogênio humano2. Esses dados sugerem que a enzima alongadora restante (ou seja, GlgA2) produz cadeias mais longas antes da aglomeração da cadeia. Em ΔglgA2, o efeito oposto foi observado com uma queda mais dramática da linha de montagem, corroborando que as cadeias produzidas pelo GlgA1 restante são mais curtas do que aquelas sintetizadas apenas pelo GlgA2 antes do obstáculo estérico. Esta análise sugere que ambas as isoformas possuem cinética distinta e/ou que sua respectiva concertação com atividade enzimática ramificada difere.

Os autores não têm conflitos de interesse associados a este trabalho.