Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)

Este método proporciona uma melhor compreensão das organizações estruturais das partículas glicogênio. É uma questão importante porque a população das cadeias glucanas, a chamada distribuição de comprimento da cadeia, determina as propriedades químicas físicas das partículas de glicogênio. Como a solubilidade da água.

Uma grande vantagem dessa técnica é que a fluorescência é constante, independentemente do comprimento da cadeia glucano. Há apenas uma molécula APTS ligada por Glucan. Assim, a intensidade da fluorescência é diretamente proporcional ao número de cadeias glucanas.

O campo para eletroforese capilar assistida é adequado para a resolução do mecanismo médico de enzimas metabolizantes de glicogênio. Por exemplo, podemos determinar o grau de polimerização das cadeias glucanas transferidas por enzimas ramificadas em Glucan aceito. A reação deve ser realizada em condições.

Portanto, as regiões devem ser protegidas contra umidade. Misture 200 microliters de 0,5-2 miligramas por mililitro de glicogênio purificado com 200 microliters de 100 tampão de acetato de pH 4.8. Adicione 2 microliters de Isoamylase, e 1,5 microliters de Pullulanase.

Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo. Em seguida, incubar a 42 graus Celsius por 16 horas em um tubo de 1,5 mililitro. Pare as reações incubando a 95 graus Celsius por 5 minutos.

Centrifugar a 16, 100 vezes G'for 5 minutos à temperatura ambiente para pelotas e remover qualquer material insolúvel. Remova a super manutenção com uma pipeta e transfira-as para novos tubos anotados. Depois de adicionar contas de resina no tubo de microfusão vazio, desáde os supernantes adicionando o equivalente a 100 microliters de uma receita de resina de troca de ânion e agitar.

Colete as amostras por pipetação e coloque-as em novos tubos anotados. Congele as amostras. Armazene amostras secas à temperatura ambiente ou 20 graus Celsius.

Misture as amostras secas com 2 microlitadores de 1 ritâneo de sódio molar cyanoboroidido e tetrahidrofurano, e 2 microlitres de 8 amino 1-3-6 pireno trissulfônico. Incubar a 42 graus Celsius por 16 horas no escuro. Adicione 46 microliters de água ultra pura a cada amostra.

Para diluir as amostras 50 vezes, adicione um microliter da amostra a 49 microliters de água ultra pura em 100 microlírios microliteres. No vórtice para misturar bem. Coloque as amostras no escuro por 5 a 10 minutos enquanto estiver definindo o rosto.

Para realizar a eletroforese de polaridade reversa, configure o método, defina a pressão de injeção para 0,5 libra de força por polegada quadrada. Em seguida, defina a polaridade para reverter o modo de separação. Diluir o tampão de separação de carboidratos ligado a N para um terço em água ultra pura.

Realize a separação de glicos rotulados APTS no tampão diluído a 30 kilovolts em um capilar de sílica fundido nu. Em seguida, configure o tempo de injeção e inicie a análise. Exporte os arquivos ASC e CDF contendo o perfil de eletroferograma e os dados de integração, respectivamente.

Abra o arquivo ASC e desenhe a unidade de fluorescência relativa de acordo com o gráfico de tempo. Abra o arquivo CDF. Prossiga com uma primeira integração automática e ajuste os seguintes parâmetros com a integração vale-vale e área mínima.

Verifique e corrija qualquer evento de integração inadequado manualmente. Os sinais de fluorescência observados entre 4,13 e 4,67 minutos originaram-se da APTS não redigida. O tempo aleúte de Maltohexaose DP 6 foi estimado em 8,49 minutos.

Os APTS rotulados glucanos de glicogênio bovino foram identificados com base no tempo aleúno da DP 6. Nenhum traço de Maltooligosacarídeo livre foi detectado na amostra de controle na qual o glicogênio não foi incubado com enzimas desbranching. O painel de entrada mostra uma separação de cadeias glucan até 44 DP. A distribuição do comprimento da cadeia é mostrada como o percentual de DP para cada DP. O comprimento médio da cadeia foi calculado somando cada percentual de cadeia vezes O grau correspondente de polimerização.

A análise facial mostrou que os glucas mais abundantes são maltose e fígado de coelho, Maltohexaose na ostra, e Maltoheptaose no fígado bovino. As distribuições de comprimento da cadeia de glicogênio purificadas do tipo selvagem e cepas bacterianas mutantes foram determinadas por meio da análise facial. As análises subtrativas foram realizadas subtraindo a porcentagem de cada DP do tipo selvagem da porcentagem de cada DP de mutantes.

As distribuições médias de comprimento da cadeia de glicogênio do tipo selvagem e mutantes de Synechocystis foram normalizadas de acordo com o pico máximo observado para cada CLD. Esta técnica permite uma melhor compreensão das doenças humanas associadas a um defeito no metabolismo glicogênio, particularmente a doença de Andersen, rica resultado do acúmulo de partículas glicogênio anormais nas células.