Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)
31 de março de 2022
No presente protocolo, a técnica de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE) é usada para determinar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD) e o comprimento médio da cadeia (ACL) do glicogênio.
Este método proporciona uma melhor compreensão das organizações estruturais das partículas glicogênio. É uma questão importante porque a população das cadeias glucanas, a chamada distribuição de comprimento da cadeia, determina as propriedades químicas físicas das partículas de glicogênio. Como a solubilidade da água.
Uma grande vantagem dessa técnica é que a fluorescência é constante, independentemente do comprimento da cadeia glucano. Há apenas uma molécula APTS ligada por Glucan. Assim, a intensidade da fluorescência é diretamente proporcional ao número de cadeias glucanas.
O campo para eletroforese capilar assistida é adequado para a resolução do mecanismo médico de enzimas metabolizantes de glicogênio. Por exemplo, podemos determinar o grau de polimerização das cadeias glucanas transferidas por enzimas ramificadas em Glucan aceito. A reação deve ser realizada em condições.
Portanto, as regiões devem ser protegidas contra umidade. Misture 200 microliters de 0,5-2 miligramas por mililitro de glicogênio purificado com 200 microliters de 100 tampão de acetato de pH 4.8. Adicione 2 microliters de Isoamylase, e 1,5 microliters de Pullulanase.
Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo. Em seguida, incubar a 42 graus Celsius por 16 horas em um tubo de 1,5 mililitro. Pare as reações incubando a 95 graus Celsius por 5 minutos.
Centrifugar a 16, 100 vezes G'for 5 minutos à temperatura ambiente para pelotas e remover qualquer material insolúvel. Remova a super manutenção com uma pipeta e transfira-as para novos tubos anotados. Depois de adicionar contas de resina no tubo de microfusão vazio, desáde os supernantes adicionando o equivalente a 100 microliters de uma receita de resina de troca de ânion e agitar.
Colete as amostras por pipetação e coloque-as em novos tubos anotados. Congele as amostras. Armazene amostras secas à temperatura ambiente ou 20 graus Celsius.
Misture as amostras secas com 2 microlitadores de 1 ritâneo de sódio molar cyanoboroidido e tetrahidrofurano, e 2 microlitres de 8 amino 1-3-6 pireno trissulfônico. Incubar a 42 graus Celsius por 16 horas no escuro. Adicione 46 microliters de água ultra pura a cada amostra.
Para diluir as amostras 50 vezes, adicione um microliter da amostra a 49 microliters de água ultra pura em 100 microlírios microliteres. No vórtice para misturar bem. Coloque as amostras no escuro por 5 a 10 minutos enquanto estiver definindo o rosto.
Para realizar a eletroforese de polaridade reversa, configure o método, defina a pressão de injeção para 0,5 libra de força por polegada quadrada. Em seguida, defina a polaridade para reverter o modo de separação. Diluir o tampão de separação de carboidratos ligado a N para um terço em água ultra pura.
Realize a separação de glicos rotulados APTS no tampão diluído a 30 kilovolts em um capilar de sílica fundido nu. Em seguida, configure o tempo de injeção e inicie a análise. Exporte os arquivos ASC e CDF contendo o perfil de eletroferograma e os dados de integração, respectivamente.
Abra o arquivo ASC e desenhe a unidade de fluorescência relativa de acordo com o gráfico de tempo. Abra o arquivo CDF. Prossiga com uma primeira integração automática e ajuste os seguintes parâmetros com a integração vale-vale e área mínima.
Verifique e corrija qualquer evento de integração inadequado manualmente. Os sinais de fluorescência observados entre 4,13 e 4,67 minutos originaram-se da APTS não redigida. O tempo aleúte de Maltohexaose DP 6 foi estimado em 8,49 minutos.
Os APTS rotulados glucanos de glicogênio bovino foram identificados com base no tempo aleúno da DP 6. Nenhum traço de Maltooligosacarídeo livre foi detectado na amostra de controle na qual o glicogênio não foi incubado com enzimas desbranching. O painel de entrada mostra uma separação de cadeias glucan até 44 DP. A distribuição do comprimento da cadeia é mostrada como o percentual de DP para cada DP. O comprimento médio da cadeia foi calculado somando cada percentual de cadeia vezes O grau correspondente de polimerização.
A análise facial mostrou que os glucas mais abundantes são maltose e fígado de coelho, Maltohexaose na ostra, e Maltoheptaose no fígado bovino. As distribuições de comprimento da cadeia de glicogênio purificadas do tipo selvagem e cepas bacterianas mutantes foram determinadas por meio da análise facial. As análises subtrativas foram realizadas subtraindo a porcentagem de cada DP do tipo selvagem da porcentagem de cada DP de mutantes.
As distribuições médias de comprimento da cadeia de glicogênio do tipo selvagem e mutantes de Synechocystis foram normalizadas de acordo com o pico máximo observado para cada CLD. Esta técnica permite uma melhor compreensão das doenças humanas associadas a um defeito no metabolismo glicogênio, particularmente a doença de Andersen, rica resultado do acúmulo de partículas glicogênio anormais nas células.
Visão Geral
Este protocolo utiliza a técnica de eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE) para analisar a distribuição do comprimento das cadeias (CLD) e o comprimento médio das cadeias (ACL) do glicogênio. Compreender esses parâmetros é fundamental para elucidar a organização estrutural e as propriedades das partículas de glicogênio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- bioquímica
- metabolismo do glicogênio
- técnicas de eletroforese
Antecedentes
- A distribuição do comprimento das cadeias de glucana influencia as propriedades físicas e químicas do glicogênio.
- A intensidade de fluorescência neste método é constante, permitindo a quantificação precisa das cadeias de glucana.
- Compreender a estrutura do glicogênio é essencial para estudar distúrbios metabólicos relacionados.
- As enzimas que metabolizam o glicogênio desempenham um papel fundamental na determinação do grau de polimerização das cadeias de glucana.
Objetivo do Estudo
- Determinar a distribuição do comprimento das cadeias e o comprimento médio das cadeias do glicogênio.
- Aprimorar a compreensão da organização estrutural do glicogênio.
- Investigar as implicações da estrutura do glicogênio em doenças humanas, como a doença de Andersen.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de glicogênio com enzimas específicas em condições controladas.
- Marcação com fluoróforo de glicanos para análise por eletroforese.
- Eletroforese com polaridade reversa para separação de glicanos marcados.
- Análise de dados por meio da integração dos perfis de eletroferogramas.
Resultados Principais
- Identificação de vários glucanos com base em seu grau de polimerização.
- Determinação das distribuições de comprimento das cadeias de glicogênio provenientes de diferentes fontes.
- Análises subtrativas revelando diferenças entre cepas selvagens e mutantes.
- Compreensão da relação entre a estrutura do glicogênio e distúrbios metabólicos.
Conclusões
- A técnica FACE fornece um método confiável para analisar a estrutura do glicogênio.
- Os achados contribuem para o entendimento de doenças associadas ao metabolismo do glicogênio.
- Pesquisas futuras podem explorar implicações terapêuticas para distúrbios relacionados ao glicogênio.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O entendimento da distribuição do comprimento das cadeias de glicogênio fornece informações essenciais sobre os mecanismos das doenças metabólicas e a função enzimática, apoiando a validação de alvos em distúrbios do armazenamento de glicogênio. O método FACE permite a avaliação quantitativa das populações de cadeias de glicanos, o que influencia diretamente a solubilidade e a biodisponibilidade do glicogênio — aspectos fundamentais no desenvolvimento de modelos pré-clínicos. Esse parâmetro estrutural auxilia na redução de riscos mecanicistas ao associar a atividade enzimática a desfechos fenotípicos em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Quantifica a distribuição do comprimento das cadeias de glucano para investigar hipóteses terapêuticas sobre a função da enzima ramificadora de glicogênio.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos ao estabelecer relações estrutura-função entre a atividade enzimática e as propriedades das partículas de glicogênio.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar distribuições de comprimento de cadeia com fenótipos de glicogênio associados a doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz sistemas biológicos validados com distribuições de comprimento de cadeia quantificadas para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Saída Quantitativa: Gera leituras baseadas em fluorescência proporcionais ao número de cadeias de glicano, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Reprodutibilidade: A integração padronizada de eletroferogramas apoia a escalabilidade do ensaio e a consistência entre plataformas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Relaciona a estrutura do glicogênio a distúrbios metabólicos humanos como a doença de Andersen por meio de distribuições anormais de comprimento das cadeias.
- Continuidade Translacional: Conecta ensaios enzimáticos na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de desfechos estruturais mensuráveis.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao quantificar desvios estruturais em modelos da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método FACE insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, fornecendo leituras estruturais que elucidam o mecanismo enzimático e a relevância para a doença.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre enzimas metabolizadoras do glicogênio mediante a medição de alterações no grau de polimerização.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaio com perfis padronizados de distribuição de comprimento de cadeia para avaliação de bibliotecas de compostos.
- Análises: Fornece dados de integração de eletroferogramas e saídas percentuais de comprimento de cadeia para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o mecanismo enzimático a resultados pré-clínicos por meio de alterações estruturais do glicogênio relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para análise da estrutura do glicogênio em diversos modelos de doenças e alvos enzimáticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias do metabolismo do glicogênio.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da proporcionalidade da intensidade de fluorescência ao número de cadeias de glicano.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões precoces de prosseguir ou não com base em biomarcadores estruturais.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco por meio de comparações quantitativas das distribuições de comprimento de cadeia entre modelos selvagens e mutantes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em eletroforese de carboidratos e técnicas de marcação com fluoróforos.
- Depende de instrumentação de eletroforese capilar com capacidade de polaridade reversa e sistemas de detecção para compostos fluorescentes.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras, incubação enzimática e integração de eletroferogramas.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes fontes de glicogênio (por exemplo, bacterianas, mamíferas) e condições enzimáticas.
- Limitado pela necessidade de condições de reação protegidas para evitar interferência de umidade durante a preparação das amostras.
