Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema nervoso autônomo cardíaco é crucial no controle da função cardíaca, como frequência cardíaca e contralidade cardíaca, e é dividido em ramos simpáticos e parassimpáticos. Normalmente, há um equilíbrio entre esses dois ramos para manter a homeostase. No entanto, estados de doenças cardíacas como infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e hipertensão podem induzir a remodelação de células envolvidas na inervação cardíaca, o que está associado a um desfecho clínico adverso.
Embora existam grandes quantidades de dados para a estrutura histológica e função do sistema nervoso autônomo cardíaco, sua arquitetura biológica molecular em saúde e doença ainda é enigmática em muitos aspectos. Novas tecnologias como o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) são promissoras para a caracterização genética de tecidos na resolução unicelular. No entanto, o tamanho relativamente grande dos neurônios pode impedir o uso padronizado dessas técnicas. Aqui, este protocolo explora o sequenciamento de RNA de núcleo único baseado em gotículas (snRNA-seq), um método para caracterizar a arquitetura biológica dos neurônios simpáticos cardíacos na saúde e na doença. Uma abordagem stepwise é demonstrada para realizar snRNA-seq do cervical superior bilateral (SCG) e gânglios estelares (StG) dissecados de camundongos adultos.
Este método permite a preservação da amostra a longo prazo, mantendo uma qualidade adequada de RNA quando amostras de múltiplos indivíduos/experimentos não podem ser coletadas de uma só vez em um curto período de tempo. A barificação dos núcleos com hashtag oligos (HTOs) permite a desmultiplexação e o rastreamento de amostras gangliônicas distintas pós sequenciamento. Análises subsequentes revelaram a captura bem-sucedida de núcleos de células neuronais, gliais por satélite e endoteliais das gânglios simpáticos, validadas pelo snRNA-seq. Em resumo, este protocolo fornece uma abordagem passo a passo para o snRNA-seq de gânglios cardíacos extrínsecos simpáticos extrínsecos, um método que tem potencial para uma aplicação mais ampla em estudos da inervação de outros órgãos e tecidos.
Introdução
O sistema nervoso autônomo (ANS) é uma parte crucial do sistema nervoso periférico que mantém a homeostase corporal, incluindo a adaptação às condições ambientais e patologia1. Está envolvida na regulação de múltiplos sistemas de órgãos em todo o corpo, como os sistemas cardiovascular, respiratório, digestivo e endócrino. A ANS é dividida em ramos simpáticos e parassimpáticos. Ramos espinhais da simpática sinapse do sistema nervoso em gânglios da cadeia simpática, situados bilateralmente em posição paravertebral. Os gânglios colossais e torácicos bilaterais, especialmente os StG, são componentes importantes que participam da inervação cardíaca.....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este protocolo descreve todas as etapas necessárias para o snRNA-seq de murine cervical e/ou colocothoracic (estelar) gânglio. Foram utilizados camundongos C57BL/6J femininos e masculinos (15 semanas de idade, n = 2 para cada sexo). Um mouse Wnt1-Cre;mT/mG adicional foi usado para visualizar o gânglio para fins de dissecção17,18. Este mouse adicional foi gerado pela cruzamento de um mouse B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J e um mouse B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo NIH ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Análise de controle de qualidade da preparação da biblioteca cDNA de núcleo único e snRNA-seq
Os resultados representativos descrevem os resultados de sequenciamento de 10.000 núcleos capturados em um único pool com uma biblioteca de expressão genética de 25.000 leituras/núcleo e uma biblioteca de hashtags de 5.000 leituras/núcleos. A Figura 3B ilustra os resultados de controle de qualidade do CDNA de1º fio, biblioteca de expressão genética (GEX) e biblioteca H.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui, descreve-se um protocolo detalhado que se concentra em i) a dissecção de gânglios cervicais superiores do camundongo adulto e gânglios simpáticos, ii) o isolamento e a criopreservação das células gânnicas, iii) isolamento do núcleo e iv) codificação de núcleos com rotulagem de HTO para fins multiplexais e snRNA-seq.
Com este protocolo, células gangliônicas simpáticas podem ser facilmente obtidas dissolvendo gânglios individuais usando trippsina e colagem comumente usadas. A preservação a.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Susan L. Kloet (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda no design experimental e discussões úteis. Agradecemos a Emile J. de Meijer (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Holanda) pela ajuda com o isolamento do RNA de núcleo único e a preparação da biblioteca para o sequenciamento. Este trabalho é apoiado pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO) [016.196.346 para M.R.M.J.].
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produtos químicos e reagentes | |||
| 0,25% Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0,4% corante azul de tripano | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Colagenase tipo 2 | Worthington | LS004176 | usar 1.400 U/mL |
| Dimetilsulfóxido Sigma | Aldrich | 67685 | |
| Etanol absoluto ≥ 99,5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Soro fetal bovino (baixa endotoxina) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Soro bovino Albumina 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Tampão de lavagem celular |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Tampão de lavagem celular |
| Solução de cloreto de magnésio, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Tampão de lise do núcleo |
| Substituto Nonidet P40 (detergente não iônico) | Sigma-Aldrich | 74385 | Tampão de lise do núcleo |
| Água livre de nuclease (não tratada com DEPC) | Tampão | ||
| de lise do núcleo Invitrogen AM9937Inibidor de RNase Protetora, 40 U/µ L | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Tampão de lise de núcleo |
| Solução de cloreto de sódio, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Tampão de lise de núcleo |
| Solução de cloridrato de Trizma, 1 M, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Tampão de lise de núcleo |
| Albumina de soro bovino 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Lavagem de núcleo |
| DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µ L | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Albumina de soro bovino 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Tampão de coloração ST (ST-SB) |
| Solução de cloreto de cálcio, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | Tampão de coloração ST (ST-SB) |
| Solução de cloreto de magnésio, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST tampão de coloração (ST-SB) |
| Água livre de nuclease (não DEPC tratado) | Tampão de coloração Invitrogen | AM9937 | ST (ST-SB) |
| Solução de cloreto de sódio, | 5M Sigma-Aldrich | 59222C | ST (ST-SB) |
| Solução de cloridrato de Trizma, 1M, pH 7,4 | Tampão de coloração Sigma-Aldrich | T2194 | ST (ST-SB) |
| Tampão de coloração Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anticorpo antinuclear Hashtag 1 anticorpo | Biolegend | 682205 | Hashtag anticorpo |
| TotalSeq-A0452 antinuclear Proteínas do complexo de poros Hashtag 2 Anticorpo | Biolegend | 682207 | Hashtag |
| TotalSeq-A0453 anticorpo antinuclear Hashtag 3 Anticorpo | |||
| Biolegend 682209 HashtagTotalSeq-A0461 anticorpo antinuclear Hashtag 11 anticorpo | Biolegend | 682225 | Hashtag anticorpo |
| TotalSeq-A0462 anticorpo antinuclear Hashtag 12 | Biolegend | 682227 | anticorpo Hashtag |
| Proteínas anti-complexo de poros nucleares Hashtag 13 | Biolegend | 682229 | anticorpo Hashtag |
| TotalSeq-A0464 anti-Proteínas do Complexo de Poros Nucleares Hashtag 14 Anticorpo | Biolegend | 682231 | Hashtag Anticorpo |
| TotalSeq-A0465 Anti-Nuclear Complexo de Poros Hashtag 15 Anticorpo | Biolegend | 682233 | Anticorpo Hashtag |
| TruStain FcX (humano) | Biolegend | 422302 | Solução de bloqueio do receptor |
| FCEquipamentos e consumíveis | |||
| Bright-Line Hemacitômetro | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrífuga 5702/R A-4-38 | Eppendorf | ||
| CoolCell LX Recipiente de congelamento de células | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0,5 mL Eppendorf tubo Eppendorf | EP0030108035-250EA | ||
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Não TC-tratado | de Petri Corning | ||
| Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Ferramentas de ciência fina | 11252-40 | |
| Tesoura Fina Endurecida | Ferramentas de ciência fina | 14091-09 | |
| Panela de gelo, retangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Microscópio Leica | ||
| Moria MC50 Tesoura | Ferramentas de ciências finas | 15370-50 | |
| Tesoura de mola Noyes | Ferramentas de ciências finas | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Microscópio Olympus | ||
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Filtros de Pré-separação (30 µ m) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Agitando banho-maria | GFL | 1083 | |
| Placa de silicone | RubberBV | 3530 | Placa de dissecação |
| Software e pacotes | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programação | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6. Camundongo Cg-Tg (Wnt1-cre) 2Sor / J | O | estoque JAX | |
| B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Camundongo Luo / J | O | estoque JAX | |
| camundongos C57BL / 6J | Charles River | ||
| Código para a análise de dados< / strong> | |||
Referências
- McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricula....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
