Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

Resumo

Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Resumo

O sistema nervoso autônomo cardíaco é crucial no controle da função cardíaca, como frequência cardíaca e contralidade cardíaca, e é dividido em ramos simpáticos e parassimpáticos. Normalmente, há um equilíbrio entre esses dois ramos para manter a homeostase. No entanto, estados de doenças cardíacas como infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e hipertensão podem induzir a remodelação de células envolvidas na inervação cardíaca, o que está associado a um desfecho clínico adverso.

Embora existam grandes quantidades de dados para a estrutura histológica e função do sistema nervoso autônomo cardíaco, sua arquitetura biológica molecular em saúde e doença ainda é enigmática em muitos aspectos. Novas tecnologias como o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) são promissoras para a caracterização genética de tecidos na resolução unicelular. No entanto, o tamanho relativamente grande dos neurônios pode impedir o uso padronizado dessas técnicas. Aqui, este protocolo explora o sequenciamento de RNA de núcleo único baseado em gotículas (snRNA-seq), um método para caracterizar a arquitetura biológica dos neurônios simpáticos cardíacos na saúde e na doença. Uma abordagem stepwise é demonstrada para realizar snRNA-seq do cervical superior bilateral (SCG) e gânglios estelares (StG) dissecados de camundongos adultos.

Este método permite a preservação da amostra a longo prazo, mantendo uma qualidade adequada de RNA quando amostras de múltiplos indivíduos/experimentos não podem ser coletadas de uma só vez em um curto período de tempo. A barificação dos núcleos com hashtag oligos (HTOs) permite a desmultiplexação e o rastreamento de amostras gangliônicas distintas pós sequenciamento. Análises subsequentes revelaram a captura bem-sucedida de núcleos de células neuronais, gliais por satélite e endoteliais das gânglios simpáticos, validadas pelo snRNA-seq. Em resumo, este protocolo fornece uma abordagem passo a passo para o snRNA-seq de gânglios cardíacos extrínsecos simpáticos extrínsecos, um método que tem potencial para uma aplicação mais ampla em estudos da inervação de outros órgãos e tecidos.

Introdução

O sistema nervoso autônomo (ANS) é uma parte crucial do sistema nervoso periférico que mantém a homeostase corporal, incluindo a adaptação às condições ambientais e patologia¹. Está envolvida na regulação de múltiplos sistemas de órgãos em todo o corpo, como os sistemas cardiovascular, respiratório, digestivo e endócrino. A ANS é dividida em ramos simpáticos e parassimpáticos. Ramos espinhais da simpática sinapse do sistema nervoso em gânglios da cadeia simpática, situados bilateralmente em posição paravertebral. Os gânglios colossais e torácicos bilaterais, especialmente os StG, são componentes importantes que participam da inervação cardíaca. Em estados de doenças, como isquemia cardíaca, a remodelagem neuronal pode ocorrer, resultando em um overdrive^{simpático 2}. A remodelagem neuronal foi demonstrada em múltiplos estudos histológicos em humanos e várias outras espécies animais 3,4,5,6. Atualmente, falta uma caracterização biológica detalhada da remodelação neuronal induzida pela isquemia cardíaca na gânglios simpáticos cardíacos, e as características biológicas fundamentais dos tipos ou subtipos especializados das células neuronais dentro do sistema nervoso simpático cardíaco (SNS) ainda não estão totalmente determinadas na saúde e na doença⁷.

Novas tecnologias, como a scRNA-seq, abriram portas para a caracterização genética de pequenos tecidos em um nível unicelular ^8,9. No entanto, o tamanho relativamente grande dos neurônios pode impedir o uso otimizado dessas técnicas unicelulares em humanos¹⁰. Além disso, o sequenciamento unicelular requer um alto rendimento de células para recuperar um número celular suficiente devido a uma alta perda no processo de sequenciamento. Isso pode ser desafiador ao estudar pequenos tecidos difíceis de capturar em uma sessão e exigir várias amostras para introduzir células únicas suficientes para sequenciamento. A recém-desenvolvida tecnologia snRNA-seq baseada em gotículas (ou seja, a plataforma 10x Chromium) permite o estudo de diferenças biológicas entre núcleos únicos^11,12. o snRNA-seq tem uma vantagem sobre o scRNA-seq para células grandes (>30 μm), que não pode ser capturado em Gel Bead em Emulsões (GEMs), bem como melhor compatibilidade com dissociação extensiva e/ou preservação prolongada 13,14,15.

A heterogeneidade, o número de células neuronais e outras células enriquecidas no SNS cardíaco são aspectos importantes para a caracterização da ANS em estados de saúde e doenças. Além disso, a inervação específica de órgãos ou região por cada gânglio simpático contribui para a complexidade do SNS. Além disso, gânglios cervicais, estelares e torácicos da cadeia simpática têm sido mostrados para inervar diferentes regiões do coração¹⁶. Portanto, é necessário realizar a análise de núcleo único de células gangliônicas derivadas de gânglios individuais para estudar sua arquitetura biológica.

O snRNA-seq baseado em gotícula permite o perfil de expressão em toda a transcrição para um conjunto de milhares de células de várias amostras ao mesmo tempo com custos mais baixos do que plataformas de sequenciamento baseadas em placas. Essa abordagem permite que o snRNA-seq baseado em gotículas seja mais adequado para a classificação do fenótipo celular e a nova identificação de subpopulação de células dentro do SCG e do StG. Notavelmente, este protocolo fornece uma abordagem concisa para a identificação, isolamento e sequenciamento de RNA de núcleo único de gânglios cardíacos extrínsecos simpáticos, um método que tem potencial para uma ampla aplicação em estudos da caracterização de gânglios inervando outros órgãos e tecidos relacionados em saúde e doença.

Protocolo

Este protocolo descreve todas as etapas necessárias para o snRNA-seq de murine cervical e/ou colocothoracic (estelar) gânglio. Foram utilizados camundongos C57BL/6J femininos e masculinos (15 semanas de idade, n = 2 para cada sexo). Um mouse Wnt1-Cre;mT/mG adicional foi usado para visualizar o gânglio para fins de dissecção^17,18. Este mouse adicional foi gerado pela cruzamento de um mouse B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J e um mouse B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo NIH e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Leiden (Número de Licença AVD1160020185325, Leiden, Holanda). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos, softwares e animais utilizados no protocolo.

1. Preparativos

NOTA: Todas as etapas são executadas em um gabinete de fluxo de cultura celular.

1. Limpe as fórceps e a tesoura imergindo os instrumentos em 70% de etanol por 20 minutos.
2. Prepare o meio de gânglio composto por Neurobásal Medium complementado com B-27 plus (1x), L-glutamina (2 mM) e 1% Antibiótico-Antimycotic. Pré-aquecimento o meio gânglio à temperatura ambiente.
3. Prepare a solução de digestão: 0,25% Trypsin-EDTA (1:1) e 1.400 U/mL colagenase tipo 2 dissolvido no meio de gânglio.
4. Prepare tampão de lavagem celular fresco e frio (4 °C) (0,4% de colina bovina de soro [BSA]) e tampão de lise (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ e 0,1% detergente noniônico, 40 U/mL RNAse em água sem nuclease) para o isolamento do núcleo.
5. Prepare o tampão de lavagem do núcleo (1x salina tamponada com fosfato [PBS] com 2,0% BSA e 0,2U/μL RNase Inibidor).
6. Prepare o tampão de coloração ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 2% BSA, 0,02% Tween-20 em água sem nuclease).

2. Dissecção de gânglios cervicais superiores de camundongos adultos (SCG)

1. Eutanize os ratos e mantenha-os no gelo.
   NOTA: No presente estudo, um total de 4 camundongos C57BL6/J foram eutanizados por asfixia de CO₂ . Alternativamente, o isoflurano pode ser usado seguido de exsanguinação quando uma grande quantidade de sangue precisa ser coletada para outros fins de estudo.
2. Fixar o mouse em uma placa de dissecção com pinos e dous-lo com 70% de etanol para minimizar a dispersão de peles (a barba não é necessária).
3. Sob um estereótipo, abra a pele da região do pescoço fazendo um corte médio com uma tesoura, mova as glândulas submandibulares de lado, e remova o músculo esternostoide para expor e localizar a artéria carótida comum e sua bifurcação (Figura 1A, B, ver seta).
4. Disseca a bifurcação da artéria carótida direita e esquerda e o tecido ligado a ela. Transfira cada pedaço de tecido dissecado para uma placa de Petri separada de 3,5 cm contendo PBS frio.
5. Procure o SCG ligado à bifurcação carótida. Limpe ainda mais o SCG removendo a artéria e outros tecidos presos na placa de Petri (Figura 1E).

3. Dissecção de gânglios estelares de camundongos adultos (StG)

1. Para dissecar o StG, faça um corte médio no abdômen, seguido de abertura do diafragma e da parede torácica ventral.
2. Remova o coração e os pulmões para expor o tórax dorsal. Procure o StG esquerdo e direito anterolateral para o musculus colli longus (MCL) ao nível da primeira costela (Figura 1C, D, indicada por linhas tracejadas).
3. Disseca tanto a esquerda quanto a direita stG com fórceps e transfira-os separadamente para placas de Petri de 3,5 cm contendo PBS frio (Figura 1F).
   ​

4. Isolamento e criopreservação de células gangliônicas de camundongos

As etapas 4-6 são resumidas na Figura 2.

1. Transfira cuidadosamente todos os scg e stg individuais para separar tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL com fórceps.
   NOTA: Não use dicas de pipeta para transferir o gânglio porque os gânglios são propensos a aderir à parede de pontas de pipeta de plástico.
2. Adicione 500 μL de solução trypsin-EDTA de 0,25% a cada tubo de microcentrifus de microcentrída e incubar em um banho de água tremendo a 37 °C por 40 min.
   NOTA: Esta etapa visa facilitar a digestão e liberação celular daqui para frente na solução de colagem tipo 2.
3. Prepare um tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio de gânglio para cada amostra. Permita que os gânglios se acomodem no fundo dos tubos de microcentrifuuagem. Recolher o supernante, que contém muito poucas células gangliônicas, transferir o supernante para os tubos preparados de 15 mL, e rotular cada tubo. Alternativamente, para economizar algum tempo, aspire o supernatante trypsin-EDTA sem coleta, pois pouquíssimas células dissociadas podem ser detectadas nele.
   NOTA: Uma pequena quantidade de solução trypsin-EDTA (~10-30 μL) pode ser deixada no tubo de microcentrífuga para evitar a remoção do gânglio. Evite a pipetação nesta etapa, pois pode danificar o gânglio e levar à baixa saída de células gânnicas depois.
4. Adicione 500 μL de solução tipo 2 de colagenase em cada tubo de microcentrifuuagem e incubar em um banho de água tremendo a 37 °C por 35-40 min. Tente resuspensar o gânglio depois de 35 min; se o gânglio ainda estiver intacto e não dissociar, prolongue o tempo de incubação ou aumente a concentração da solução tipo 2 de colagenase conforme necessário.
   NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo do tamanho do gânglio.
5. Resuspende a gânglio em solução de colagem, pipetando para cima e para baixo ~10 vezes ou até que os aglomerados de tecido não sejam mais detectados.
6. Transfira a suspensão celular para o tubo de 15 mL usado anteriormente que contém o meio de cultura gânglio e a suspensão trypsin-EDTA do mesmo gânglio. Gire a suspensão da célula com uma centrífuga de rotor de balde balançando por 10 minutos, 300 × g à temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o supernatante celular.
   NOTA: Como as células gangliônicas são dissociadas de um único gânglio, a pelota celular pode ser muito pequena para detectar pelo olho; uma pequena quantidade de supernasce pode ser deixada no tubo para evitar a remoção acidental da pelota celular.
7. Resuspend as células gangliônicas em 270 μL de soro bovino fetal (FBS, baixa endotoxina) e transfira cada suspensão célula-FBS em um criovial de 1 mL.
8. Para contar as células, misture 5 μL da suspensão celular gangliônica com 5 μL de 0,4% de corante azul trypan e carregue a mistura em um hemócito. Conte os números totais e de células vivas sob um microscópio.
   NOTA: A viabilidade celular (contagem de células vivas/contagem total de células = viabilidade %) é geralmente superior a 90% com este protocolo de dissociação. A contagem de células vivas de um único gânglio (SCG ou StG) geralmente cai dentro da faixa de 9.000-60.000 células quando o gânglio é isolado de um rato de 12 a 16 semanas.
9. Adicione 30 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO) a cada suspensão célula-FBS nos criovias, misture bem e transfira os criovials para um recipiente de congelamento celular, que é mantido à temperatura ambiente. Armazene o recipiente carregado criovial a -80 °C durante a noite e transfira os criovials para nitrogênio líquido no dia seguinte para preservação de longa data antes do sequenciamento.

5. Isolamento do núcleo

NOTA: O SCG esquerdo e direito isolado de quatro camundongos (no total de 8 amostras) foram utilizados como exemplo na seguinte preparação de isolamento e sequenciamento do núcleo. Mantenha tudo no gelo durante todo o procedimento. Devido à invisibilidade de pequenas pelotas de núcleo, uma centrífuga com baldes balançando é altamente recomendada para facilitar a remoção de supernascimento durante todo o procedimento.

1. Prepare tubos de 15 mL com um coador (30 μm) em cima e prerinse o coador com 1 mL do meio de gânglio.
2. Retire os criovials do nitrogênio líquido e descongele-os imediatamente em um banho de água a 37 °C. Quando uma pequena pelota de gelo é deixada no criovial, tire os criovials do banho de água.
3. Recupere as células gangliônicas soltando 1 mL do meio gânglio em cada criovial enquanto treme cuidadosamente à mão. Opcional: Para avaliar a recuperação celular, misture a suspensão celular após a recuperação e tire 5 μL de suspensão celular para contagem de células vivas, conforme descrito na etapa 4.8.
4. Carregue cada suspensão celular gangliônica em um coador separado (preparado na etapa 5.1) e enxágue cada coador com 4-5 mL de meio de gânglio.
5. Centrifugar a suspensão celular tensa por 5 min a 300 × g, remover o sobrenante cuidadosamente e resuspensar as células em 50 μL de tampão de lavagem celular.
6. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge de DNA/RNA de baixa ligação de 0,5 mL.
7. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min a 4 °C.
8. Remova 45 μL do supernasce sem tocar na parte inferior do tubo para evitar desalojar a pelota celular.
9. Adicione 45 μL de tampão de lysis refrigerado e pipeta suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
10. Incubar as células por 8 minutos no gelo.
11. Adicione 50 μL de tampão de lavagem de núcleo frio a cada tubo. Não misture.
12. Centrifugar a suspensão do núcleo a 600 × g por 5 min a 4 °C.
13. Remova 95 μL do supernante sem interromper a pelota do núcleo.
14. Adicione 45 μL de tampão de lavagem de núcleo refrigerado à pelota. Opcional: Tome 5 μL de suspensão do núcleo, misture com 5 μL de 0,4% de tripano azul para contar e verifique a qualidade dos núcleos sob um microscópio com um hemócito.
15. Centrifugar a suspensão do núcleo a 600 × g por 5 min a 4 °C.
16. Remova o supernatante sem tocar na parte inferior do tubo para evitar desalojar a pelota do núcleo.

6. Codificação de núcleo com hashtag oligos (HTOs) e multiplexing

NOTA: As etapas de coloração do HTO foram modificadas e otimizadas para rotulagem nuclear de quantidades muito baixas de núcleos (gangliônicos) de acordo com a aplicação anterior em tecido cortical por Gaublomme et ^al.15.

1. Adicione 50 μL de tampão ST-SB à pelota do núcleo, pipeta suavemente 8-10 vezes até que os núcleos estejam completamente ressuspendidos.
2. Adicione 5 μL de reagente de bloqueio de fc por 50 μL da mistura ST-SB/nuclei e incubar por 10 minutos no gelo.
3. Adicione 1 μL (0,5 μg) de anticorpo hashtag de núcleo único por tubo da mistura ST-SB/nuclei e incubar por 30 minutos no gelo.
   NOTA: O menor tempo de incubação leva a uma menor eficiência da rotulagem de hashtags, como demonstrado nos resultados representativos.
4. Adicione 100 μL de ST-SB a cada tubo. Não misture.
5. Centrifugar a suspensão do núcleo por 5 min, 600 × g a 4 °C.
6. Remova 145 μL do supernante sem interromper a pelota do núcleo.
7. Repita as etapas 6.4 e 6.5. Remova o supernatante o máximo possível sem tocar na parte inferior do tubo para evitar desalojar a pelota do núcleo.
8. Resuspenque a pelota do núcleo em 50 μL de ST-SB, e misture suavemente os núcleos.
9. Pegue 5 μL da suspensão do núcleo e misture-a com 5 μL de 0,4% de azul trypan para contar os núcleos sob um microscópio. Consulte a Figura 3A para obter uma imagem representativa de núcleos misturados com azul trypan e carregados em um hemótmetro.
10. Centrifugar a suspensão do núcleo por 5 min a 600 × g a 4 °C.
11. Resuspengem os núcleos em ST-SB para alcançar uma concentração de núcleo-alvo de 1.000-3.000 núcleos/μL para cada amostra de acordo com a contagem de núcleos correspondente.
12. Acumule as amostras para alcançar o número desejado de células.
    NOTA: Por exemplo, neste experimento, 8 amostras foram igualmente agrupadas para alcançar um total de 25.000 núcleos para prosseguir imediatamente para 10x Genômica Chromium e snRNA-seq depois. A contagem de núcleos geralmente fica dentro da faixa de 6.000-40.000 células quando o gânglio é isolado de um rato de 12 a 16 semanas. Apenas cerca de metade dos núcleos carregados totais podem ser capturados por snRNA-seq baseado em gotículas. Por exemplo, uma mistura de 25.000 núcleos foi preparada para garantir a captura de 10.000 núcleos, o que é necessário para uma preparação e sequenciamento da biblioteca.

Resultados

Análise de controle de qualidade da preparação da biblioteca cDNA de núcleo único e snRNA-seq
Os resultados representativos descrevem os resultados de sequenciamento de 10.000 núcleos capturados em um único pool com uma biblioteca de expressão genética de 25.000 leituras/núcleo e uma biblioteca de hashtags de 5.000 leituras/núcleos. A Figura 3B ilustra os resultados de controle de qualidade do CDNA de^1º fio, biblioteca de expressão genética (GEX) e biblioteca H...

Discussão

Aqui, descreve-se um protocolo detalhado que se concentra em i) a dissecção de gânglios cervicais superiores do camundongo adulto e gânglios simpáticos, ii) o isolamento e a criopreservação das células gânnicas, iii) isolamento do núcleo e iv) codificação de núcleos com rotulagem de HTO para fins multiplexais e snRNA-seq.

Com este protocolo, células gangliônicas simpáticas podem ser facilmente obtidas dissolvendo gânglios individuais usando trippsina e colagem comumente usadas. A preservação a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos químicos e reagentes
0,25% Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0,4% corante azul de tripano	Bio-Rad	1450021
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Colagenase tipo 2	Worthington	LS004176	usar 1.400 U/mL
Dimetilsulfóxido Sigma	Aldrich	67685
Etanol absoluto ≥ 99,5%	VWR	VWRC83813.360
Soro fetal bovino (baixa endotoxina)	Biowest	S1810-500
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Soro bovino Albumina 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Tampão de lavagem celular
DPBS (Ca2+, Mg2+free)	Gibco	14190-169	Tampão de lavagem celular
Solução de cloreto de magnésio, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Tampão de lise do núcleo
Substituto Nonidet P40 (detergente não iônico)	Sigma-Aldrich	74385	Tampão de lise do núcleo
Água livre de nuclease (não tratada com DEPC)	Tampão
de lise do núcleo Invitrogen AM9937Inibidor de RNase Protetora, 40 U/µ L	Sigma-Aldrich	3335399001	Tampão de lise de núcleo
Solução de cloreto de sódio, 5 M	Sigma-Aldrich	59222C	Tampão de lise de núcleo
Solução de cloridrato de Trizma, 1 M, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2194	Tampão de lise de núcleo
Albumina de soro bovino 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Lavagem de núcleo
DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free)	Gibco	14190-169	Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µ L	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Albumina de soro bovino 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Tampão de coloração ST (ST-SB)
Solução de cloreto de cálcio, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	Tampão de coloração ST (ST-SB)
Solução de cloreto de magnésio, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST tampão de coloração (ST-SB)
Água livre de nuclease (não DEPC tratado)	Tampão de coloração Invitrogen	AM9937	ST (ST-SB)
Solução de cloreto de sódio,	5M Sigma-Aldrich	59222C	ST (ST-SB)
Solução de cloridrato de Trizma, 1M, pH 7,4	Tampão de coloração Sigma-Aldrich	T2194	ST (ST-SB)
Tampão de coloração Tween-20	Merck Millipore	822184	ST (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anticorpo antinuclear Hashtag 1 anticorpo	Biolegend	682205	Hashtag anticorpo
TotalSeq-A0452 antinuclear Proteínas do complexo de poros Hashtag 2 Anticorpo	Biolegend	682207	Hashtag
TotalSeq-A0453 anticorpo antinuclear Hashtag 3 Anticorpo
Biolegend 682209 HashtagTotalSeq-A0461 anticorpo antinuclear Hashtag 11 anticorpo	Biolegend	682225	Hashtag anticorpo
TotalSeq-A0462 anticorpo antinuclear Hashtag 12	Biolegend	682227	anticorpo Hashtag
Proteínas anti-complexo de poros nucleares Hashtag 13	Biolegend	682229	anticorpo Hashtag
TotalSeq-A0464 anti-Proteínas do Complexo de Poros Nucleares Hashtag 14 Anticorpo	Biolegend	682231	Hashtag Anticorpo
TotalSeq-A0465 Anti-Nuclear Complexo de Poros Hashtag 15 Anticorpo	Biolegend	682233	Anticorpo Hashtag
TruStain FcX (humano)	Biolegend	422302	Solução de bloqueio do receptor
FCEquipamentos e consumíveis
Bright-Line  Hemacitômetro	Merck	Z359629-1EA
Centrífuga 5702/R A-4-38	Eppendorf
CoolCell LX Recipiente de congelamento de células	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0,5 mL Eppendorf tubo Eppendorf		EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm Não TC-tratado	de Petri Corning
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos	Fisher scientific	10773501
Forceps Dumont #5	Ferramentas de ciência fina	11252-40
Tesoura Fina Endurecida	Ferramentas de ciência fina	14091-09
Panela de gelo, retangular 4 L Orange	Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Microscópio Leica
Moria MC50 Tesoura	Ferramentas de ciências finas	15370-50
Tesoura de mola Noyes	Ferramentas de ciências finas	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Microscópio Olympus
P10	Gilson	F144802
P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
Filtros de Pré-separação (30 µ m)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Agitando banho-maria	GFL	1083
Placa de silicone	RubberBV	3530	Placa de dissecação
Software e pacotes
Cell ranger	V4.0.0
R programação	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverse	V1.3.1
Animals
B6. Camundongo Cg-Tg (Wnt1-cre) 2Sor / J	O	estoque JAX
B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Camundongo Luo / J	O	estoque JAX
camundongos C57BL / 6J	Charles River
Código para a análise de dados< / strong>