Fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole

Summary

O protocolo apresenta um fluxo de trabalho completo para experimentos de nanoindentação de materiais moles, incluindo hidrogéis e células. Primeiro, as etapas experimentais para adquirir dados de espectroscopia de força são detalhadas; em seguida, a análise de tais dados é detalhada através de um software Python de código aberto recém-desenvolvido, que é gratuito para download no GitHub.

Abstract

Nanoindentação refere-se a uma classe de técnicas experimentais em que uma sonda de força micrométrica é usada para quantificar as propriedades mecânicas locais de biomateriais e células moles. Esta abordagem ganhou um papel central nos campos da mecanobiologia, design de biomateriais e engenharia de tecidos, para obter uma caracterização mecânica adequada de materiais moles com uma resolução comparável ao tamanho de células individuais (μm). A estratégia mais popular para adquirir tais dados experimentais é empregar um microscópio de força atômica (AFM); enquanto este instrumento oferece uma resolução sem precedentes em força (até pN) e espaço (sub-nm), sua usabilidade é muitas vezes limitada por sua complexidade que impede medições rotineiras de indicadores integrais de propriedades mecânicas, como o Módulo de Young (E). Uma nova geração de nanoindenters, como aqueles baseados na tecnologia de detecção de fibra óptica, ganhou recentemente popularidade por sua facilidade de integração, permitindo aplicar forças sub-nN com resolução espacial μm, portanto, sendo adequado para sondar propriedades mecânicas locais de hidrogéis e células.

Neste protocolo, um guia passo-a-passo detalhando o procedimento experimental para adquirir dados de nanoindentação em hidrogéis e células usando um nanoindenter de detecção de fibra óptica ferrule-top comercialmente disponível é apresentado. Considerando que algumas etapas são específicas para o instrumento aqui utilizado, o protocolo proposto pode ser tomado como um guia para outros dispositivos de nanoindentação, desde que algumas etapas sejam adaptadas de acordo com as diretrizes do fabricante. Além disso, um novo software Python de código aberto equipado com uma interface gráfica de usuário amigável para a análise de dados de nanoindentação é apresentado, o que permite a triagem de curvas incorretamente adquiridas, filtragem de dados, computação do ponto de contato através de diferentes procedimentos numéricos, a computação convencional de E, bem como uma análise mais avançada particularmente adequada para dados de nanoindentação de célula única.

Introduction

O papel fundamental da mecânica na biologia está hoje estabelecido ^1,2. De tecidos inteiros a células únicas, as propriedades mecânicas podem informar sobre o estado fisiopatológico do biomaterial ^{investigado 3,4}. Por exemplo, o tecido mamário afetado pelo câncer é mais rígido do que o tecido saudável, conceito que é a base do popular teste de palpação⁵. Notavelmente, foi demonstrado recentemente que a doença do coronavírus 2019 (COVID-19) causada pelo coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) é sublinhada ....

Protocol

1. Preparação de substratos/células para medições de nanoindentação

1. Siga as etapas indicadas no Protocolo Complementar para a preparação de hidrogéis/células PAAm para experimentos de nanoindentação. O procedimento está resumido na Figura 2.
   NOTA: Os hidrogéis PAAm foram escolhidos por serem os hidrogéis mais comuns utilizados no campo da mecanobiologia. No entanto, o protocolo é igualmente aplicável a qualquer tipo de hidrogel²⁵ (ver Discussão, modificações do método).

2. Iniciando o dispositivo, a escolha da so....

Results

Seguindo o protocolo, obtém-se um conjunto de curvas F-z. O conjunto de dados provavelmente conterá boas curvas e curvas a serem descartadas antes de continuar com a análise. Em geral, as curvas devem ser descartadas se sua forma for diferente da mostrada na Figura 4A. A Figura 5AI mostra um conjunto de dados de ~100 curvas obtidas em um hidrogel PAAm macio de E 0,8 KPa³⁵ esperado carregado na GUI do NanoPrepare. A maior.......

Discussion

Este protocolo mostra como adquirir de forma robusta dados de nanoindentação por espectroscopia de força usando um nanoindenter de topo de ferrule comercialmente disponível em hidrogéis e células individuais. Além disso, instruções para o uso de um software de código aberto programado em Python compreendendo um fluxo de trabalho preciso para a análise de dados de nanoindentação são fornecidas.

Etapas críticas no protocolo
As etapas a seguir foram identificadas como de parti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lamínulas de 12 mm	VWR	631-1577P
Placas de cultura tratadas com células de 35 mm	Greiner CELLSTAR	627160
Acrilamida	Sigma-Aldrich	A4058
Acrilsilano	Alfa Aesar	L16400
Persulfato de amônio	Merk	7727-54-0
Bisacrilamida	Merk	110-26-9
Nanoindentador Chiaro	Optics 11 Life		sem número de catálogo
Etanol			geral
Soro fetal bovino	Gibco	16140071
Glicose elevada DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			geral
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Lâminas de vidro para microscópio	VWR	631-1550P
Sistema MilliQ	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferômetro	Optics11 Life		sem número de catálogo
Óptica 11 Sonda de vida (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 um)	Óptica 11 Vida		sem número de catálogo
Óptica 11 Sonda de vida (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 um)	Óptica 11 Vida		sem número de catálogo
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122
RainX repelente de chuva RainX		26012
Placas de Petri padrão (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetrametiletilenodiamina	Sigma-Aldrich	110-18-9
Dessecador de vácuo	Thermo Scientific	531-0250
Software
Software de aquisição de dados (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (opcional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (opcional)	Microsoft