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Artigo de método

Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

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DOI:

10.3791/63422

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28 de abril de 2022

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1Centre of Biosciences SAS, IABG, Bratislava, Slovakia, 2Center for Interdisciplinary Biosciences, University of Pavol Jozef Šafárik, Košice, Slovakia

Neste artigo

Resumo

A membrana corioalantóica (CAM) do embrião aviário é uma ferramenta muito útil e aplicável para várias áreas de pesquisa. Um modelo ex ovo especial de CAM de codorna japonesa é adequado para investigação de tratamento fotodinâmico.

Resumo

A membrana corioalantóica (CAM) de um embrião aviário é uma membrana fina e extraembrionária que funciona como um órgão respiratório primário. Suas propriedades o tornam um excelente modelo experimental in vivo para estudar angiogênese, crescimento tumoral, sistemas de liberação de drogas ou diagnóstico fotodinâmico (PDD) e terapia fotodinâmica (TFD). Ao mesmo tempo, este modelo aborda a exigência de substituição de animais experimentais por uma alternativa adequada. O embrião cultivado Ex ovo permite fácil aplicação, acesso, monitoramento e documentação de substâncias. O mais utilizado é o CAM de pintinhos; no entanto, este artigo descreve as vantagens da codorna japonesa CAM como um modelo de baixo custo e alto rendimento. Outra vantagem é o menor desenvolvimento embrionário, que permite maior rotatividade experimental. A adequação da CAM de codorna para PDD e PDT de câncer e infecções microbianas é explorada aqui. Como exemplo, descreve-se o uso do fotossensibilizador hipericina em combinação com lipoproteínas ou nanopartículas como sistema de entrega. O escore de dano das imagens em luz branca e as alterações na intensidade de fluorescência do tecido CAM sob luz violeta (405 nm) foram determinados, juntamente com a análise dos cortes histológicos. A CAM de codorna mostrou claramente o efeito da TFD sobre a vasculatura e o tecido. Além disso, alterações como hemorragia capilar, trombose, lise de pequenos vasos e sangramento de vasos maiores puderam ser observadas. A CAM de codorna japonesa é um modelo in vivo promissor para diagnóstico fotodinâmico e pesquisa terapêutica, com aplicações em estudos de angiogênese tumoral, bem como terapia antivascular e antimicrobiana.

Introdução

O modelo de membrana corioalantóica de frango (CAM) é bem conhecido e amplamente utilizado em várias áreas de pesquisa. É um órgão extraembrionário ricamente vascularizado que proporciona troca gasosa e transporte mineral1. Devido à transparência e acessibilidade dessa membrana, vasos sanguíneos individuais e suas alterações estruturais podem ser observados em tempo real2. Apesar das vantagens, o CAM de pintos também tem algumas limitações (por exemplo, instalações de reprodução maiores, produção de ovos e consumo de ração) que poderiam ser evitadas usando outras espécies aviárias. Neste protocolo, um modelo alternativo ex ovo CAM usando embrião de codorna japonesa (Coturnix japonica) é descrito. Devido ao seu pequeno tamanho, permite o uso de um número muito maior de indivíduos experimentais do que o CAM de frango. Além disso, o desenvolvimento embrionário mais curto de 16 dias dos embriões de codornas é outra vantagem. Os primeiros vasos maiores na CAM das codornas aparecem no dia embrionário (DE) 7. Isso pode ser diretamente comparado com o desenvolvimento do embrião de pintinho (estágios 4-35); no entanto, os estágios posteriores de desenvolvimento não são mais comparáveis e requerem menos tempo para o embrião de codorna3. De interesse é a ocorrência regular de ramificação microvascular semelhante à dos CAMs de frango 4,5,6. A rápida maturação sexual, a alta produção de ovos e a reprodução de baixo custo são outros exemplos que favorecem o uso desse modelo experimental7.

Um modelo de MAC aviário é frequentemente utilizado em estudos de terapia fotodinâmica (TFD)8. A TFD é usada para tratar várias formas de câncer (pequenos tumores localizados) e outras doenças não oncológicas. Seu princípio está na entrega de um fármaco fluorescente, um fotossensibilizador (PS), ao tecido danificado e sua ativação com luz do comprimento de onda apropriado. Uma PS prospectiva utilizada em pesquisa é a hipericina, originalmente isolada da erva medicinal de São João (Hypericum perforatum)9. Os fortes efeitos fotossensibilizantes deste composto são baseados em suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas. Estes são caracterizados por múltiplos picos de excitação por fluorescência na faixa de 400-600 nm, que induzem a emissão de fluorescência a cerca de 600 nm. Os máximos de absorção de hipericina dentro da banda espectral estão na faixa de 540-590 nm, e os máximos de fluorescência estão na faixa de 590-640 nm9. Para alcançar esses efeitos fotossensibilizantes, a hipericina é excitada pela luz do laser a um comprimento de onda de 405 nm após a administração local10. Na presença de luz, a hipericina pode apresentar efeitos virucidados, antiproliferativos e citotóxicos11, enquanto não há toxicidade sistêmica e é rapidamente liberada do organismo. A hipericina é uma substância lipofílica que forma agregados não fluorescentes insolúveis em água, razão pela qual vários tipos de nanocarreadores, como nanopartículas poliméricas12,13 ou lipoproteínas de alta e baixa densidade (HDL, LDL)14,15, são utilizados para auxiliar sua entrega e penetração nas células. Como a CAM é um sistema naturalmente imunodeficiente, as células tumorais podem ser implantadas diretamente na superfície da membrana. O modelo também é adequado para registrar a extensão do dano vascular induzido por TFD de acordo com um escore definido16,17. Luz de menor intensidade em comparação com a TFD pode ser utilizada para o diagnóstico fotodinâmico (TGD). O monitoramento do tecido sob excitação violeta da luz LED também leva à fotoativação de fotossensibilizadores18,19,20 que resulta em uma emissão de luz fluorescente, mas não fornece energia suficiente para iniciar uma reação PDT e danificar as células. Torna-se uma boa ferramenta para visualização e diagnóstico de tumores ou monitoramento da farmacocinética dos PSs utilizados14,15.

Este artigo descreve a preparação do ensaio de codorna ex ovo CAM com taxas de sobrevivência superiores a 80%. Esta cultura ex ovo foi aplicada com sucesso em um grande número de experimentos.

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Protocolo

A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os equipamentos e reagentes devem ser autoclavados ou esterilizados com etanol a 70% ou luz UV.

1. Incubação de ovos

  1. Armazenar ovos de codorna fertilizados a 10-15 °C por um máximo de 4-5 dias antes de iniciar a incubação. Use apenas ovos limpos e não danificados.
  2. Incube os ovos em uma incubadora de tração forçada por ~ 53-54 h. Coloque os ovos horizontalmente com a rotação do ovo desligada, a 50%-60% de umidade e temperatura de incubação de 37,5 °C.

2. Preparação ex ovocultura

NOTA: Após a incubação inicial, os ovos são adequados para iniciar o cultivo ex ovo.

  1. Desinfete a superfície do ovo com etanol a 70%, sem girar o ovo.
  2. Em um armário de fluxo laminar estéril, abra a casca do ovo usando uma pequena tesoura cirúrgica estéril e transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 6 poços. Se feito corretamente, o embrião ficará em cima de uma gema não danificada. Após cada ovo, desinfete a tesoura com etanol a 70%.
  3. Adicione aproximadamente 5 mL de água estéril às lacunas na placa de 6 poços, pois a umidade é essencial para evitar que o CAM seque.
  4. Coloque os embriões em uma incubadora até novos experimentos, mantendo uma temperatura de 37 °C e 80%-90% de umidade.
  5. Quando o CAM estiver totalmente desenvolvido (a partir de ED7), coloque um anel de silicone esterilizado (6 mm de diâmetro e aproximadamente 1,5 mm de espessura) na superfície do CAM, ao longo dos pequenos capilares. Evite os principais vasos sanguíneos ao colocar o anel.
    NOTA: O anel define o espaço de trabalho, ajuda a marcar o local de aplicação da substância e impede que o conteúdo do líquido vaze.
  6. Encerrar o cultivo dos embriões de acordo com a legislação do país.
  7. É importante ressaltar que use luvas ou mantenha as mãos desinfetadas com etanol a 70% durante o trabalho. Aspirar embriões inadequadamente inclinados ou ovos não fertilizados com um aspirador a vácuo.

figure-protocol-1
Figura 1: Preparação ex ovocultura . A) Ovos de codorna japonesa tal como são armazenados e incubados. (B) Desinfecção da superfície do ovo com etanol. (C) A casca do ovo é cortada com uma tesoura. (D) O conteúdo do ovo é esvaziado no poço. (E) Embrião de 3 dias de idade devidamente preparado, com vasculatura CAM em desenvolvimento. (F) Placas de cultura armazenadas em incubadora. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Placa de cultura de 6 poços com embriões e anéis de silicone colocados no topo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Inoculação de células tumorais

NOTA: Todos os procedimentos requerem o uso de um gabinete de fluxo laminar estéril.

  1. Cultivar diferentes tipos de células aderentes em frascos de acordo com os respectivos protocolos de cultura.
    1. Retirar o meio velho dos frascos e enxaguar a camada celular com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover vestígios do meio.
    2. Após a tripsinização, inibir a tripsina adicionando o meio de cultura e colher as células em tubos de centrífuga. Centrifugar as células e ressuspender o pellet celular em um meio de cultura fresco. Conte as células e ressuscite-as em um meio de cultura celular na concentração desejada.
      NOTA: Também é possível produzir culturas de células 3D, ou seja, esferoides utilizando, por exemplo, o método da queda suspensa21.
  2. Implante 1 x 10 5-1 x 106 células tumorais ou5-15 esferoides (por CAM) em 30 μL de solução de meio celular no anel de silicone no topo do CAM.
    NOTA: O volume depende do tamanho do anel de silicone utilizado. Se um anel de silicone com um diâmetro maior é usado, um volume maior é necessário para cobrir toda a área. Dependendo do tipo de célula, ou para diferentes tipos de experimentos, várias concentrações celulares podem ser usadas. Às vezes, a raspagem fina de CAM é usada para melhorar a adesão das células incorporadas.
  3. Devolver os CAMs com células inoculadas à incubadora (37 °C e 80%-90% de umidade).

figure-protocol-3
Figura 3: Inoculação da MAC com tumores . (A) Aspiração de esferoides com pipeta e (B) implantação na superfície da CAM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Aplicação do fotossensibilizador

  1. Aplicação de hipericina
    1. Sob iluminação fraca, prepare uma solução-mãe de hipericina a 2 mM, dissolvendo-a em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar uma solução de trabalho de 79 μM de hipericina pouco antes do experimento com PBS estéril ou solução salina. Garantir que a concentração final de DMSO em todas as soluções seja sempre inferior a 0,2%, o que não afeta o desenvolvimento do embrião.
    2. Em condições estéreis, aplique um volume apropriado de solução de hipericina no anel de silicone. Um volume de 30 μL é suficiente para encher um anel com um diâmetro de 6 mm.
    3. Mantenha os embriões em uma incubadora a 37 °C e 80% a 90% de umidade. A hipericina em solução aquosa é fotoativa após sua monomerização no tecido, aproximadamente 3 h após sua aplicação no CAM.
  2. Aplicação de hipericina com LDL, HDL ou nanopartículas como sistemas de transporte
    NOTA: Estes sistemas de transporte são utilizados para melhorar a penetração da hipericina nas células e estruturas celulares.
    1. Devido à fotossensibilidade, execute todas as etapas, incluindo a preparação das soluções, sob iluminação fraca e armazene as soluções no escuro.
    2. Preparar as formulações de hipericina-LDL e hipericina-HDL misturando volumes apropriados de lipoproteínas e soluções-estoque de hipericina em PBS de acordo com a referência15. A concentração de LDL ou HDL em hipericina é de 20:115.
    3. Sintetizar nanopartículas poliméricas por polimerização catiônica viva de abertura de anel de acordo com as referências12,13. Ajustar a concentração de hipericina em nanopartículas poliméricas com PBS para 10 μM12,13.

5. PDD e PDT

  1. Conduta PDD
    1. Em condições estéreis, aplique fotossensibilizador (hipericina, nanopartículas poliméricas carregadas de hipericina ou hipericina com portador de lipoproteínas) na superfície da CAM, com ou sem células tumorais (DE 7-9).
    2. Iluminar o CAM usando luz de excitação violeta (luz LED circular personalizada de comprimento de onda de 405 nm) e registrar a fluorescência da hipericina no tecido CAM e células tumorais com uma câmera digital em intervalos de tempo de 0, 1, 3, 5, 24 e 48 h após a administração de hipericina.
    3. Se a pesquisa exigir uma imagem da CAM em luz branca, registre a CAM antes da administração de hipericina e no final do experimento, pouco antes da fixação tecidual, pois a luz afeta a fotoativação da hipericina.
    4. Avalie a intensidade de fluorescência usando um programa de processamento e análise de imagem (por exemplo, ImageJ22).
      1. Divida os canais de imagem RGB em imagens vermelhas, verdes e azuis separadas. Analise a imagem de intensidade vermelha em formato de 8 bits. Avalie a intensidade vermelha da área dentro do anel e aproxime-a como a fluorescência da hipericina. Obtenha gráficos de perfil de imagem inteiros (usando o plug-in Profile Plot do ImageJ) em diferentes intervalos de tempo após a administração de hipericina (ou seja, a partir de 0 h, logo após a administração, até 48 h).
  2. Realizar PDT
    1. Realizar a TFD pelo menos 3 h após a aplicação de hipericina.
    2. Coloque a fibra óptica acima da superfície do CAM para que o raio laser cubra toda a área dentro do anel de silicone.
    3. Realizar irradiação in vivo (1-2 min) com uma luz laser de 405 nm a uma taxa de fluência de 285 mW/cm2.
    4. Registrar CAM usando luz branca e luz fluorescente de 405 nm antes e após o tratamento fotodinâmico (24 h e 48 h).
    5. Detectar fotodanos 24 h e 48 h após PDT a partir das imagens tiradas em luz branca. Avaliar o dano vascular por um escore semiquantitativo16: 1 - sem destruição; 2 - fechamento parcial dos capilares (diâmetro ≤10 μm) sem destruição de vasos médios ou maiores (diâmetro ≥50 μm) e menores (diâmetro 10-50 μm); 3 - fechamento parcial de vasos menores com desaparecimento capilar; 4 - fechamento parcial de vasos maiores com vasos menores e desaparecimento capilar; e 5 - trombose fotográfica total com a maioria dos vasos desaparecendo.

figure-protocol-4
Figura 4: Tratamento da MAC com luz laser. Esta foto foi tirada para fins ilustrativos. Para PDD ou PDT, a sala deve estar escura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Preparação do CAM para uma avaliação mais aprofundada

  1. Incorporação de parafina
    1. Fixar o tecido CAM em uma placa de cultivo com paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS por um período mínimo de 2 h e máximo durante a noite.
    2. Remova o PFA e corte cuidadosamente do CAM uma parte do tecido dentro do anel de silicone.
    3. Desidrate imediatamente o tecido CAM em séries de álcool ascendentes da seguinte forma. Coloque o tecido CAM em etanol a 70% por 3 min, solução de eosina por 2 min (para facilitar a localização do tecido no bloco de parafina), etanol a 96% por 3 x 5 min (sempre em uma nova placa de Petri) e etanol a 100% por 5 min e xileno por 2 x 10 min.
    4. Com uma espátula ou uma escova fina, transferir as amostras o mais rapidamente possível para a parafina dissolvida em placas de Petri (59 °C). Após 24 h, coloque o tecido no molde histológico, preencha-o com meio de incorporação de parafina e deixe-o solidificar na geladeira. Corte o CAM solidificado do meio de incorporação, vire-o na bandeja em 90°, preencha-o novamente com o meio de incorporação e deixe-o solidificar.
    5. Prepare seções de 5-10 μm em um micrótomo para análise histopatológica para determinar o dano induzido por TFD.
  2. Preparação de seções CAM congeladas para histologia
    NOTA: Para algumas metodologias, incluindo histologia, as seções congeladas preparadas em micrótomo criostato são mais adequadas. Siga as etapas abaixo para preparar as seções CAM congeladas.
    1. Monte cuidadosamente o CAM nativo ou fixado em paraformaldeído a 4% na lâmina de vidro.
    2. Encha o molde de incorporação até a metade com composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele em nitrogênio líquido ou uma mistura de gelo seco e etanol.
    3. Após o congelamento, incline e deslize cuidadosamente o CAM da lâmina de vidro para a parte superior do meio OCT congelado. Colocar novamente no molde, cobrir com o meio OCT e congelar como na Etapa 6.2.2.
  3. Análise fractal da CAM de codornas
    NOTA: As alterações de vasculatura causadas pela TFD podem ser avaliadas pelo cálculo do coeficiente de dimensão fractal19.
    1. No gabinete de fluxo laminar, transbordar CAM em uma placa de cultivo com uma solução de fixação pré-aquecida (37 °C) de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em PBS.
    2. Retirar a solução de fixação após 48 h. Separe cuidadosamente o CAM do embrião com microtesouras e uma escova fina e lave-o em PBS.
    3. Monte o CAM lavado em uma lâmina de vidro e deixe secar lentamente.
    4. Fotografe o slide usando uma câmera digital e um transiluminador como fonte de luz branca homogênea.
    5. Processe imagens digitais usando o software ImageJ22. Para a análise, selecione uma região quadrada (512 × 512 pixels) da área com ramos arteriais distais. Binarize e esqueletizar as imagens e calcular o coeficiente de dimensão fractal (Df) seguindo os procedimentos descritos na referência31.
  4. Análise molecular do tecido CAM
    1. Para análise molecular, separe cuidadosamente o CAM nativo, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
    2. Determinar a expressão gênica de acordo com protocolos padrão para isolamento de RNA23, transcrição reversa em cDNA e PCR quantitativa24.

figure-protocol-5
Figura 5: Tecido CAM para análise fractal. Após a TFD, o CAM é fixo, montado em uma lâmina e seco para análise fractal. A foto foi tirada em luz branca usando um transiluminador. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

A localização do tumor na superfície CAM é difícil na luz branca. Espera-se que o fotossensibilizador (aqui, hipericina) usado no PDD seja absorvido seletivamente pelo tumor e ajude a visualizar o tumor. A adição de hipericina e o uso de luz fluorescente (por exemplo, 405 nm) mostraram a posição muito bem do tumor (carcinoma espinocelular TE1) (Figura 6A). A análise histológica mostrou células tumorais vitais invadindo tecidos saudáveis. Estruturas concêntricas de células escamosas anormais,...

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Discussão

Para um cultivo ex ovo bem-sucedido, é importante seguir o protocolo acima. Além disso, se os ovos não forem abertos com cuidado suficiente ou se houver umidade insuficiente durante o cultivo, o saco de gema gruda na casca e muitas vezes se rompe. O início de um cultivo ex ovo no momento de cerca de 60 h de incubação dos ovos garante a alta taxa de sobrevivência dos embriões, pois eles já são grandes o suficiente para sobreviver ao manuseio. Nos estágios posteriores de desenvolvimento, a CAM torna-se ma...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pela VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. A contribuição de V. Huntošová é o resultado da implementação do projeto: Comunidade científica aberta para a investigação interdisciplinar moderna em medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoiada pelo Programa Operacional Infraestrutura Integrada, financiado pelo FEDER.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura de células de 6 poçosSarstedt83.392Poliestireno transparente, estéril
Incubadora de CO2 ESCO CCL-0508ESCO, CingapuraCCL-050B-8CO2 incubadora de cultura de células
criocorte Leica CM 1800Reichert-Jung, EUA
câmera digital Canon EOS 6D IICanon, Japão
laser de diodo 405 nmOcean Optics, EUA
DMSOSigma-Aldrich67-68-5dimetil sulfoxid
eosinaSigma-Aldrich15086-94-9
etanolSigma-Aldrich64-17-5
pincel fino tamanho 2Faber-Castell281802escova para separação e manipulação CAM
glutaraldeídoSigma-Aldrich111-30-8
hematoxilinaSigma-Aldrich517-28-2
hipericinaIncubadora Sigma-Aldrich84082-80-4
Bios MidiBios Sedlfigure-materials-1any, RepúblicaIncubadora de tiragem forçada para incubadora de incubação inicial
Memmert IF160Memmert, AlemanhaIncubadora de circulação de ar forçado para incubação CAM
Kaiser slimlite plano, caixa de luz LEDKaiser, Alemanha2453Transiluminador
Luz LED 405 nmluz LED circular feita sob medida
lente macro Canon MP- E 65 mm f/ 2.8Canon, Japão
microscópio Kapa 2000Kvant, Eslováquiamicroscópio óptico
micrótomo Auxilab 508Auxilab, Espanhamicrótomo rotativo manual
paraformaldeídoSigma-Aldrich30525-89-4
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683meio parafina para incorporação de tecidos
PBStampão de fosfato salinaSigma-AldrichP4417
CastroviejoOrimed  OR66-108micro tesoura para software de separação CAM
ImageJ 1.53programa de processamento e análise de imagemde domínio
solução de estoque HDLSigma-Aldrich437641-10MGlipoproteínas de alta
densidade solução de estoque LDLSigma-Aldrich437644-10MGlipoproteínas de baixa densidade
Tissue-Tek OCT CompostoSakura Finetek4583Composto de temperatura de corte ideal Frascos de aperto de 118 mL
Tcheca Tesoura de público

Referências

  1. Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
  2. van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
  3. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3(2010).
  4. De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
  5. Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
  6. Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
  7. Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
  8. Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
  9. Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
  10. Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
  11. Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
  12. Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
  13. Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
  14. Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
  15. Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
  16. Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
  17. Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
  18. Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
  19. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
  20. Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
  21. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).
  22. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  24. Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
  25. Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
  26. Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
  27. Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
  28. Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
  29. Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
  30. Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301(2021).
  31. Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
  32. Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).

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