Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.
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Artigo de método
Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A poluição ambiental é um problema crescente, e identificar fungos envolvidos no processo de bioremediação é uma tarefa essencial. O solo abriga uma incrível diversidade de vida microbiana e pode ser uma boa fonte desses fungos bioremediativos. Este trabalho tem como objetivo buscar fungos do solo com potencial de bioremediação utilizando diferentes testes de triagem. A mídia de cultura mineral complementada com substâncias recalcitrantes como única fonte de carbono foi usada como teste de crescimento. Primeiro, as diluições do solo foram banhadas em placas de Petri com meio mineral alterado com ácidos húlicos ou lignocelulose. As colônias fúngicas em crescimento foram isoladas e testadas em diferentes substratos, como misturas complexas de hidrocarbonetos (petrolatum e óleo de motor usado) e pós de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Testes enzimáticos qualitativos estiveram associados aos testes de crescimento para investigar a produção de esterases, laccases, peroxidases e proteases. Essas enzimas estão envolvidas nos principais processos de degradação do material recalcitrante, e sua secreção constitutiva pelas cepas fúngicas examinadas poderia ter o potencial de ser explorada para a bioremediação. Mais de 100 cepas foram isoladas e testadas, e vários isolados com bom potencial de bioremediação foram encontrados. Em conclusão, os testes de triagem descritos são um método fácil e de baixo custo para identificar cepas fúngicas com potencial de bioremediação do solo. Além disso, é possível adequar os testes de triagem para diferentes poluentes, de acordo com as exigências, adicionando outras substâncias recalcitrantes aos meios de cultura mínimos.
Introdução
O solo é um componente fundamental da vida na Terra e é a base de muitos ecossistemas. Os minerais, matéria orgânica e microrganismos no solo podem ser considerados como um sistema, com associações próximas e interações ocorrendo entre eles. As interações desses compostos têm um impacto importante nos processos terrestres, na qualidade ambiental e na saúde do ecossistema1. A poluição do solo apresenta sérios problemas ambientais em todo o mundo. A aplicação indiscriminada, a longo prazo e excessiva de substâncias recalcitrantes e tóxicas, como pesticidas, produtos petrolíferos, plásticos e outros produtos químicos, tem efeitos sérios na ecologi....
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Protocolo
1. Seleção de cepas fúngicas capazes de degradar materiais recalcitrantes do solo
- Preparação de solução antibiótica.
- Coloque penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clorofitracíclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) e clorofifenicol (100 mg/L) em 250 mL de água estéril desionizada.
- Antes de adicionar clororamfenicol à solução antibiótica, dissolva-o em 3 mL de ≥99% de etanol.
- Coloque a solução de antibióticos em um agitador magnético (sem calor) com uma barra de agitação magnética dentro da solução por 10 minutos. Armazene a 4 °C.
- Preparação da mídia de crescimento.
- Coloque 1....
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Resultados
Os métodos de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) permitiram a triagem da rica biodiversidade do solo e os fungos com alto potencial de bioremediação. Com o ácido húlico e a mídia lignocelulose, mais de 100 cepas fúngicas foram isoladas. Esses fungos produziram enzimas envolvidas na biodegradação de materiais recalcitrantes naturais, que possuem uma estrutura química semelhante a muitos poluentes. No entanto, as cepas fúngicas isoladas com as mídias seletivas precisavam de uma triagem adicional. Especificamente, os tes.......
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Discussão
A rica biodiversidade do solo é uma fonte abundante de fungos que possuem inúmeras habilidades metabólicas, algumas das quais podem ser potenciais candidatas à bioremediação. Testes de mídia seletiva (Seção 1 do protocolo) são métodos fáceis de executar e eficazes para isolar fungos capazes de crescer em polímeros complexos naturais como sua única fonte de carbono. Fungos podem produzir hidrolases extracelulares, não específicas e oxidoreductases30 , como as enzimas ligninolíticas laccases e perox.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos a Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) da Universidade de Pavia e o Professor Solveig Tosi por proporcionarem a oportunidade para este trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 96 micropoços | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Caldo Bushnell-Haas | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Cloroanfenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Clortetraciclina | Sigma-Aldrich | ||
| CoCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Etanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3· 6H2O | 236489 | Sigma-Aldrich | |
| 0.2 µ m | Whatman | 10462200 | |
| ácido gálico | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Lamínulas de vidro | Biosigma | VBS634 | |
| Frascos de vidro 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| Polietileno de alta densidade (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Ácidos húmicos | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocelulose | / | / | Resíduos da produção de bioetanol esterilizado |
| Espalhador de células em forma de L | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| agitador magnético | A.C.E.F | 8235 | |
| Caldo de Extrato de Malte | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4· Micropipeta 7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 1000 μ Micropipeta L | Gilson | FA10006M | |
| 200 μ L | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2· 4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4· 2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomicina | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicilina | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptona | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polietileno tereftalato (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Placas de Petri | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolato (líquido de parafina) | A.C.E.F | ||
| Caldo de batata dextrose | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Poliestireno (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Poliuretano (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Policloreto de vinila ( PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Tubo de falcão estéril | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Frascos de vidro estéreis 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Ponto estéril 1000 μ L | Gilson | F172511 | |
| Ponto estéril 200 μ L | Gilson | F172311 | |
| Sacos de polietileno estéril | WHIRL-PAK | B01018 | |
| seringa estéril | Rays | 5523CM25 | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Óleo de motor usado | / | / | mistura complexa de hidrocarbonetos, aditivos para motores e metais, fornecida por uma empresa privada italiana |
| Frascos 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
Referências
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S.
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Reimpressões e permissões
