Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

Solos naturais são habitados por um número surpreendente de micróbios que podem ser neutros, prejudiciais ou benéficos para as plantas¹. Muitos patógenos vegetais são transportados pelo solo, cercam as raízes e atacam o órgão subterrâneo. Esses microrganismos pertencem a uma grande variedade de clados: fungos, oomycetes, bactérias, nematoides, insetos e alguns vírus ^1,2. Uma vez que as condições ambientais favoreçam a infecção, as plantas suscetíveis se tornarão doentes e a produção de culturas diminuirá. Os efeitos das mudanças climáticas, como o aquecimento global e os extremos climáticos, aumentarão a proporção de patógenos vegetais transportados pelo solo³. Portanto, será cada vez mais importante estudar esses micróbios destrutivos e seu impacto na produção de alimentos e rações, mas também nos ecossistemas naturais. Além disso, há mutualistas microbianos no solo que interagem firmemente com raízes e promovem o crescimento, o desenvolvimento e a imunidade das plantas. Quando confrontadas com patógenos, as plantas podem recrutar ativamente oponentes específicos na rizosfera que podem suportar a sobrevivência do hospedeiro suprimindo patógenos 4,5,6,7. No entanto, detalhes mecanicistas e caminhos envolvidos em interações benéficas entre micróbios radiculares ainda são desconhecidos⁶.

É, portanto, essencial ampliar a compreensão geral das interações raiz-micróbios. Métodos confiáveis para inocular raízes com microrganismos transportados pelo solo são necessários para realizar estudos de modelo e transferir os achados para aplicações agrícolas. Interações benéficas no solo são estudadas, por exemplo, com serndipita indica (anteriormente conhecida como Piriformospora indica), fixação de nitrogênio Rhizobium spp., ou fungos micorrizais, enquanto os patógenos vegetais suportados pelo solo incluem Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., e Verticillium spp.1. Os dois últimos são gêneros fúngicos que são distribuídos globalmente e causam doenças vasculares². Verticillium spp. (Ascomycota) pode infectar centenas de espécies vegetais - em grande parte dicotyledons, incluindo anuários herbáceos, perenes lenhosos e muitas plantas^{agrícolas 2,8}. A hifa de Verticillium entra na raiz e cresce intercelularmente e intracelularmente em direção ao cilindro central para colonizar os vasos xilema ^2,9. Nestes vasos, o fungo permanece durante a maior parte de seu ciclo de vida. Como a seiva de xilema é pobre em nutrientes e carrega compostos de defesa vegetal, o fungo deve se adaptar a este ambiente único. Isso é feito pela secreção de proteínas relacionadas à colonização que permitem que o patógeno sobreviva em seu^{hospedeiro 10,11}. Depois de atingir a vasculatura raiz, o fungo pode se espalhar dentro dos vasos xilem acropetalmente para a folhagem, o que leva à colonização sistêmica do hospedeiro ^9,12. Neste ponto, a planta é afetada negativamente no crescimento^{de 9,10,13}. Por exemplo, a desnutrição e as folhas amarelas ocorrem, bem como a senescência prematura 13,14,15,16.

Um membro desse gênero é o Verticillium longisporum, que é altamente adaptado aos hospedeiros brassicaceos, como o estupro da oleosa agronomicamente importante, a couve-flor e a planta modelo Arabidopsis thaliana¹². Vários estudos combinaram V. longisporum e A. thaliana para obter extensas percepções sobre doenças vasculares transmitidas pelo solo e as respostas de defesa raiz resultantes 13,15,16,17. Testes de suscetibilidade simples podem ser realizados usando o sistema modelo V. longisporum / A. thaliana e recursos genéticos bem estabelecidos estão disponíveis para ambos os organismos. Intimamente relacionado com V. longisporum é o patógeno Verticillium dahliae. Embora ambas as espécies fúngicas realizem um processo de vida vascular semelhante e de invasão, sua eficiência de propagação de raízes para folhas e os sintomas da doença provocada em A. thaliana são diferentes: enquanto V. longisporum geralmente induz senescência precoce, a infecção por V. dahliae resulta em murchar¹⁸. Recentemente, um resumo metodológico apresentou diferentes estratégias de inoculação radicular para infectar A. thaliana com V. longisporum ou V. dahliae, auxiliando no planejamento de configurações experimentais¹⁹. No campo, V. longisporum ocasionalmente causa danos significativos na produção de estupro da oleosa¹², enquanto V. dahliae tem uma gama hospedeira muito ampla composta por várias espécies cultivadas, como videira, batata e tomate⁸. Isso torna ambos os modelos economicamente interessantes para estudar.

Assim, os protocolos a seguir usam v . longisporum e V. dahliae como patógenos radiculares modelo para exemplificar possíveis abordagens para inoculações radiculares. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), estupro de oleosa (Brassica napus) e tomate (Solanum lycopersicum) foram escolhidos como hospedeiros modelo. Descrições detalhadas das metodologias podem ser encontradas no texto abaixo e no vídeo que acompanha. São discutidas vantagens e desvantagens para cada sistema de inoculação. Em conjunto, essa coleção de protocolos pode ajudar a identificar um método adequado para questões específicas de pesquisa no contexto de interações root-micróbios.

1. Mídia para culturas fúngicas e sistemas de inoculação de plantas

1. Caldo de desxtrose de batata líquida (PDB): Prepare 21 g/L PDB em água ultrapura em um frasco estável a calor.
2. Caldo líquido Czapek Dextrose (CDB): Prepare 42 g/L CDB em água ultrauso em um frasco estável a calor.
3. Meio para o sistema de inoculação da placa de Petri: Prepare um frasco estável a calor com 1,5 g/L Murashige e Skoog médio (MS) e 8 g/L de ágar em água ultrauso.
   NOTA: Evite o açúcar neste meio, pois levará ao crescimento fúngico excessivo após a inoculação.
4. Meio para o sistema de inoculação à base de copos plásticos: Prepare um frasco estável a calor com 4,4 g/L MS, 0,2 g/L MgSO₄, 1 g/L KNO₃, 0,5 g/L 2-(N-morpholino)ácido esulfônico (MES) e 6,0 g/L de ágar em água ultrauso e ajustar pH a 5,7 com 5 M KOH.
   NOTA: Evite o açúcar neste meio, pois levará ao crescimento fúngico excessivo após a inoculação.
5. 1/4 MS médio: Prepare 1,2 g/L MS em água ultrapura.
6. Use a autoclave para esterilizar todas as soluções acima. Coloque os frascos de vidro na cesta, feche a tampa e esterilize por 15 min a 121 °C e 98,9 kPa.

2. Esterilizando a superfície das sementes vegetais

NOTA: Use sempre o protocolo abaixo para esterilizar a superfície das sementes da Arabidopsis, estupro da oleosa e tomate antes da semeadura.

1. Transfira as sementes para um tubo de reação de 2 mL. Coloque o tubo em um exsiccator com uma capacidade interna de 5,8 L.
2. Gere gás cloro no exsiccator adicionando 6 mL de ácido clorídrico (HCl) em 100 mL de hipoclorito de sódio aquoso de 12% (NaClO).
3. Feche imediatamente a tampa da exsiccator e incuba as sementes por 3h no gás.

3. Preparando o inóculo com esporos de Verticillium (conidia derivada assexual)

NOTA: Cultivar V. dahliae (cepa JR2) da mesma forma que V. longisporum (cepa Vl43)17,18,19. Certifique-se de que todos os equipamentos e mídias estão livres de germes e que todas as etapas sejam executadas em um capô de fluxo laminar para manter o machado inóculo.

1. Encha 150 mL de PDB líquido (etapa 1.1) em um frasco de chicanaria de 500 mL e suplemente o médio com 500 mg/L cefotaxime.
2. Adicione Verticillium conida do armazenamento de glicerol ao meio PDB. Feche o frasco com uma rolha de espuma estéril.
3. Incubar a cultura por 7-10 dias em uma caixa escura à temperatura ambiente (RT) sob agitação contínua e horizontal (agitador rotativo; 60 rpm). Isso resulta em pequenas esferas de micélia branca.
4. Remova e descarte cuidadosamente o supernatante PDB. A maior parte da micélio deve permanecer no frasco.
5. Adicione 100 mL de CDB líquido (etapa 1.2) na micélia no frasco chicâneo e suplemente o médio com 500 mg/L cefotaxime.
6. Incubar mais 4-5 dias em uma caixa escura na RT sob agitação contínua e horizontal (agitador rotativo, 60 rpm) para induzir a esporulação. O supernatante ficará amarelado-acinzento à medida que a conídia for liberada.
7. Filtre uma porção (5-10 mL) do líquido contendo conidia através de um papel filtro (nível de retenção de partículas de 8-12 μm) em um tubo de coleta estéril de 50 mL. Isso separa esporos da micélia.
8. Determine a concentração de esporos usando uma câmara de contagem de células e um microscópio. Diluir com meio de 1/4 MS sem germes em água ultrapura até que as concentrações de esporos dadas abaixo sejam obtidas.
   NOTA: Sob o microscópio, as conidia de V. longisporum são em sua maioria desenhadas longamente e 7,1-8,8 μm de tamanho, enquanto V. dahliae conidia são mais curtas (3,5-5 μm) e bastante^{esféricas 20}.
9. Use essas conidia recém-colhidas como inóculo. Certifique-se de realizar os experimentos sempre com conidia recém-colhida e não com estoques congelados, pois o congelamento reduz significativamente o número de esporos viáveis¹⁹.
10. Para armazenamento a longo prazo, congele os esporos como solução de esporos concentrados (aproximadamente 1 x 10⁸ esporos/mL) em 25% de glicerol a -80 °C (armazenado até 1 ano). Para os próximos experimentos, use esses estoques de glicerol para inocular o meio PDB na etapa 3.2.

4. Um sistema de inoculação in vitro estéril baseado em placas de Petri

NOTA: Para o sistema de placas de Petri¹⁷, certifique-se de que todos os equipamentos e mídias são livres de germes e que todas as etapas sejam realizadas em um capô de fluxo laminar.

1. Depois de autoclavar, despeje o meio (ver passo 1.3) em pratos de Petri.
2. Após o endurecimento do meio, reembale as placas de Petri em um saco plástico estéril e guarde-as de cabeça para baixo durante a noite na geladeira (4-10 °C). Um meio refrigerado ajuda a evitar o deslizamento do meio nos próximos passos.
3. Corte e remova um canal de infecção e o terço superior do meio solidificado com um bisturi (Figura 1A). Evite obter líquido ou ar sob o meio ágar durante o corte; caso contrário, o meio escorregará e fechará o canal de infecção.
4. Distribua 50-100 sementes arabidopsis esterilizadas pela superfície com uma ponta de pipeta estéril na superfície superior cortada. Coloque as sementes no ângulo onde a superfície do ágar cortada entra em contato com a parede da placa de Petri para que as raízes possam crescer entre o meio e a parede da placa de Petri. Isso facilitará a inoculação mais tarde.
5. Feche as placas de Petri e seque-as com fita adesiva permeável a ar para permitir a troca de gás.
6. Após a estratificação por 2 dias na escuridão a 4 °C, coloque as placas verticalmente em um rack adequado e cresça as plantas a 22 °C ± 1 °C em condições de longo dia (16h de luz / 8h de escuridão) em uma câmara de crescimento.
7. Quando a maioria das raízes chegar ao canal de infecção (cerca de 9-11 dias de idade, colocar as placas horizontalmente, abri-las e adicionar 500 μL de conidia verticillium recém-colhida com uma concentração de 4 x 10⁵ esporos/mL diretamente no canal de infecção, certificando-se de que o líquido seja distribuído uniformemente no canal.
8. Da mesma forma, prepare as placas de controle adicionando 500 μL de uma solução simulada em vez de esporos (meio de 1/4 MS sem germes).
9. Incubar as placas horizontalmente por alguns minutos até que o líquido esteja encharcado e não possa vazar quando as placas estiverem configuradas verticalmente novamente. Em seguida, feche a tampa e sele as placas com fita adesiva permeável a ar.
10. Incubar as placas verticalmente na câmara de crescimento. Opcionalmente, cubra as partes radiculares com caixas de papel pretas para escurecer raízes e fungos transportados pelo solo (ver¹⁹).
11. Realize as análises nos pontos de tempo preferidos após a inoculação dependendo da questão da pesquisa (consulte as legendas de figura para os pontos de tempo exatos utilizados aqui). A seguir estão algumas sugestões.
    1. Corte as folhas das raízes e colhe as duas separadamente. Retire as tiras de ágar das placas de Petri para acessar facilmente as raízes e puxá-las cuidadosamente para fora do ágar usando fórceps. Congele todo o material vegetal imediatamente em nitrogênio líquido.
       1. Triture as amostras em nitrogênio líquido. Extrair DNA total de 100 mg de material de folha para determinar através de um PCR quantitativo (qPCR) a quantidade de DNA fúngico em relação ao DNA vegetal (ver¹⁹).
       2. Triture as amostras em nitrogênio líquido. Pegue 100 mg de material vegetal e extraia RNA total. Realizar transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) para determinar a expressão de genes vegetais (ou genes fúngicos) durante a infestação (ver¹⁹).
    2. Remova cuidadosamente as raízes do ágar evitando lesões e examine-as sob o microscópio fluorescente.
       1. Determinar a indução de genes marcadores em linhas de repórteres vegetais (por exemplo, luciferase, β-glucuronidase ou repórteres fluorescentes 17,19,21).
       2. Visualize a propagação fúngica na raiz usando linhas de repórter fúngicos (por exemplo, V. longisporum expressando com alguma forma proteína fluorescente verde aprimorada, VL-sGFP ⁹) ou por técnicas de coloração (por exemplo, através de 5-bromo-4-cloro-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminida (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸).

5. Um sistema de inoculação in vitro estéril organizado com copos plásticos

NOTA: Como observado na primeira descrição desta técnica¹⁹, certifique-se de que todos os equipamentos e mídias estão livres de germes e que todas as etapas sejam executadas em uma capa de fluxo laminar.

1. Utilize copos plásticos transparentes com um volume total de 500 mL e esterilize-os em um banho de etanol de 70%-75% por pelo menos 20 min. Seque as xícaras no capô de fluxo laminar.
2. Despeje o meio autoclavado (ver passo 1.4) nos copos de plástico. Opcionalmente, adicione cefotaxime (concentração final de 50 mg/L) ao meio autoclavado para evitar contaminações bacterianas. Use 150 mL de média por xícara para experimentos com arabidopsis ou mais médios (250-300 mL por xícara) para experimentos com espécies vegetais maiores (estupro de oleosa, tomate).
3. Coloque uma camada plástica (esterilizada antes incubando em 70%-75% de etanol por 20 min) no meio antes de solidificar (Figura 1B).
   NOTA: Esta camada de plástico contém quatro orifícios pré-fabricados nos cantos para a colocação de sementes esterilizadas pela superfície. Isso permite que as sementes acessem o meio. Posteriormente, esta camada de separação impede que as folhas toquem no fungo que contém o meio, de modo que os micróbios não possam atacar diretamente as folhas e devem tomar o caminho raiz. Outro buraco está no centro, permitindo o corte do canal de infecção.
4. Quando o meio se solidificar, corte o ágar com um bisturi através do orifício central pré-fabricado até uma profundidade de cerca de 1,5 cm. Remova o ágar cortado para criar um canal de infecção no qual os esporos fúngicos podem ser adicionados mais tarde.
5. Arranhe ligeiramente o meio do ágar com uma ponta de pipeta nos quatro orifícios menores para interromper a pele solidificada (isso permite que as sementes absorvam água do meio ágar a aguado). Coloque as sementes usando uma ponta de pipeta nos orifícios menores.
6. Feche o copo de plástico com um segundo copo de plástico invertido e vedação com fita adesiva permeável a ar. A fita deve permitir a troca de gás.
7. Após estratificação por 3 dias na escuridão a 4 °C, incubar os sistemas de copos sob luz de 12h / 12 h de escuridão (Arabidopsis, estupro da oleosa) ou 16h de luz / 8h de condição de escuridão (tomate) em câmaras de crescimento a uma temperatura constante de 22 °C e 60% de umidade.
8. Seguir a idade recomendada das plantas para a inoculação: 21 dias para arabidopsis; 5-7 dias por estupro de oleosa; 12 dias para tomate.
9. Plantlets inoculados com Verticillium adicionando 1 mL de solução conidia (concentração recomendada: 4 x 10⁵ esporos/mL) no canal de infecção. Para preparar amostras de controle, adicione 1 mL de solução simulada sem esporos (meio 1/4 MS sem germes) no canal.
10. Realize as análises nos pontos de tempo preferidos após a inoculação dependendo da questão da pesquisa (consulte as legendas de figura para os pontos de tempo exatos utilizados aqui). A seguir estão algumas sugestões.
    1. Tire fotos das plantas com uma câmera digital de cima mantendo a distância igual para cada foto. Quantifique a área da folha (por exemplo, com ImageJ²² ou BlattFlaeche^17,19; use o comprimento dos copos para definir a escala) e compare grupos infectados e de controle. Categorizar o desenvolvimento de sintomas da doença (por exemplo, folhas menores, mais amareladas ou necróticas).
       NOTA: Se houver alguma haste em Arabidopsis, remova-as para obter melhores fotos das rosetas.
    2. Remova as raízes e defina a biomassa (peso fresco) dos brotos de amostras infectadas e controle por pesagem. Determine o peso fresco relativo¹⁹.
    3. Colete as amostras para análises moleculares da seguinte forma.
    4. Arabidopsis: Remova hastes se houver alguma. Corte as rosetas na base das raízes. Certifique-se de excluir todo o material raiz da amostra e colher rosas inteiras. Combine 4-5 rosetas de diferentes plantas em uma amostra e congele o material da folha em nitrogênio líquido.
    5. Retire as raízes cuidadosamente para fora do meio com fórceps, pressione e coloque-as com uma toalha de papel para remover restos de ágar, e combine 4-5 raízes de diferentes plantas em uma amostra. Congele imediatamente em nitrogênio líquido.
    6. Estupro/tomate obênto: Corte segmentos de caule do hipocotílico (por exemplo, 1 cm de comprimento; sempre tome a mesma região de caule). Misture o material de 4-5 plantas em cada amostra e congele em nitrogênio líquido.
    7. Triture as amostras em nitrogênio líquido. Extrair DNA total de 100 mg da folha ou material-tronco para determinar via qPCR a quantidade de DNA fúngico em relação ao DNA vegetal (ver¹⁹).
    8. Triture as amostras em nitrogênio líquido, pegue 100 mg de material vegetal e extraia RNA total. Realize qRT-PCR para determinar a expressão de genes vegetais (ou genes fúngicos) após a infestação (ver¹⁹).

6. Um sistema de inoculação à base de solo em vasos

1. Misture completamente o solo e a areia em uma relação volumosa de 3:1 (solo:areia) para facilitar a lavagem do substrato das raízes. Despeje a mistura em um saco de autoclave. Se a mistura estiver muito seca, adicione uma quantidade adequada de água e misture-a no substrato. Vapor a 80 °C por 20 min em uma autoclave para minimizar as contaminações microbianas.
   NOTA: Evite o aquecimento a mais de 80 °C, pois isso pode afetar nutrientes orgânicos do solo.
2. Encha os potes com a mistura de areia do solo e transfira-os para bandejas. Adicione água nas bandejas cerca de 1/3 da altura de uma panela, de modo que a mistura de areia do solo fique completamente encharcada com água. Além disso, pulverizar a água do substrato com uma garrafa de spray para garantir condições de partida molhadas.
3. Porca 3-4 sementes em cada pote (Figura 1C) garantindo que as sementes tenham distância suficiente uma da outra. Mantenha-os por 3 dias na escuridão a 4 °C para estratificação para sincronizar a germinação.
   NOTA: Pré-cultivar um excesso de plantas, o que permite uma seleção de plantas de tamanho semelhante para os experimentos de inoculação e reduz os desvios devido a diferenças individuais.
4. Deixe as mudas crescerem em condições de longo dia (16h de luz / 8h de escuridão; temperatura constante de 22 °C; 60% de umidade) com rega regular.
5. Siga a idade recomendada das plantas para inoculação: 21 dias para arabidopse, 7 dias para estupro de oleosa e 10 dias para tomate. Escolha plantas de tamanho semelhante para realizar a "inoculação de mergulho raiz"15,17,23,24. Tire o solo das panelas e escava cuidadosamente as raízes.
6. Lave suavemente apenas as raízes em um recipiente de água e mantenha as rosetas fora da água. Incubar as raízes lavadas por 60 min em uma placa de Petri contendo a solução de esporos verticillium (concentração recomendada: 2 x 10⁶ esporos/mL). Para o grupo de controle não infectado, incubar as raízes por 60 minutos na solução simulada sem esporos (meio de 1/4 MS sem germes).
7. Prepare novas panelas com solo úmido e esterilizado a vapor (80 °C por 20 minutos) sem areia. Use uma ponta de pipeta para fazer um buraco no centro do solo em cada panela.
8. Coloque diretamente as raízes no orifício (transfira apenas uma planta por vaso). Depois de inserir as raízes, certifique-se de reabastecer os orifícios cuidadosamente com o solo. Evite pressionar o solo, caso contrário, o repotting pode causar sintomas de estresse, como folhas roxas.
9. Cultivar grupos infectados e de controle em condições de longo dia (16h de luz / 8h de escuridão; uma temperatura constante de 22 °C; 60% de umidade) com rega regular.
10. Realize as análises nos pontos de tempo preferidos após a inoculação dependendo da questão da pesquisa (consulte as legendas de figura para os pontos de tempo exatos utilizados aqui). A seguir estão algumas sugestões.
    1. Tire fotos das plantas com uma câmera digital de cima, mantendo a distância igual para cada foto. Quantifique a área da folha (por exemplo, com ImageJ²² ou BlattFlaeche^17,19; use o diâmetro dos potes para definir a escala) e compare grupos infectados e de controle. Categorizar o desenvolvimento de sintomas da doença (por exemplo, folhas menores, mais amareladas ou necróticas)¹³.
       NOTA: A remoção de hastes de Arabidopsis facilita tirar fotos das rosetas.
    2. Remova as raízes e defina a biomassa (peso fresco) dos brotos de amostras infectadas e controle por pesagem. Determine o peso fresco relativo¹⁹.
    3. Alternativamente, meça a altura da planta ou categorize o crescimento fúngico dos segmentos de caule para avaliar a gravidade da doença¹³.
    4. Coletar amostras para análises moleculares da seguinte forma.
    5. Arabidopsis: Remova as hastes. Corte as rosetas na coroa raiz. Combine 4-5 rosetas de diferentes plantas em uma amostra. Congele o material da folha em nitrogênio líquido.
       NOTA: No caso das raízes, é difícil limpá-las suficientemente do solo sem reprogramar a expressão genética através da lavagem.
    6. Estupro/tomate obênto: Corte segmentos de caule do hipocotílico (por exemplo, 1 cm de comprimento; sempre tome a mesma região de caule). Misture o material de 4-5 plantas em uma amostra e congele-o em nitrogênio líquido.
    7. Triture as amostras em nitrogênio líquido. Extrair DNA total de 100 mg de folha ou material-tronco para determinar via qPCR a quantidade de DNA fúngico em relação ao DNA vegetal (ver¹⁹).
    8. Triture as amostras em nitrogênio líquido, pegue 100 mg de material vegetal e extraia RNA total. Realize qRT-PCR para determinar a expressão de genes vegetais (ou genes fúngicos) após a infestação (ver¹⁹).

7. Analisando os dados

1. Calcule o desvio médio e padrão (± SD) com base nas réplicas biológicas.
2. Calcule os valores relativos dividindo todos os resultados do grupo infectado pelo resultado do controle. Mostre a média como, por exemplo, "relativa a zombaria" ou "relativa ao tipo selvagem".
3. Determinar a significância estatística entre os grupos.

Figura 1: Compilação dos três sistemas de inoculação e etapas individuais nos protocolos. Esses números ilustram os sistemas com a planta modelo Arabidopsis thaliana. Para outras espécies de plantas, o tempo deve ser ajustado. Destaque para caixas laranjas, para as quais as análises subsequentes são mais recomendadas com o respectivo sistema. (A) Para o sistema de inoculação em placas de Petri¹⁷, despeje o meio e deixe-o solidificar. Mantenha os pratos na geladeira durante a noite. Em seguida, corte e remova o terço superior, bem como o canal de infecção (IC) com um bisturi (áreas brancas na ilustração foram removidas do ágar, enquanto as áreas azuladas representam o ágar). Coloque as sementes na superfície cortada e feche as placas de Petri. Após a estratificação, coloque as placas verticalmente e deixe as plantas crescerem. Uma vez que a maioria das raízes tenha atingido o canal de infecção, adicione a solução de esporos com uma pipeta diretamente no canal. Certifique-se de que a solução está distribuída uniformemente. Feche as placas de Petri e incuba-as verticalmente em uma câmara de crescimento. As abordagens que podem seguir são análises expressionais com transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR), microscopia com linhas de repórteres e quantificação do DNA microbiano. (B) Para o sistema de inoculação em copos plásticos¹⁹, despeje o meio e transfira a camada plástica que separa os orifícios pré-fabricados (quatro pequenos orifícios nos cantos para colocação das sementes e um grande buraco no centro para o canal de infecção). Deixe o meio solidificar. Corte e remova o meio ágar no orifício central com um bisturi para obter o canal de infecção (IC). Coce o meio nos orifícios menores e transfira as sementes. Feche o copo com um copo invertido e vedação com fita permeável de ar (simbolizada em amarelo). Deixe as plantas crescerem. Para a inoculação, adicione a solução de esporo com uma pipeta diretamente no canal de infecção. Feche o sistema e continue o cultivo na câmara de crescimento. As abordagens que podem seguir são análise expressional com qRT-PCR, quantificação do DNA microbiano e determinação de peso fresco, área da folha ou outras características da doença. (C) "Inoculação de mergulho raiz"15,17,23,24: para o sistema de inoculação à base de solo, encha os potes com uma mistura de solo:areia. Transfira as sementes e deixe as mudas crescerem. Escavar plantas de tamanho semelhante e lavar as raízes na água. Coloque as raízes lavadas em uma placa de Petri segurando a solução com os esporos. Após a incubação, insira plantas únicas em vasos com solo. As abordagens que podem seguir são análise expressional em folhas com qRT-PCR, quantificação do DNA microbiano e determinação de peso fresco, área da folha ou outras características da doença. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Seguindo o protocolo, as plantas foram cultivadas e inoculadas com V. longisporum (cepa Vl4325) ou V. dahliae (isolar JR218). Vários cenários foram projetados para provar a eficácia e destacar algumas capacidades dos protocolos determinados. Resultados representativos são mostrados.

A indução expressional de genes envolvidos na biossíntese indol-glucosinolato antimicrobiana (IG) é um indicador confiável para a avaliação de uma infecção por Verticillium 17,19,26. Em Arabidopsis, MYB51 (proteína de domínio MYB 51; AT1G18570) codifica um fator de transcrição envolvido na ativação de genes necessários para a biosíntese de IG27. MYB51 pode servir como um gene marcador que indica infestação bem sucedida, pois é consistentemente induzido em raízes por V. longisporum26 ou outros fungos transmitidos pelo solo, como Phytophthora parasitica26 e Fusarium oxysporum21. Dois dias pós-inoculação (2 dpi) no sistema à base de placa de Petri, a indução de MYB51 foi visualizada em raízes de Arabidopsis. A linha de plantas repórter PromMYB51::YFP21 divulgou uma ativação do promotor e uma análise qRT-PCR confirmou uma indução transcricional significativa deste gene (Figura 2A-B). Tais experimentos visam determinar mudanças expressais nas raízes durante a infecção.

Como as espécies de Verticillium utilizadas neste estudo realizam um estilo de vida vascular e se espalham da raiz para a filmagem através dos vasos de xilema, a quantidade de DNA fúngico pode ser determinada nas folhas como parâmetro para o grau de propagação fúngica. Arabidopsis foi inoculada no sistema in vitro em copos plásticos e as rosetas foram colhidas 12 dias depois. Em comparação com o valor de fundo detectado no controle simulado, quantidades substanciais de DNA fúngico foram encontradas em folhas de plantas infectadas (Figura 2C). Isso demonstra que a infecção progrediu com sucesso. Para exames mais aprofundados, a quantidade de DNA fúngico pode ser quantificada em diferentes genótipos vegetais para obter insights sobre respostas de defesa raiz. Além disso, foram coletadas raízes neste momento para testar a indução do gene marcador via qRT-PCR. A abundância de transcrições myb51 foi significativamente enriquecida (Figura 2D). Isso ilustra que testes de suscetibilidade e análises expressais podem ser facilmente realizados em paralelo com o sistema de copos, o que sublinha a grande vantagem desse procedimento.

Para incluir evidências de que outras espécies de plantas modelo também podem ser introduzidas, o estupro da oleosa foi infectado com V. longisporum e tomate com V. dahliae no sistema em copos plásticos. No dia 12, após a inoculação nas raízes, a quantidade de DNA fúngico foi quantificada em segmentos de haste cortados na base das mudas (Figura 2E-F). O DNA fúngico foi detectável em ambas as espécies vegetais indicando a propagação dos patógenos dentro da planta. Mais uma vez, diferentes genótipos vegetais poderiam ser testados para obter conhecimento sobre mecanismos de defesa.

Se o micróbio colonizador raiz de interesse não se espalha das raízes para as folhas, não é possível quantificar a quantidade de DNA microbiano nas folhas como parâmetro para a gravidade da doença. Outra opção para medir a gravidade da doença é a avaliação e extrapolação dos sintomas no hospedeiro. Para exemplificar isso, arabidopsis foi inoculado com V. dahliae no sistema baseado no solo e a área da folha verde foi avaliada (Figura 2G-H). Enquanto as rosetas de plantas tratadas falsas pareciam saudáveis e verdes, as plantas infectadas por patógenos tinham um tamanho reduzido de folhas e folhas amareladas ou mesmo necróticas. Dessa forma, a suscetibilidade de diferentes genótipos vegetais pode ser analisada e confirmada, por exemplo, quantificando o peso fresco.

Figura 2: Os resultados representativos obtidos seguindo os protocolos. (A,B) Raízes arabidopsis foram inoculados com V. longisporum no sistema de placas de Petri. A linha de repórteres PromMYB51::YFP21 revelou uma forte ativação do promotor MYB51 em raízes infectadas em comparação com o controle simulado (microscopia a 2 dpi; barra de escala: 50 μm). A indução transcricional de MYB51 em raízes de wildtype (WT) foi confirmada ainda com a análise qRT-PCR (2 dpi). Os valores das amostras infectadas são dados em relação a amostras simuladas (definidas para 1) (n = 5; ± SD). (C) Colonização sistêmica através de V. longisporum: Após inocular raízes arabidopsis no sistema de copos, a quantidade relativa de DNA fúngico foi determinada nas folhas por PCR quantitativo (qPCR; 12 dpi). Os valores das amostras infectadas são dados em relação ao nível de fundo em amostras simuladas (definidas para 1) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum as raízes infectadas e tratadas simuladas foram colhidas do sistema de copos e foi realizada a análise qRT-PCR. Os valores das amostras infectadas são dados relativos a amostras simuladas (definidas para 1) (n = 3; ± SD). Foi encontrado que o MYB51 foi induzido transcrição (12 dpi). (E) O estupro da oleosa foi inoculado no sistema de copos com V. longisporum e a quantidade relativa de DNA fúngico foi quantificada através de qPCR em segmentos de haste (12 dpi). Os valores das amostras infectadas são dados em relação ao nível de fundo em amostras simuladas (definidas para 1) (n = 3; ± SD). (F) O tomate foi inoculado no sistema de copos com V. dahliae e a quantidade relativa de DNA fúngico foi quantificada através de qPCR em segmentos de haste (12 dpi). Os valores das amostras infectadas são dados em relação ao nível de fundo em amostras simuladas (definidas para 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis foi inoculado com V. dahliae no sistema baseado no solo e fotos representativas de plantas infectadas e tratadas por simulação são mostradas (21 dpi). A área da folha verde foi examinada. Em relação ao simulado (definido para 1), as plantas infectadas tinham menos área de folha verde (n = 5; ± SD). (B-F,H) Para pares de primer, consulte19; estatísticas: t-test do aluno relativo ao simulado, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.