Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.
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Artigo de método
Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A rizosfera abriga uma comunidade microbiana altamente complexa na qual as raízes das plantas são constantemente desafiadas. As raízes estão em contato próximo com uma grande variedade de microrganismos, mas estudos sobre interações transmitidas pelo solo ainda estão por trás daqueles realizados em órgãos acima do solo. Embora algumas estratégias de inoculação para infectar plantas modelo com patógenos radiculares modelos sejam descritas na literatura, ainda é difícil obter uma visão geral metodológica abrangente. Para resolver esse problema, três diferentes sistemas de inoculação radicular são precisamente descritos que podem ser aplicados para obter insights sobre a biologia das interações root-micróbios. Para ilustração, as espécies de Verticillium (ou seja, V. longisporum e V. dahliae) foram empregadas como patógenos de modelo invasores radiculares. No entanto, os métodos podem ser facilmente adaptados a outros micróbios colonizadores radiculares - tanto patogênicos quanto benéficos. Ao colonizar a planta xilema, fungos vasculares transmitidos pelo solo, como Verticillium spp. exibem um estilo de vida único. Após a invasão radicular, eles se espalham pelos vasos xilema acropetalmente, chegam ao tiro e provocam sintomas da doença. Três espécies representativas de plantas foram escolhidas como hospedeiras-modelo: Arabidopsis thaliana, estupro de oleosa economicamente importante (Brassica napus) e tomate (Solanum lycopersicum). Protocolos passo a passo são dados. Resultados representativos de ensaios de patogenicidade, análises transcritivas de genes marcadores e confirmações independentes por construções de repórteres são mostrados. Além disso, as vantagens e desvantagens de cada sistema de inoculação são exaustivamente discutidas. Esses protocolos comprovados podem auxiliar no fornecimento de abordagens para perguntas de pesquisa sobre interações entre micróbios radiculares. Saber como as plantas lidam com micróbios no solo é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias para melhorar a agricultura.
Introdução
Solos naturais são habitados por um número surpreendente de micróbios que podem ser neutros, prejudiciais ou benéficos para as plantas1. Muitos patógenos vegetais são transportados pelo solo, cercam as raízes e atacam o órgão subterrâneo. Esses microrganismos pertencem a uma grande variedade de clados: fungos, oomycetes, bactérias, nematoides, insetos e alguns vírus 1,2. Uma vez que as condições ambientais favoreçam a infecção, as plantas suscetíveis se tornarão doentes e a produção de culturas diminuirá. Os efeitos das mudanças climáticas, como o aquecimento global e os extremos climát....
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Protocolo
1. Mídia para culturas fúngicas e sistemas de inoculação de plantas
- Caldo de desxtrose de batata líquida (PDB): Prepare 21 g/L PDB em água ultrapura em um frasco estável a calor.
- Caldo líquido Czapek Dextrose (CDB): Prepare 42 g/L CDB em água ultrauso em um frasco estável a calor.
- Meio para o sistema de inoculação da placa de Petri: Prepare um frasco estável a calor com 1,5 g/L Murashige e Skoog médio (MS) e 8 g/L de ágar em água ultrauso.
NOTA: Evite o açúcar neste meio, pois levará ao crescimento fúngico excessivo após a inoculação. - Meio para o sistema de inoculação à base de copos plásticos: Prepare um fra....
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Resultados
Seguindo o protocolo, as plantas foram cultivadas e inoculadas com V. longisporum (cepa Vl4325) ou V. dahliae (isolar JR218). Vários cenários foram projetados para provar a eficácia e destacar algumas capacidades dos protocolos determinados. Resultados representativos são mostrados.
A indução expressional de genes envolvidos na biossíntese indol-glucosinolato antimicrobiana (IG) é um indicador confiável para a avaliação.......
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Discussão
Devido às enormes perdas de rendimento causadas pelos fitopatógenos transportados pelo solo1, é necessária uma melhoria das estratégias agrícolas ou variedades de culturas. A visão limitada da patogênese das doenças transmitidas pelo solo dificulta o desenvolvimento de plantas mais resistentes. Os mecanismos subjacentes precisam ser explorados, para os quais uma plataforma metodológica robusta é necessária. Os procedimentos de inoculação relatados mostraram que eventos multifatoriais em interações.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem Tim Iven e Jaqueline Komorek por trabalhos anteriores sobre esses métodos, o grupo de Wolfgang Dröge-Laser (Departamento de Biologia Farmacêutica da Universidade de Würzburg, Alemanha) por fornecer os equipamentos e os recursos necessários para este trabalho, e Wolfgang Dröge-Laser, bem como Philipp Kreisz (ambos da Universidade de Würzburg) para a revisão crítica do manuscrito. Este estudo foi apoiado pela "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | todos os sistemas descritos requerem Gelrite |
| Arabidopsis thaliana | estoque NASC | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software para determinar as áreas foliares |
| Brassica napus tipo selvagem | ver Floerl et al., 2008 | de estupro de ciclo rápido | ACaacc |
| Cefotaxima sódica | Duchefa | C0111 | |
| Frasco de chicana 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Balão Erlenmeyer com quatro defletores |
| Tubos de coleta 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Caldo de dextrose Czapek médio | Duchefa | C1714 | |
| Câmera digital | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Dessecador ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Selo com tampa para segurar cloro gasoso |
| Microscópio de fluorescência | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | fita não tecida 2,5 cm x 9,2 m |
| MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico) | Carl Roth | 4256,2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Sulfato de magnésio-Heptahidratado |
| Murashige & Meio Skoog (MS) | Duchefa | M0222 | MS incluindo vitaminas |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Câmaras de crescimento Percival | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Placas de Petri | Sarstedt | 82.1473.001 | tamanho Ø xH: 92 &vezes; Copos de plástico de 16 mm |
| (500 mL, transparente) | Pro-pac, caixa de salada x | 5070 | tamanho: 108 &vezes; 81 &vezes; 102 mm |
| Filtro de celulose plissado | Hartenstein | FF12 | nível de retenção de partículas 8 12 μ m |
| poly klima câmara de crescimento | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Caldo de Dextrose de Batata meio | SIGMA Aldrich | P6685 | para microbiologia |
| Potes | Pö ppelmann GmbH | TO 7 D ou TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9,5 cm |
| PromMYB51::YFP | ver Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Tubos de reação 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Agitador rotativo (orbital) | Edmund Bü hler | SM 30 C control | |
| Areia (areia de pássaro) | Bistrô para Animais de Estimação, Mü ller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum tipo selvagem | ver Chavarro-Carrero et al., 2021 | Tipo: Moneymaker | |
| Câmara de contagem de células Thoma | Marienfeld | 642710 | profundidade 0,020 mm; 0,0025 mm2 |
| Água ultrapura (Milli-Q água purificada) | MERK | IQ 7003/7005 | água obtida após purificação |
| Verticillium dahliae | ver Reusche et al., 2014 | isolado JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise e von Tiedemann, 2002 | cepa Vl43 |
Referências
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
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Reimpressões e permissões
