Aqui descrevemos duas modificações do ensaio de fibra de DNA para investigar lacunas de DNA de uma única vez na replicação do DNA após indução da lesão. O ensaio de fibra S1 permite a detecção de lacunas pós-replicativas usando a endonuclease S1 específica do SSDNA, enquanto o ensaio de preenchimento de lacunas permite visualização e quantificação do reparo de lacunas.
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Artigo de método
Detecção de acumulação e reparo de lacunas pós-replicativas em células humanas usando o ensaio de fibra de DNA
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio de fibra de DNA é um método simples e robusto para a análise da dinâmica do garfo de replicação, baseado na imunodeetecção de análogos nucleotídeos que são incorporados durante a síntese de DNA em células humanas. No entanto, essa técnica tem uma resolução limitada de alguns milhares de quilobases. Consequentemente, lacunas de DNA de uma única cadeia pós-replicação (ssDNA) tão pequenas quanto algumas centenas de bases não são detectáveis pelo ensaio padrão. Aqui, descrevemos uma versão modificada do ensaio de fibra de DNA que utiliza o nuclease S1, uma enzima que especificamente corta ssDNA. Na presença de lacunas ssDNA pós-replicativas, a nuclease S1 atingirá e diminuirá as lacunas, gerando setores mais curtos que podem ser usados como leitura para lacunas ssDNA em garfos em andamento. Essas lacunas de DNA pós-replicação são formadas quando o DNA danificado é replicado descontínua. Eles podem ser reparados através de mecanismos desacoplados da replicação do genoma, em um processo conhecido como preenchimento de lacunas ou reparo pós-replicativo. Como os mecanismos de preenchimento de lacunas envolvem a síntese de DNA independente da fase S, alterações no esquema de rotulagem de fibras de DNA também podem ser empregadas para monitorar eventos de preenchimento de lacunas. Ao todo, essas modificações do ensaio de fibra de DNA são estratégias poderosas para entender como as lacunas pós-replicativas são formadas e preenchidas no genoma das células humanas.
Introdução
Trabalhos seminais têm proporcionado evidências do acúmulo de lacunas pós-replicativas de single-stranded (ssDNA) após o tratamento com agentes prejudiciais ao DNA em bactérias1 e células humanas 2,3. Durante a replicação de modelos de DNA danificados, o maquinário de síntese de DNA pode contornar as lesões empregando polimerases específicas de DNA de translesão ou através de mecanismos de comutação de modelos. Alternativamente, o replisome também pode simplesmente pular a lesão deixando uma lacuna ssDNA para trás, para ser reparado mais tarde. Mais recentemente, um estudo mostrou clara....
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Protocolo
Como o estudo utiliza células humanas, o trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP, número de aprovação nº 48347515.3.00005467) para a pesquisa com amostras humanas.
NOTA: Os protocolos aqui descritos foram utilizados em publicações anteriores com pequenas modificações 14,16,28. Aqui o foco é o uso da luz ultravioleta C (UVC) como um agente prejudicial ao DNA. No entanto, outros agentes prejudiciais ao DNA, como cisplatina e hidroxiureia, também foram empregados com sucesso<....
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Resultados
No ensaio de fibra s1, se o tratamento com um agente genotóxico levar a lacunas de SDNA pós-replicação, os comprimentos gerais das fibras de DNA dos núcleos tratados com S1 serão menores após o tratamento com danos de DNA em comparação com amostras não tratadas, bem como para amostras que foram tratadas com o agente genotóxico, mas não foram submetidas ao decote S1 (Figura 1).
Alternativamente, se o tratamento com a nuclease S1 não afetar significativamente o comp.......
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Discussão
Etapas críticas do protocolo padrão de ensaio de fibra de DNA foram discutidas em uma publicação anterior32. Aqui, descrevemos versões modificadas do ensaio padrão de fibra de DNA para investigar a presença de lacunas ssDNA pós-replicativas, bem como seu reparo por preenchimento de lacunas, inicialmente descrito em14. No contexto da presença de lacuna ssDNA pós-replicativa, o uso da nuclease S1 no protocolo S1 Fiber provavelmente seria adequado após a exposição de um agente.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O trabalho na C.F.M.M. laboratório é apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasil, Bolsas nº 2019/19435-3, #2013/08028-1 e 2017/05680-0) sob a Pesquisa internacional de Colaboração da FAPESP e da Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasil, Bolsas nº 308868/2018-8) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasil, Código financeiro 001).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido acético, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternativamente, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Hidróxido de amônio | Synth | 1336-21-6 | Ou similar |
| Anticorpo anti-rato IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005-Anticorpo | |
| anti-rato Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470-Anticorpo | |
| Rato anti-BrdU | Becton Disckson | 347580-Anticorpo | |
| Rato anti-BrdU | Abcam | Ab6326-Capuz | de |
| segurança biológica | Pachane | PA 410 | Use capuz presente no laboratório BSA |
| (Albumina de soro bovino) | Sigma-Aldrich | A3294 | Ou similar |
| Raspador de células | Thermo Scientific | 179693 | Ou similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891-Ácido | |
| clorídrico | Synth | 7647-01-0 | Ou |
| semelhante Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 ou 9) | Zeiss-Ou | similar | |
| Vidro de cobertura (ou lamínulas) | Thermo Scientific | 152460 | Alternativamente, Olen - Kasvi Vidro de cobertura (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - Alta glicose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use meios de cultura específicos para a linha celular usada. |
| EDTA (Ácido etilenodiaminotetracético dissódico sal di-hidratado) | Sigma-Aldrich | E5314 | Ou |
| similar Microscópio de Epifluorescência Axiovert 200 | Zeiss-Ou | similar | |
| FBS (Soro Fetal Bovino) | Gibco | 12657-029 | Ou similar |
| Forma Série II Incubadora de CO2 com Camisa de Água | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use a incubadora de células presente no frasco |
| de lâminas de vidro | Sigma-Aldrich | S5516 | ou similar |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | ou similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125-Magnesium | |
| Chloride | Synth | 7791-18-6 | ou similar |
| Metanol | Merck | 67-56-1 | ou |
| similar Lâminas | de microscópioDenville | M1021 | Alternativamente, Olen - Lâminas de Microscópio Kasvi - K5-7105 Linha de Vidro de Precisão OU - 7105-1 |
| MOPS (Á cido 3-morfolinopropano 1-sulfô nico) | Synth | 1132-61-2 | Ou similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9-PBS | |
| (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Ou similar |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | Ou similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Qualquer solução antifade moutant para imunofluorescência pode ser usada |
| nuclease S1 purificada de Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pré-diluir a nuclease S1 (1/100 - 1/200) em tampão de diluição de nuclease S1 fornecido pelo fabricante, alicitar e armazenar a -20 ° C |
| SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) | BioRad | 161-0302 | Ou similar |
| Acetato de Sódio Trihidratado | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Ou similar |
| Cloreto de | Sódio Synth | 7647-14-5 | Ou similar |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Ou similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Ou similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Ou similar |
| Tripsina | Gibco | 25200072 | Ou similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Ou |
| similar Lâmpada UVC | Não | Específico-Essencial | : comprimento de emissão de 254 nm |
| VLX-3W Radiômetro UV | Vilber Loumart-Ou | similar | |
| Acetato de Zinco | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Ou similar |
Referências
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R.
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Reimpressões e permissões
