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Artigo de método

Ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos

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DOI:

10.3791/63454

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18 de fevereiro de 2022

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1Laboratories of Neuroimmunology, Department of Symptom Research, and the MD Anderson Pain Research Consortium, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Stanford University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

O ensaio mecânico de prevenção de conflitos é usado como uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em camundongos que podem ser usados para entender melhor as respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato.

Resumo

A dor compreende tanto as dimensões sensorial (nociceptiva) quanto afetivas (desagradáveis). Em modelos pré-clínicos, a dor tem sido tradicionalmente avaliada por meio de testes reflexivos que permitem inferências em relação ao componente nociceptivo da dor, mas fornecem poucas informações sobre o componente afetivo ou motivacional da dor. Desenvolver testes que capturem esses componentes da dor são, portanto, traduções importantes. Assim, os pesquisadores precisam usar ensaios comportamentais não reflexivos para estudar a percepção da dor nesse nível. A prevenção de conflitos mecânicos (MCA) é um ensaio de comportamento voluntário não reflexivo estabelecido, por estudar respostas motivacionais a um estímulo mecânico nocivo em um paradigma de 3 câmaras. Uma mudança na preferência de localização de um rato, quando confrontada com estímulos nocivos concorrentes, é usada para inferir o descontentamento percebido da luz brilhante versus estimulação tátil das patas. Este protocolo descreve uma versão modificada do ensaio mca que os pesquisadores da dor podem usar para entender respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato. Embora não seja especificamente descrito aqui, nossos dados mca exemplo usar o intraplantar complete Freund's adjuvante (CFA), poupado lesão nervosa (SNI) e um modelo de fratura/fundição como modelos de dor para ilustrar o procedimento mca.

Introdução

A dor é uma experiência complexa com componentes sensoriais e afetivos. Uma redução no limiar da percepção da dor e da hipersensibilidade aos estímulos térmicos e/ou mecânicos são características fundamentais dessa experiência, que os testes de comportamento de dor evocados por estímulos podem capturar (como o teste de hargreaves de sensibilidade térmica e o teste von Frey de sensibilidade mecânica)1,2. Embora tais testes dêem resultados robustos e reprodutíveis, eles são limitados por sua dependência da retirada reflexiva de um estímulo nocivo percebido. Isso pôs em causa uma dependência contínua da pesquisa de dor apenas nestes testes. Para isso, os pesquisadores da dor vêm explorando há vários anos testes comportamentais alternativos/complementares para uso em modelos de dor de roedores, em um esforço para capturar mais dos componentes afetivos e/ou motivacionais da dor. Essas medidas não evocadas, voluntárias ou não reflexivas (por exemplo, corrida de rodas, atividade de escavação, preferência de localcondicionada 3,4,5) estão sendo implementadas na tentativa de melhorar a tradução da pesquisa de dor pré-clínica.

O ensaio de prevenção de conflitos mecânicos (MCA) foi originalmente descrito por Harte et al. em2016 6, é usado predominantemente em ratos 7,8, e representa uma modificação de uma abordagem anterior - o paradigma de fuga do local. Nesta abordagem, um estímulo nocivo da pata traseira é realizado em uma câmara de outra forma desejável (escura) para conduzir o comportamento proposital do animal para escapar/evitar tal estimulação 9,10. Em vez de depender de uma estimulação nociva manual da pata traseira por um observador, o ensaio da MCA força os ratos a negociar um estímulo potencialmente nocivo para escapar de um ambiente aversivo e alcançar a câmara escura. O conflito/evasão que dá nome ao ensaio surge dessas duas motivações concorrentes: escapar de áreas iluminadas e evitar estímulos nocivos das patas. O ensaio mca também compartilha características com testes de preferência de local condicionado, onde o emparelhamento do alívio da dor com pistas ambientais impulsiona mudanças de comportamento que refletem uma preferência pelo contexto de alívio/recompensa da dor11.

Fundamentalmente falando, todos esses ensaios compartilham uma abordagem semelhante: usando uma mudança na preferência de um animal por um ambiente aversivo sobre outro como um indicador de seu estado afetivo/motivacional. O ensaio mca é um paradigma de 3 câmaras que consiste em uma câmara iluminada brilhantemente seguido por uma câmara média escura com sondas de altura ajustáveis e uma terceira câmara escura sem qualquer estímulo aversivo. Um rato ileso é tipicamente motivado a escapar para uma câmara escura, dada a aversão inata de roedores à luz brilhante12. Neste exemplo, a motivação natural para escapar de um ambiente iluminado supera a desinclinação ao encontrar estimulação da pata traseira (as sondas de altura ajustáveis), que ocorre exclusivamente no ambiente escurecido. Em contraste, um rato que experimenta dor (devido à inflamação ou neuropatia, por exemplo) pode optar por passar mais tempo no ambiente iluminado, já que há motivação para evitar a desagradável experiência tátil das sondas mecânicas no cenário de hipersensibilidade tátil contínua.

Este artigo descreve uma versão modificada do ensaio mca. Adaptamos o método original (que foi realizado em ratos6) para uso em camundongos. Também reduzimos o número de alturas da sonda testadas de seis para três (0, 2 e 5 mm acima da altura do piso) para agilizar a aquisição de dados. Essa abordagem foi testada em vários modelos de dor e validada com analgésicos conhecidos, indicando que a hipersensibilidade da dor e/ou as alterações afetivas e motivacionais associadas estão conduzindo essas mudanças de comportamento. Essa abordagem é relativamente rápida de conduzir e adaptável quando comparada a outras medidas não reflexivas, que podem levar muitos dias de habituação e treinamento 1,2. Em conjunto com outras medidas de dor, a MCA pode gerar insights valiosos sobre os aspectos afetivos e motivacionais da dor.

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Protocolo

Todos os experimentos envolvendo o uso de camundongos e os procedimentos nele realizados foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais do MD Anderson Cancer Center e da Universidade de Stanford, em estrita conformidade com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Construção mca

  1. Construa a câmara 1 com as seguintes dimensões: 125 mm x 125 mm x 125 mm (largura x profundidade x altura) a partir de acrílico branco opaco de 3 mm de espessura usado para as paredes laterais, piso, teto. Use um acrílico de 3 mm de espessura para a parede frontal. Cole todos os lados com bastante antecedência usando adesivo acrílico dedicado.
    ATENÇÃO: O adesivo acrílico é considerado material perigoso (inflamável, vapor prejudicial, pode ser prejudicial se engolido, pode irritar a pele ou os olhos). Esses adesivos só devem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante (ou seja, com EPI apropriado em uma área bem ventilada).
  2. Conecte a tampa da câmara 1 com uma dobradiça, para que os ratos possam ser facilmente colocados e recuperados da câmara. Conecte fita de diodo emissor de luz autoadesiva (LED) à superfície interna da tampa para fornecer iluminação de ~4800 lux.
  3. Feche a câmara 1 do resto da MCA deslizando uma folha de acrílico opaca para dentro e fora de posição.
  4. Construa a câmara de teste MCA, câmara 2, como uma câmara não iluminada de 270 mm de comprimento fabricada a partir de acrílico vermelho escuro translúcido (3 mm de espessura) em todos os lados, com uma tampa articulada em cima. Coloque uma grade de 13 x 31 de furos de 2 mm no chão da câmara 2 através da qual uma matriz de sondas sem cortes com pontas de 0,5 mm de diâmetro (por exemplo, pinos de mapa sem cortes) pode se projetar.
    NOTA: Pinos sem corte com um bloco de lixa de 120 grãos ou similares. Limpe-os em água morna com detergente antes de ser desinfetado com desinfetante esporicidal.
  5. Ajuste a altura das sondas colocando folhas de acrílico adicionais abaixo da placa base da sonda (Figura 1). Usando esta abordagem, configure o dispositivo com três configurações: 0 mm, 2 mm e 5 mm de altura da sonda.
  6. Como alternativa aos pinos de mapa sem cortes ou materiais similares, use os arquivos da impressora 3D para imprimir o piso da câmara 2 e a placa da sonda (ver Arquivo Suplementar 1: SpikeBed-MCA.stl que se refere às sondas mecânicas, e Arquivo Suplementar 2: MCA_baseplate.stl que forma o piso da câmara 2).
    NOTA: Se a impressão 3D não estiver disponível, cole os pinos do mapa em uma folha de acrílico usando o mesmo adesivo acrílico usado para construir as paredes do dispositivo.
  7. Imprima com um material lavável e biocompatível, como o plástico nylon 12 ou similar (recomendado).
  8. Construa a câmara 3 com as seguintes dimensões: 125 mm x 125 mm x 125 mm como uma caixa de acrílico vermelho translúcido não iluminada (em todos os lados), colocada na extremidade oposta à câmara 1. Coloque uma tampa dobradiça na câmara, semelhante às câmaras 1 e 2. Esta câmara serve como uma área de fuga escurecida das sondas mecânicas na câmara 2.

2. Habituação e teste do Mouse MCA

  1. Como acontece com todos os experimentos envolvendo desfechos comportamentais em animais, observe a randomização adequada e a cegueira para minimizar o viés potencial.
    NOTA: Os resultados representativos foram gerados utilizando camundongos C57BL/6J masculino e feminino de 8 a 12 semanas (número de cepas da Jackson Laboratories 000664). Os camundongos foram socialmente alojados, até 5 por gaiola, com acesso a alimentos e água ad libitum e um ciclo de luz das 07:00 h às 19:00 h. O MCA ocorreu no período de luz, entre 09:00 h e 12:00 h.
  2. Um dia antes do teste da linha de base ser agendado, aclimatar ratos à unidade MCA por 5 min (mínimo) a 15 min (máximo) com seus companheiros de gaiola para facilitar a exploração social de todo o dispositivo.
  3. Durante todo o processo, certifique-se de que os LEDs na câmara 1 sejam desligados, a barreira entre as câmaras 1 e 2 seja deixada aberta, e as sondas sejam definidas a uma altura de zero (ou seja, não se projetando pelo chão da câmara 2).
  4. Realize um teste de linha de base de camundongos (opcional) se o estudo incorporar animais de controle negativos (ou seja, cirurgia falsa ou controles de injeção de veículo). Se desejar, use um teste de linha de base para excluir quaisquer outliers não feridos que nunca cruzem para a câmara 2, embora isso não tenha se mostrado necessário. Se utilizado, informe todos os critérios de exclusão e o número de camundongos excluídos.
    1. Antes de começar a testar, configure uma câmera de vídeo capaz de gravar imagens de 1080p em um tripé com uma visão lateral de todo o dispositivo MCA. Ajuste o campo de visão de modo que o MCA preencha a imagem gravada.
    2. Uma vez que a gravação começa, segure uma placa de apagamento a seco portátil no campo de visão da câmera para rotular o início do vídeo com informações de identificação sobre a execução de testes do animal (por exemplo, ID do mouse, altura da sonda, data, ponto de hora, etc.).
    3. Para a primeira corrida, ajuste a altura da sonda como zero. Transfira o mouse para ser testado de sua gaiola para a câmara 1 com a porta da barreira no lugar. Inicie um temporizador visível nas imagens gravadas.
      NOTA: O temporizador garante que os intervalos entre as diferentes partes do teste sejam consistentes entre as corridas.
    4. Depois dos 10, ligue os LEDs da câmara 1. Depois que o rato estiver na câmara iluminada por 20 s, retire a barreira entre as câmaras 1 e 2.
    5. Observe o animal por 2 minutos. Meça latências e/ou tempos de moradia com um cronômetro enquanto o teste estiver em andamento. Alternativamente, as imagens de vídeo podem ser analisadas assim que os testes estiverm concluídos.
      NOTA: Por razões de rendimento e evitar exposição prolongada a estímulos aversivos, o corte foi fixado em 2 min.
    6. Meça um ou mais dos vários desfechos úteis que foram identificados (veja abaixo; Figura 1). Recomendado para analisar todas as 5 medidas de desfecho ao iniciar os testes, a fim de verificar quais aspectos de comportamento diferem em uma determinada configuração experimental.
      1. Opção I: Regissu o registro da latência para a primeira entrada na câmara 2. Opção II: Regissu o registro da latência para atravessar mais de metade da câmara 2. Opção III: Regisso tempo total de moradia na câmara 2. Opção IV: Registo da latência para chegar à câmara 3 (fuga). Opção V: Semelhante à opção II, registo o tempo total de moradia em cada câmara dentro de 2 minutos e converta-os em proporções.
        NOTA: Como cada experimento é único e pode ser influenciado por fatores biológicos e mudanças comportamentais exclusivas do modelo da doença, os pesquisadores podem experimentar essas e outras medidas em suas próprias mãos.
    7. Uma vez que o teste esteja completo, devolva o mouse para sua gaiola doméstica, limpe as câmaras mca com 70% de etanol e deixe-o secar completamente.
      NOTA: O boli fecal geralmente pode ser limpo da câmara relativamente facilmente com toalhas de papel antes do etanol/desinfetante. Se for necessária uma limpeza mais completa, as câmaras 2 e 3 podem ser desmontadas e imersas em água morna e com sabão.
    8. Depois de executar todos os ratos em uma coorte com a altura da sonda definida a zero, insira uma folha de 3 mm de acrílico sob a placa de base da sonda mecânica e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.7 com uma altura de sonda de 2 mm.
    9. Depois de rodar todos os ratos com a altura da sonda definida para 2 mm, insira uma segunda folha de 3 mm de acrílico sob a placa base da sonda e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.7 com uma altura de sonda de 5 mm.
      NOTA: Um grupo de 8 camundongos pode ser testado em aproximadamente 2 h usando esta abordagem. Use tamanhos de grupo menores se for necessário um tempo pós-droga mais preciso (por exemplo, para um experimento de curso de tempo de drogas).
    10. Faça uma limpeza final com um desinfetante no final de uma sessão de teste.
  5. Repita os testes após induzir a hipersensibilidade da dor e/ou com tratamento medicamentoso.
  6. Compare o desempenho de cada rato na linha de base com seu desempenho após a dor ser induzida. Avaliar o impacto de uma intervenção farmacológica comparando animais tratados com animais tratados com drogas ao mesmo tempo.
  7. Realize análise estatística não paramétrica (por exemplo, o Teste U Mann Whitney) se os animais atingirem o corte de 2 min sem satisfazer a medida de desfecho desejada, resultando em dados não contínuos.

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Resultados

O ensaio MCA tem sido usado com sucesso com vários modelos de dor de rato mecanisticamente distintos. A Figura 2 mostra dados onde a medida de escolha foi o cruzamento do ponto médio da câmara 2 (Figura 2A). Os dados obtidos usando o meio-termo versus fuga na câmara 3 são muito semelhantes, ~40 s para a metade versus ~45 s para a fuga da câmara 3 no modelo de lesão nervosa poupada (SNI) de dor neuropática com altura da sonda de 5 mm13.

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Discussão

Como em todos os testes comportamentais, o manuseio adequado, a randomização e a cegueira ao tratamento dos animais são essenciais em todos os momentos. Dadas as insumos multifatoriais em comportamentos complexos e tomada de decisões, é imperativo que os animais sejam manuseados, habituados e testados da forma mais consistente possível, minimizando a angústia. Deve-se também ter cuidado para reproduzir o tempo de colocação do mouse na câmara 1, ligar as luzes LED e remover a barreira, uma vez que as diferenças aqui podem...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes para divulgar.

Agradecimentos

A GM é apoiada por uma Bolsa de Pós-Graduação NDSEG. O VLT é apoiado pela concessão do NIH NIGMS #GM137906 e pela Fundação Rita Allen. A AJS é apoiada pelo Departamento de Defesa concede W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 e a Fundação Rita Allen. Somos gratos ao Dr. Alexxai Kravitz da Faculdade de Medicina da Universidade de Washington por projetar e disponibilizar gratuitamente os arquivos de impressora 3D para a placa de piso e sonda da câmara 2.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Luzes de tira LED brancas sintonizáveis de 32,8 pés 3000K-6000K, luzes de fita LED super brilhantes reguláveis com 600 LEDs SMD 2835LeproSKU: 410087-DWW-USPara câmara de iluminação 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
'cama de espigões' e 'câmara 2 andares' impressas em 3DShapewaysN/AOpcional, para sondas mecânicas como alternativa aos pinos de mapa embotados.
70% de etanolVáriosN/APara limpar o MCA entre camundongos.
Acryl-Hinge 2TAP PlasticsN/Apara fixar as tampas da câmara nas paredes traseiras. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Folha de acrílico fundido Chemcast, ClearTAP PlasticsN/Acom 3 mm de espessura. Para a parede frontal da câmara 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Acrílico Colorido Transparente, Vermelho Escuro Transparente - 50%TAP PlásticosN/A3mm de espessura. 50% de transmissão de luz. Para paredes e tampas das câmaras 2 e 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translúcido & Acrílico Colorido Opaco, Branco Opaco - 0.1%TAP PlásticosN/A3mm de espessura. Para paredes laterais e tampa da câmara 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Desinfetante (por exemplo, Quatricida)Pharmacal Research Laboratories, Inc.65020FPara desinfetar MCA no final de uma sessão de teste.
Marcadores e quadro de apagamento a secoVáriosN/APara adicionar informações experimentais ao início das imagens de vídeo.
VáriosN/Aopcionais, para sondas mecânicas. Use uma lixa para embotar as pontas afiadas antes de usar. Pode ser usado no lugar de peças impressas em 3D.
Toalhas de papelVáriosN/APara limpar/desinfetar MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Cimento AcrílicoTAP PlasticsN/APara montar chapas de acrílico em câmaras e fixar dobradiças. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
CronômetroVáriosN/APara registrar latências/tempos de permanência em tempo real ou a partir de vídeo gravado.
TemporizadorVáriosN/APara garantir que o LED acenda, a remoção da barreira e a conclusão do teste sejam cronometradas de forma consistente.
Câmara de vídeoVáriasHDRCX405 Câmara de vídeo HandycamPara gravar o comportamento do rato no dispositivo MCA. Pode ser substituído por qualquer câmera de vídeo de nível de consumidor com resolução de 1080p.
Tripé FamallN/AQualquer tripé que possa segurar a câmera na altura da bancada para gravar imagens MCA é aceitável.

Referências

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