Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

Summary

Aqui, descrevemos um conjunto de métodos para caracterizar a interação de proteínas com membranas de células ou microvesculas.

Abstract

No corpo humano, a maioria das principais reações fisiológicas envolvidas na resposta imune e coagulação sanguínea prosseguem nas membranas das células. Um primeiro passo importante em qualquer reação dependente da membrana é a ligação de proteína na membrana fosfolipítida. Uma abordagem para estudar a interação proteica com membranas lipídicas foi desenvolvida usando proteínas fluorescentes rotuladas e citometria de fluxo. Este método permite o estudo de interações proteína-membrana utilizando células vivas e vesículas fosfolipítias naturais ou artificiais. A vantagem deste método é a simplicidade e disponibilidade de reagentes e equipamentos. Neste método, as proteínas são rotuladas usando corantes fluorescentes. No entanto, tanto proteínas auto-fabricadas quanto comercialmente disponíveis, podem ser usadas proteínas fluorescentes. Após a conjugação com um corante fluorescente, as proteínas são incubadas com uma fonte da membrana fosfolipítida (microvesculas ou células), e as amostras são analisadas por citometria de fluxo. Os dados obtidos podem ser usados para calcular as constantes cinéticas e o equilíbrio K_d. Além disso, é possível estimar o número aproximado de locais de ligação de proteínas na membrana fosfolipídida usando contas especiais de calibração.

Introduction

Os biomembranos separam o conteúdo interno das células animais e do espaço extracelular. Note que as membranas também circundam microvesículos formados durante o ciclo de vida da célula e organelas. A membrana celular é predominantemente composta de lipídios e proteínas. As proteínas da membrana realizam funções de sinalização, estrutural, transporte e adesivo. No entanto, o bicamador lipída também é essencial para a inter-relação da célula animal com o espaço extracelular. Este artigo propõe um método para estudar a interação periférica de proteínas externas com a membrana lipídica.

O exemplo mais marcante de reações ocorrendo na camada de membrana externa de uma célula animal é a reação de coagulação sanguínea. Uma característica importante da coagulação sanguínea é que todas as principais reações procedem nas membranas fosfolipítidas das células e microvesculas decorrentes dessas células e não no plasma ^1,2,3. Reações dependentes de membrana incluem o processo de inicialidade da coagulação (nas membranas celulares do subendotélio, endotélio inflamado ou células imunes ativadas, com a participação de um fator tecidual), todas as reações da principal cascata-ativação dos fatores IX, X, protrombina; ativação do fator XI por trombina (nas membranas de plaquetas ativadas, eritrócitos, lipoproteínas e microvesculas); reações da via da proteína C; inativação de enzimas de coagulação (nas membranas das células endoteliais com a participação de cofatores trombomodulinas, receptor de proteína endotelial C, sulfato heparano); e reações de via de contato (em membranas de plaquetas e algumas microvesculas com a participação de cofatores desconhecidos). Assim, é impossível investigar a coagulação sanguínea sem estudar a interação de várias proteínas plasmáticas com a membrana das células sanguíneas.

Este artigo descreve um método baseado em fluxo-citometria para caracterizar a interação de proteínas com membranas lipídicas de células ou microvesculas. Esta abordagem foi inicialmente proposta para estudar a interação do plasma de sangue com plaquetas e vesículas fosfolipítias artificiais. Além disso, a maioria das proteínas estudadas interagem diretamente com fosfolipídios de membrana carregados negativamente, particularmente com fosfatidylserina ^4,5. Além disso, existem proteínas cuja interação com a membrana é mediada por receptores especiais⁶.

Uma importante habilidade de citometria de fluxo é discriminar entre ligantes livres e vinculados sem separação adicional. Esta característica da citometria permite o estudo da ligação de ligantes no ponto final e ajuda a realizar medições cinéticas contínuas. A técnica não é sofisticada e não requer preparação complexa da amostra. A citometria de fluxo é usada ativamente para estudar quantitativamente a dinâmica de interação entre peptídeos fluorescentes, receptores e proteínas G em neutrófilos intactos e permeáveis^{detergentes 7}. Essa abordagem também é aplicável para explorar interações proteína-DNA e a cinética da atividade endonuclease em tempo real⁸. Com o tempo, este método foi utilizado para estudar quantitativamente interações proteína-proteína de alta afinidade com vesículas lipídicas^{purificadas 9}, ou, mais geralmente, com proteínas de membrana expressas em um sistema de expressão celular Sf9 altamente eficiente¹⁰. Métodos quantitativos também foram descritos para caracterizar interações proteína-lipossomo utilizando citometria de fluxo para proteínas transmembranas¹¹.

Esta técnica usa contas de calibração auto-feitas para evitar o uso de contas disponíveis comercialmente⁷. As contas de calibração utilizadas anteriormente⁷ destinavam-se a trabalhar com fluoresceína, o que restringiu substantivamente a variedade de ligantes fluorescentes acessíveis nas proteínas. Além disso, este artigo oferece uma nova maneira de adquirir e analisar dados cinéticos para resolução de tempo razoável. Embora este método seja descrito para vesículas fosfolipídicas artificiais, não há limitações óbvias para sua adaptabilidade às células, vesículas naturais ou vesículas fosfolipídicas artificiais com uma composição lipídica diferente. O método aqui descrito permite a estimativa dos parâmetros de interação (k_on, k_off) e equilíbrio (K_d) e facilita a caracterização quantitativa do número de sítios de ligação proteica na membrana. Observe que esta técnica fornece uma estimativa aproximada do número de locais de ligação. As vantagens do método são sua relativa simplicidade, acessibilidade e adaptabilidade às células nativas e microvesculas naturais e artificiais.

Protocol

1. Rotulagem de proteínas fluorescentes

1. Preparação do material
   1. Prepare 1 M tampão de bicarbonato de sódio, pH 9.0, armazene-o a 4 °C e use-o dentro de uma semana.
   2. Prepare 1,5 M de tampão de cloridrato de hidroxilamina, pH 8,5, imediatamente antes de usar.
   3. Prepare uma solução de 10 mg/mL de corante fluorescente (ver a Tabela de Materiais) em dimetilsulfoxida.
      NOTA: Esta solução pode ser armazenada por um mês a -20 °C no escuro.
   4. Prepare soluções de anticorpos purificados ou outras proteínas a 1-10 mg/mL.
      NOTA: Evite tampões contendo íons de amônio ou aminas primárias. Substitua os tampões que contêm Tris ou glicerol por soro fisiológico tamponado por diálise. Nem o azida de sódio (≤3 mM) nem o thimerosal (≤1 mM) afetarão significativamente a reação de conjugação.
   5. Incubar o meio de filtragem de gel (ver a Tabela de Materiais) para purificação de proteínas em PBS durante a noite a temperatura ambiente ou por 2 h a 60 °C. Aplique o meio de filtragem de gel em colunas de giro com membranas de 0,2 μm.
2. Calcule a quantidade de corante reativo a ser utilizado para cada reação de acordo com a concentração de proteína a ser rotulada usando Eq (1).
   
   Onde_{o corante} V é o volume da solução de estoque de corante; C_pr, V_pr e MW_pr é a concentração, volume e peso molar da proteína; Mw_corante é o peso molar de corante; 100 é um fator de conversão unitária; Mr é a razão molar de corante para proteína na mistura de reação.
   NOTA: Recomenda-se o seguinte MRs para reações de rotulagem de IgG: MR = 40 se o anticorpo estiver em 1-3 mg/mL ou MR = 30 se o anticorpo estiver em 4-10 mg/mL. Para fatores de coagulação, mr = 5 é geralmente usado.
3. Reação de conjugação
   1. Em um tubo de reação, misture a solução proteica com um volume 10x menor de 1 M de solução de bicarbonato.
   2. Adicione a quantidade necessária de corante fluorescente (ver passo 1.2) com agitação contínua.
   3. Incubar a mistura de reação à temperatura ambiente por aproximadamente 1h, protegido da luz e com agitação contínua.
   4. Para cada 200 μL de solução proteica, adicione 5 μL de 1,5 M de cloridrato de hidroxilamina.
   5. Incubar a mistura de reação à temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos, protegido da luz e com agitação contínua.
4. Prepare a coluna de giro.
   1. Adicione 500 μL de meio de filtragem de gel para purificação de proteínas a uma coluna. Centrifugar a coluna por 3 min a 1.000 × g.
   2. Descarte o tampão do tubo de coleta. Se a coluna não estiver cheia, adicione mais meio de filtragem de gel e centrifugar a coluna por 3 minutos a 1.000 × g. Repita esta etapa até que a coluna esteja cheia.
5. Purificação
   1. Centrifugar a mistura de reação (a partir do passo 1.3.5) por 5 min a 17.000 × g e remover o precipitado.
   2. Transfira o supernatante para a coluna de giro com meio de filtragem de gel. Deixe a solução absorver na cama de gel.
   3. Use um tubo de coleta vazio para a coluna de giro e centrífuga por 5 min a 1.000 × g. Após a centrifugação, colete a proteína rotulada do tubo de coleta.
6. Determinação do grau de rotulagem
   1. Corrija para a contribuição do corante para a absorvância em A₂₈₀ medindo a absorvência de corante livre a 280 nm (A₂₈₀) e o λ_max para o corante (A_max) (ver Eq (2)).
      (2)
   2. Meça a absorvância do conjugado de proteína-corante a 280 nm (A₂₈₀) e o λ_max para o corante (A_max) e calcule a concetração proteica usando Eq (3).
      (3)
      Onde ε_M é o coeficiente de extinção molar da proteína a 280 nm; d é o comprimento do caminho óptico durante a medição da absorvância; CF é a contribuição do corante para a absorvância em A₂₈₀ (etapa 1.6.1).
   3. Calcule o grau de rotulagem (DOL) utilizando Eq (4).
      (4)
      Onde ε _{corante M} é o coeficiente de extinção molar do corante a λ_max nm; d é o comprimento do caminho óptico durante a medição da absorvância; A_proteína C é a concentração da proteína (passo 1.6.2).

2. Preparação de vesículas fosfolipísides

1. Preparação e armazenamento da mistura lipídica
   1. Combine os lipídios na razão apropriada (fosfaticdylserine/fosphatidylcholina a uma proporção de 20 mol% a 80 mol%).
   2. Seque a mistura lipídica após a liofilização ou evaporação e armazene-a sob uma atmosfera inerte em ampolas de vidro.
2. Produção de filmes lipídes
   1. Abra a ampola e resuspenque a mistura lipídica em uma pequena quantidade (~100 μL) de clorofórmio.
      NOTA: Não use muito clorofórmio, pois não evapora completamente.
   2. Adicionar DiIC16(3) no etanol em 0,2 mol%. Transfira a mistura lipídica para um frasco fundo redondo. Espalhe a mistura finamente sobre os lados do frasco girando-a. Seque a mistura lipídica por 30 minutos sob um córrego de argônio.
3. Hidratação da mistura lipídica
   1. Adicione um tampão aquoso adequadamente quente (~55 °C) (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) em um volume correspondente à concentração lipídica esperada ao frasco com o filme lipídeca. Incubar a mistura com vórtice a 55 °С por 30 min para hidratação completa.
   2. Colocar o tubo de amostra em um congelador ou termostato quente para fazer com que a suspensão lipídica passe por ciclos de congelamento de 3-5.
4. Formação de vesículas lipídicas por extrusão
   1. Prepare a extrusora de acordo com as instruções do fabricante. Aqueça todos os componentes extrusoras à temperatura de transição de fase da mistura lipídica.
   2. Encha uma das seringas extrusoras com a mistura lipídica hidratada. Aguarde de 5 a 10 minutos para que a temperatura da suspensão lipídica se equilibre com a temperatura da extrusora.
   3. Extrude a mistura lipídica através da membrana pelo menos 10 vezes. Para a extrusão final, coloque a suspensão lipídica na seringa alternativa e procure uma mudança na aparência de uma solução ligeiramente nebulosa para uma solução clara.
   4. Armazene a mistura resultante de vesículas lipídicas a 4 °C, de preferência em uma atmosfera inerte de argônio ou nitrogênio, por 3-4 dias. Não congele.

3. Isolamento de plaquetas de sangue inteiro

1. Coletar sangue inteiro de doadores saudáveis em tubos contendo 3,2% de citrato de sódio.
2. Adicione prostaglandina E1 (PGE1) (1 μM) e apirágua (0,1 U/mL) ao sangue, seguida de centrifugação à temperatura ambiente a 100 × g por 8 min.
3. Após a centrifugação, pegue o plasma rico em plaquetas e adicione a solução de citrato de sódio (106 mM, pH 5.5) a uma razão plasma/citrato de 3:1. Centrifugar o plasma à temperatura ambiente a 400 × g por 5 min.
4. Remova o supernasciente e resuspenque a pelota em 300 μL do buffer de Tyrode sem BSA (HEPES de 20 mM, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM de glicose, pH 7.4). Purifique as plaquetas de proteínas plasmáticas por cromatografia de gel no meio de filtragem de gel para purificação de plaquetas (ver a Tabela de Materiais).

4. Detecção de proteína - interação lipídica por citometria de fluxo

1. Experimentos de ligação cinética
   1. Vesículas fosfolipítidas diluídas (a partir do passo 2.4.4) no buffer de Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM de glicose, 0,5% BSA, pH 7,4) a uma concentração de 1 μM e volume total de 250 μL.
   2. Misture o fator de coagulação com rótulo fluorescente X (fX-fd) do passo 1 a uma concentração de 500 nM com as vesículas fosfolipídidas da etapa 4.1.1 em uma razão de 1:1 (concentração vesícula final 0,5 μM, a concentração fX-fd é de 250 nM de fX) para um volume total de 500 ΜL.
   3. Injete imediatamente os 500 μL da suspensão mista (~20 min para análise com baixa vazão) no citômetro de fluxo. Use uma baixa taxa de fluxo e certifique-se de que o limite para o canal FL2 (exсitation 488 nm, filtro de emissão 585/42 nm) é o valor 200. Meça a fluorescência média no canal FL4 (exсitação 633 nm, filtro de emissão 660/20) para o corante de fluorescência da Tabela de Materiais.
      NOTA: Escolha um cítômetro sem um autosampler. Isso acelerará o processo de injeção da amostra na célula de medição.
   4. Quando a saturação da ligação for alcançada (nenhum aumento significativo da fluorescência dentro de 5 min), dilui rapidamente a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode, e monitora a dissociação até que a fluorescência da linha de base seja atingida (dissociação completa) ou até que um platô seja atingido (nenhuma diminuição significativa da fluorescência dentro de 5 min).
      NOTA: Como controle, adicione 10 μM EDTA e monitore a dissociação completa por 5 minutos.
2. Experimentos de vinculação de equilíbrio
   NOTA: Utilize a curva cinética de ligação para determinar o tempo para alcançar a saturação; o tempo para saturação para fX-fd e vesículas artificiais é de 20 min.
   1. Incubar vesículas fosfolipícidas artificiais (5 μM) para o ensaio de ligação com diferentes concentrações de fX-fd (de 0 a 1.000 nM) no buffer de Tyrode por 20 minutos.
   2. Diluir cada amostra da etapa 4.2.1 por 20x para um volume final de 200 μL com o buffer de Tyrode. Analise imediatamente a amostra diluída por citometria de fluxo dentro dos 30 s. Use as configurações do passo 4.1.3.
      NOTA: Como controle para ligação inespecífica, use amostras semelhantes com EDTA (10 μM) e incuba-as por 5 minutos.

5. Análise dos dados de citometria de fluxo

1. Experimentos de exportação em formato FSC do software de aquisição de dados de citometria ao software de citógrafo para análise de dados (ver a Tabela de Materiais). Escolha | de arquivos | de exportação Arquivos FCS. Abra arquivos FSC em software de citômetro para análise de dados selecionando os arquivos no computador e arrastando-os para o espaço de trabalho do programa.
2. Para a gating dos microvesículos, identifique a região dos microvesículos pela fluorescência do corante lipofílico DiIC₁₆(3). Use comandos de menu ou botão plot na planilha para criar ssc de gráfico de ponto a partir de FL2 (corante DilC₁₆(3)) nas coordenadas de log. Escolha o botão Portão Retangular para desenhar uma região de gating para que eventos de uma amostra sem vesículas não sejam incluídos nesta região (Figura 1B,C).
3. Analise os experimentos cinéticos.
   1. Crie um gráfico de pontos usando as coordenadas da fluorescência (FL4) ao longo do tempo para a região das vesículas (clique duas vezes na região de vesículas na etapa 5.2)
   2. Exporte os dados sobre a alteração da fluorescência ao longo do tempo no formato csv. Escolha | de amostra | com o botão direito do clique | de exportação Escolha FL4 e Time in Parameters | Selecione diretório para salvar | Selecione | de formato CSV Exportar.
   3. Abra o arquivo CSV em qualquer software estatístico (consulte a Tabela de Materiais). Calcule uma simples média móvel de fluorescência e tempo para cada 1.000 eventos.
   4. Aproxime-se de um gráfico da dependência da fluorescência média móvel simples no tempo sob a suposição de dependência exponencial (Análise > Montagem >Nonlinear Curve Fit) e use-o para calcular a constante associação cinética usando Eq (5).
      (5)
      Onde [X^B] é a concentração do fator vinculado em cada momento (unidades definidas pelo usuário) de acordo com a média móvel simples da etapa 5.3.3; [X] é a concentração de fator adicionado; [X]_max é a concentração máxima do fator vinculado; k é a constante de associação; T é a hora.
   5. Repita o mesmo conjunto de ações (5.3.1-5.3.4) para calcular a constante de dissociação cinética usando Eq (6).
      (6)
      Onde [X^B] é a concentração do fator vinculado em cada momento do tempo; [X]₀ é a concentração do fator vinculado no momento inicial do tempo; k é a constante de dissociação; T é a hora.
4. Ensaio de ligação de equilíbrio
   1. Determine a fluorescência média de fX-fd na região das vesículas para cada concentração selecionada de fX-fd.
   2. Aproximar a dependência da fluorescência fator limite da concentração do fator adicionado na suposição de simples vinculação de um único local. Calcule os parâmetros de ligação média usando Eq (7) a partir de três repetições independentes no mínimo.
      (7)
      Onde [X^B] é a concentração do fator vinculado; [X] é a concentração de fator adicionado; n^x é o número aparente de sites de vinculação por vesícula; K_d é a aparente constante de dissociação.

6. Conversão da intensidade da fluorescência para o número médio de locais de ligação

1. Prepare contas calibradas.
   1. Incubar plaquetas filtradas em gel (ver passo 3.3) com A23187 (10 μM) na presença de CaCl₂ (2,5 mM) por 10 minutos à temperatura ambiente.
   2. Adicione às plaquetas ativadas as várias concentrações de fX-fd (0 a 1.000 nM). Adicione 2% v/v de formaldeído e incubar por 1h. Pare a reação incubando as plaquetas com 3 M de glicecina e 5% de BSA por 30 min a temperatura ambiente.
   3. Purificar a mistura do corante não redigido. Centrifugar as plaquetas por 5 min a 400 × g, remover o supernascimento e resuspensar a pelota no tampão de Tyrode (contendo 0,5% de BSA).
      NOTA: Repita o passo 6.1.3 três vezes.
2. Meça o nível de fluorescência das contas de calibração em cada amostra primeiro usando um espectrômetro (para corante fluorescente da Tabela de Materiais, excitação 633 nm, emissão de 670 nm) e, em seguida, usando o citómetro de fluxo (no canal FL4: excitação 633 nm, filtro de emissão 660/20). Usando um contador de células, determine o número de contas em cada amostra.
3. Converta a intensidade de fluorescência de cada amostra de contas respectiva para a concentração de corante fluorescente solúvel usando um espectrofluorômetro. Recalcular a concentração de corante fluorescente para o número de moléculas de fluorforeiro usando Eq (8).
   (8)
   Onde N_x é o número de moléculas de fluoróforo; C é a concentração de corante fluorescente; N_A é a constante de Avogadro; N_A = 6,02214076×10²³ mol ^-1.
4. Crie um gráfico de dependência da fluorescência média das contas em um citômetro de fluxo (passo 6.2) sobre o número de moléculas fluorforas (ver passo 6.3) para cada amostra usando qualquer software estatístico (ver a Tabela de Materiais). Aproxima essa dependência por proporcionalidade de linha (Análise | Montagem | Ajuste linear). A partir da aproximação em Eq (9), calcule o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação.
   (9)
   Onde MF é a fluorescência média das contas por citometria de fluxo; Nx é o número de moléculas de fluoróforo por conta; A CF representa o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação. CF e b são obtidos a partir dos resultados da montagem do gráfico por proporcionalidade linear.
5. Calcule o número aparente de sites vinculantes por vesícula de interesse usando Eq (10).
   (10)
   Onde nx é o número aparente de sites vinculativos por vesícula de interesse; MF é a fluorescência média das vesículas de interesse por citometria de fluxo; CF e b são fatores de conversão do Eq (8).

Results

O método de citometria de fluxo descrito aqui é usado para caracterizar a ligação de proteínas de coagulação plasmática a plaquetas ativadas. Além disso, as vesículas fosfolipídidas PS:PC 20:80 foram aplicadas como um sistema de modelo. Este artigo se concentra principalmente em vesículas fosfolipísides artificiais como exemplo. Os parâmetros do citómetro, em particular, a tensão do tubo fotomultiplier (PMT) e a compensação devem ser selecionados para cada dispositivo específico, o objeto de estudo (células, microvescula...

Discussion

O método proposto pode ser adaptado para uma caracterização áspera da interação de proteínas com membranas fosfolipítidas de várias fontes e composições. A citometria quantitativa de fluxo descrita aqui concede ressonância plasmon superficial (SPR) em vários parâmetros. Em particular, tem menor sensibilidade e resolução de tempo e requer rotulagem fluorescente de proteínas. A rotulagem fluorescente pode levar a uma mudança na conformação e perda de atividade para muitas proteínas e, portanto, requer um controle cuidadoso...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Éster (Éster Succinimidílico)	Thermo Fisher Scientific	A37573	corante fluorescente
Apirase de batatas	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
albumina de soro bovino	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Cloreto de cálcio, anidro, pó, ≥ 97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Cary Eclipse Espectrômetro de Fluorescência	Agilent
D- (+) -Glicose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16 (3) (1,1'-Dihexadecil-3,3,3',3',3'-Perclorato de Tetrametilindocarbocianina)	Thermo Fisher Scientific	D384
	DMSO Sigma Aldrich	D8418
Sal dissódico EDTA	VWR Ciências da Vida AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	de aquisição de dados de citometria	Bioscience
Software de citómetro FlowJo		Tree Star
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Enzyme research	HFX 1010
Cloridrato de hidroxilamina	Panreac	141914.1209
L-&alfa;-fosfatidilcolina (Cérebro, Suíno)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-&alfa;-fosfatidilserina (Cérebro, Suíno) (sal de sódio)	Avanti Polar Lipids	840032P
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extrusora	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Software estatístico
Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS), grau de biotecnologia	VWR Life Science AMRESCO	97062-732
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandina E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	meio de filtração em gel para purificação de proteínas
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	meio de filtração em gel para purificação de plaquetas
Bicarbonato de sódio	Corning	61-065-RO
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S3014-500G
Fosfato de sódio monobásico	Sigma Aldrich	S3139-250G
Colunas de rotação com membrana 0.2 µ m	Sartorius	VS0171
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma Aldrich	S1804-1KG