Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina

Resumo

Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples e bem estabelecido ensaio colorimétrico que pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios.

Resumo

O ferro é um micronutriente essencial. Tanto a sobrecarga de ferro quanto a deficiência são altamente prejudiciais para os seres humanos, e os níveis de ferro tecidual são finamente regulados. O uso de modelos animais experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro tem sido fundamental para o avanço do conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação sistêmica e celular da homeostase de ferro. A medição dos níveis totais de ferro em tecidos animais é comumente realizada com espectroscopia de absorção atômica ou com um ensaio colorimétrico baseado na reação de ferro não heme com um reagente de banho-phenanthrolina. Por muitos anos, o ensaio colorimétrico tem sido usado para a medição do teor de ferro não-heme em uma ampla gama de tecidos animais. Ao contrário da espectroscopia de absorção atômica, exclui a contribuição do ferro heme derivado da hemoglobina contida em glóbulos vermelhos. Além disso, não requer habilidades analíticas sofisticadas ou equipamentos altamente caros, podendo, assim, ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios. Finalmente, o ensaio colorimétrico pode ser baseado em cuvette ou adaptado a um formato de microplape, permitindo maior rendimento amostral. O presente trabalho fornece um protocolo bem estabelecido que é adequado para a detecção de alterações nos níveis de ferro tecidual em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro.

Introdução

O ferro é um micronutriente essencial, necessário para a função de proteínas envolvidas em processos biológicos cruciais, como transporte de oxigênio, produção de energia ou síntese de DNA. É importante ressaltar que tanto o excesso de ferro quanto a deficiência de ferro são altamente prejudiciais à saúde humana, e os níveis de ferro tecidual são finamente regulados. Absorção anormal de ferro dietético, dietas deficientes de ferro, transfusões de sangue repetidas e inflamação crônica são causas comuns de distúrbios associados ao ferro que afetam bilhões de pessoas em todo o ^mundo1,2,3.

Modelos experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro têm sido fundamentais para avançar nosso conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação sistêmica e celular da homeostase ^{de ferro4}. Apesar dos progressos substanciais feitos nas últimas duas décadas, muitos aspectos-chave permanecem evasivos. Nos próximos anos, a medição precisa dos níveis totais de ferro nos tecidos animais continuará sendo um passo crítico para avançar nas pesquisas no campo da biologia do ferro.

A maioria dos laboratórios quantifica o ferro tecidual com espectroscopia de absorção atômica (AAS), espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS), ou um ensaio colorimétrico baseado na reação de ferro não heme com um reagente de banho-phenanthrolina. Este último é baseado no método original descrito por Torrance e Bothwell há mais de 50 anos^{, 5,6}. Embora uma variação deste método tenha sido posteriormente desenvolvida empregando ferrozina como alternativa à batiphenanthrolina7, este último continua sendo o reagente cromogênico mais citado na literatura.

O método de escolha muitas vezes depende da expertise e infraestrutura disponíveis. Embora a AAS e a ICP-MS sejam mais sensíveis, o ensaio colorimétrico permanece amplamente utilizado porque apresenta as seguintes vantagens importantes: i) exclui a contribuição do ferro heme derivado da hemoglobina contida em glóbulos vermelhos; ii) não requer habilidades analíticas sofisticadas ou equipamentos altamente caros; e iii) o ensaio original baseado em cuvette pode ser adaptado a um formato de microplape, permitindo maior rendimento amostral. A abordagem colorimétrica apresentada neste trabalho é rotineiramente utilizada para quantificar alterações nos níveis de ferro não heme de tecido em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro, de roedores a peixes e moscas frutíferas. Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples, bem estabelecido, ensaio colorimétrico que a maioria dos laboratórios deve encontrar fácil de implementar.

Protocolo

Os camundongos C57BL/6 foram comprados comercialmente e os ratos hepcidin-nulos (Hamp1^−/−) em um fundo C57BL/⁶⁸ foram um presente gentil de Sophie Vaulont (Institut Cochin, França). Os animais foram alojados na instalação de animais i3S em condições específicas sem patógenos, em um ambiente controlado pela temperatura e pela luz, com livre acesso à comida padrão de roedores e água. O robalo europeu (Dicentrarchus labrax) foi comprado em uma fazenda comercial de peixes e alojado na instalação de animais icbas, em um ambiente controlado pela temperatura e luz, e alimentado diariamente com alimentação padrão de robalo. Todos os procedimentos envolvendo animais vertebrados foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do I3S e pela autoridade nacional, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informações sobre reagentes comerciais, equipamentos e animais estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação da solução

NOTA: Manuseie e prepare todos os reagentes e soluções com vidros sem ferro ou plásticos descartáveis. Não permita que materiais de laboratório metálicos (por exemplo, espátulas de aço inoxidável) entrem em contato com qualquer reagente ou solução, devido ao risco de contaminação do ferro. Certifique-se de que qualquer vidro reutilizável esteja livre de ferro. Lave os materiais com detergente laboratorial adequado por 30-60 min, enxágue com água deionizada, mergulhe durante a noite em uma solução de ácido nítrico de 37% diluída 1:3 com água deionizada, enxágue novamente com água deionizada e deixe secar.

1. Mistura de ácido: Adicione 10 g de ácido tricloroacético a 82,2 mL de ácido clorídrico de 37% em uma garrafa de vidro, dissolva completamente e ajuste o volume final para 100 mL com água desionizada. Agite antes de usar. Alternativamente, use apenas 37% de ácido clorídrico para digestão tecidual.
   NOTA: A solução é estável por pelo menos 2 meses quando armazenada em garrafas de reagente de vidro marrom escuro.
   ATENÇÃO: O ácido clorídrico e o ácido tricloroacético são corrosivos, e as formas concentradas liberam vapores ácidos tóxicos. Use roupas protetoras, luvas resistentes a químicos e óculos químicos ao todo momento ao manusear ácidos. Evite respirá-los e sempre manuseie ácidos sob um capô de fumaça.
2. Acetato de sódio saturado: Adicione 228 g de acetato de sódio anidro a 400 mL de água desionizada em uma garrafa de vidro e agitar durante a noite à temperatura ambiente. Deixe a solução descansar e precipitar por um dia. Se não ocorrer precipitação, continue adicionando pequenas quantidades de acetato de sódio. Guarde a solução em uma garrafa de vidro.
3. Reagente de cromogen: Para preparar 1 mL de reagente de cromogen, adicione 1 mg de 4,7-difenil-1,10-fenrodline disulfonic ácido dissofeno sal de dissodium a 500 μL de água desionizada e 10 μL de ácido tioglicólico concentrado (100%) e completamente dissolvido. Coma o volume final de 1 mL com água deionizada.
   NOTA: Prepare o máximo de reagente cromógeno necessário. A solução é estável por 1 mês quando protegida contra a luz.
4. Reagente de Cromogen de Trabalho (WCR): Adicione 1 volume do Reagente de Cromogen a 5 volumes de acetato de sódio saturado e 5 volumes de água desionizada.
   NOTA: Esta solução deve ser preparada recentemente no dia do uso.
5. Solução padrão de ferro de estoque: Para preparar uma solução de ferro de estoque de 20 mM, coloque 111,5 mg de pó de ferro carbonil em um frasco volumoso de 250 mL contendo 5.480 μL de ácido clorídrico de 37%. Deixe dissolver-se durante a noite à temperatura ambiente (ou incubar em um banho de água fervente). Em seguida, compõem a solução para um volume final de 100 mL com água deionizada.
   NOTA: A solução padrão pode ser mantida indefinidamente quando armazenada em um vaso bem selado.
6. Solução padrão de ferro de trabalho (WISS): Adicione 13,5 μL de ácido clorídrico de 37% a 500 μL de água deionizada. Adicione 10 μL da Solução Padrão de Ferro de Estoque e coma o volume final de 1 mL com água deionizada (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; medido por AAS).
   NOTA: A solução de trabalho deve ser preparada recentemente no dia do uso.

2. Secagem de amostras

1. Corte uma amostra de tecido pesando 10-100 mgs com uma lâmina de bisturi. Pese-o com precisão em uma balança analítica/de precisão sobre um pequeno pedaço de parafilme (Peso Fresco).
2. Usando pinças plásticas, coloque o pedaço de tecido em uma placa de 24 poços (deslacaçada para permitir a evaporação da água) e deixe secar em uma incubadora padrão a 65 °C por 48 h.
3. Alternativamente, use um forno de digestão de micro-ondas de laboratório para secagem de amostras de tecido. Usando pinças plásticas, coloque o pedaço de tecido pesado em um copo de Teflon sem ferro e seque-o no micro-ondas. Defina os parâmetros de operação de acordo com o manual de instruções do instrumento.
   NOTA: Como referência, os parâmetros operacionais para a secagem de amostras hepáticas utilizando o forno de digestão específico (ver Tabela de Materiais) são mostrados na Tabela 1.
4. Usando pinças plásticas, coloque cada pedaço seco de tecido sobre um pequeno pedaço de parafilm dentro de uma balança analítica/de precisão e pese-o com precisão (Peso Seco).

3. Digestão ácida da amostra

1. Usando pinças plásticas, transfira cada pedaço seco de tecido para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.
2. Adicione 1 mL da mistura de ácido e feche o tubo de microcentrífuga. Prepare um ácido em branco da mesma forma, exceto que o tecido é omitido.
   ATENÇÃO: A mistura de ácido é corrosiva e libera vapores tóxicos. Use roupas protetoras, luvas resistentes a químicos e óculos químicos ao manusear a mistura de ácido. Evite respirar e sempre manuseie-o sob um capô de fumaça.
3. Digerir os tecidos incubando os tubos de microcentrifusagem em uma incubadora a 65 °C por 20 h.
4. Após o resfriamento para a temperatura ambiente, transfira 500 μL do extrato de ácido claro (amarelo) (supernante) em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma micropipette equipada com pontas plásticas. Se não for possível obter um supernatante claro, realize um giro de centrifugação curta.
   ATENÇÃO: O supernatante é altamente ácido. Use roupas protetoras, luvas resistentes a químicos e óculos químicos ao manusear os supernantes. Sempre manuseie-os sob um capô de fumaça.
   NOTA: Neste ponto, os extratos de ácido podem ser imediatamente utilizados para o ensaio colorimétrico ou congelados a -20 °C para uso posterior. Descongele completamente amostras congeladas à temperatura ambiente e vórtice antes de usá-las.

4. Desenvolvimento de cores

1. Prepare reações de cromógenos conforme indicado na Tabela 2 em tubos de microcentrífugo de 1,5 mL ou, para maior rendimento, diretamente na parte inferior plana, 96-bem, claras, microplaais de poliestireno não tratadas. Prepare todas as reações (ácido em branco, padrão e amostra) pelo menos em duplicata.
2. Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.

5. Leitura de absorvência

1. Meça a absorvância da amostra em um espectrofotômetro ou leitor de placas em um comprimento de onda de 535 nm contra uma referência de água deionizada. As placas podem ser lidas sem desabis ou tampadas. No caso do tampado, remova qualquer condensação formada devido à liberação de vapores ácidos da tampa pouco antes da medição para evitar possíveis interferências na leitura de absorvância.
   NOTA: A absorvância óptica da leitura em branco ácido contra água deionizada (referência) deve ser inferior a 0,015; a absorção óptica do padrão e as amostras devem estar entre 0,100 e 1.000. Para amostras com teor de ferro muito alto ou muito baixo, os volumes de extrato ácido (supernante) e _diH2O podem precisar ser ajustados (Tabela 2): se a absorção for maior que 1,0, utilize um volume menor de amostra (sobrenante); quando a absorção for inferior a 0,1, use um volume maior do supernaspe. O volume amostral (_Vsmp) é levado em conta ao calcular o teor de ferro de tecido de cada amostra (ver passo 6).

6. Cálculo do teor de ferro de tecido

1. Calcule o teor de ferro de tecido não heme com a seguinte equação:
   Ferro de tecido (tecido seco μg/g) =
   _AT = absorvância da amostra de ensaio
   _AB = absorvância de ácido em branco
   _AS = absorção de padrão
   _Fes = concentração de ferro de WISS (μg Fe/mL)
   W = peso do tecido seco (g)
   _Vsmp = volume amostral (volume variável de Supernatant na Tabela 2 convertido em mL)
   _Vf = volume final de mistura ácida após a incubação durante a noite a 65 °C (correspondente ao volume ácido mais volume de tecido seco em mL; se os pesos amostrais não diferem significativamente, assuma um volume constante ≈ 1 mL)
   _Vstd = volume padrão de ferro (volume de WISS na Tabela 2 convertido em mL)
   _Vrv = volume de reação final (Volume total na Tabela 2 convertido em mL)

Resultados

Cuvette versus comparação de microplacões de 96 poços
A medição do tecido não-heme ferro por reação com um reagente de banho-phenanthrolina originalmente descrito por Torrance e ^Bothwell5,6 conta com o uso de um espectrofotômetro para leitura de absorvência. Assim, os volumes empregados na reação cromogênica são compatíveis com o tamanho de um cuvette espectrofotômetro regular. O presente trabalho descreve uma adaptação do método em que as rea...

Discussão

Um protocolo para a medição do teor de ferro não-heme em tecidos animais é fornecido, utilizando uma adaptação do ensaio colorimétrico à base de banho-phenrodina originalmente descrito por Torrance e ^Bothwell5,6. As etapas críticas do método são a secagem da amostra de tecido; desnaturação proteica e liberação de ferro inorgânico por hidrólise ácida; redução do ferro férrico (^Fe3+) ao estado ferroso (^Fe2+) na presença do agente redutor do ác...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa transparente UV de 96 poços	Sarstedt	82.1581.001
Balança analítica	Kern	ABJ 220-4M
Acetato de sódio anidro	Merck	106268
sulfonato de batofenantrolina (ácido dissulfônico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL / 6 camundongos (Mus musculus< / em>)	da Charles River Laboratories
, ≥ 99,5%	Sigma-Aldrich	44890
Cuvetes descartáveis em polimetilmetacrilato (PMMA)	VWR	634-0678P
Água duplamente destilada e estéril	B. Braun	0082479E
Leitor de microplacas de fluorescência	BioTek Instruments	FLx800
Ácido clorídrico, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Forno de digestão de microondas e xícaras de teflon branco	CEM	MDS-2000
Ácido nítrico	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Ração para roedores	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Dieta de manutenção de roedores contendo 175 mg/kg de ferro
Robalo (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Alimentação de robalo	Skretting	L-2 Alterna 1P
Espectrofotômetro UV-Vis de feixe único	Shimadzu	UV mini 1240
Ácido tioglicólico	Merck	100700
Ácido tricloroacético	Merck	100807