Artigo de método

Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium Phormidium lacuna

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 de fevereiro de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Neste artigo

Resumo

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Phormidium lacuna é um cianobacterium filamentoso que foi isolado de piscinas marinhas. Este artigo descreve o isolamento de filamentos de fontes naturais, extração de DNA, sequenciamento de genomas, transformação natural, expressão de sfGFP, crioconservação e motilidade.

Resumo

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As cianobactérias são o foco de pesquisas básicas e projetos biotecnológicos nos quais a energia solar é utilizada para a produção de biomassa. Phormidium lacuna é um recém-isolado cianobacterium filamentous. Este artigo descreve como novas cianobactérias filamentosas podem ser isoladas das piscinas marinhas. Também descreve como o DNA pode ser extraído de filamentos e como os genomas podem ser sequenciados. Embora a transformação seja estabelecida para muitas espécies unicelulares, é menos frequentemente relatada para cianobactérias filamentosas. Um método simplificado para a transformação natural de P. lacuna é descrito aqui. P. lacuna é o único membro da ordem Oscillatoriales para o qual a transformação natural é estabelecida. Este artigo também mostra como a transformação natural é usada para expressar proteína fluorescente verde superpatos (sfGFP). Um promotor endógeno do CPCB induziu aproximadamente 5 vezes mais expressão do que os promotores do CPC560, A2813 ou psbA2 do Synechocystis sp. PCC6803. Além disso, foi estabelecido um método para a criopreservação de P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803, e são descritos métodos para avaliação da motilidade em meio líquido e em superfícies de ágar e plástico.

Introdução

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Cianobactérias são organismos procarióticos que utilizam a fotossíntese como fonte de energia 1,2. A pesquisa está cada vez mais focada em espécies cianobacterianas. Várias cianobactérias podem ser transformadas com DNA3. Genes podem ser eliminados ou superexpressos nestas espécies. No entanto, a transformação é restrita a algumas espécies 4,5,6,7,8,9,10,11, e pode ser difícil estabelecer transformação em cepas de coleções culturais ou selvagens 8. Cepas da espécie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) foram isoladas de piscinas marinhas, nas quais as condições ambientais, como concentrações de sal ou temperatura, flutuam ao longo do tempo. Estas cianobactérias filamentosas podem ser usadas como organismos modelo para a ordem Oscillatoriales12 a que pertencem.

Durante os testes testando a transferência de genes por eletroporação13,14, descobriu-se que a P. lacuna pode ser transformada pela transformação natural15. Nesse processo, o DNA é tomado naturalmente por algumas células. Em comparação com outros métodos de transformação16,17, a transformação natural tem a vantagem de não exigir ferramentas adicionais que possam complicar o procedimento. Por exemplo, a eletroporação requer cuvetas adequadas, fios intactos e seleção da tensão adequada. P. lacuna é atualmente o único membro oscillatoriales suscetível à transformação natural. Como o protocolo original é baseado em protocolos de eletroporação, ele ainda incluía várias etapas de lavagem que podem ser desnecessárias. Diferentes abordagens foram testadas para simplificar o protocolo, levando ao protocolo de transformação aqui apresentado.

A sequência do genoma é essencial para outros estudos moleculares baseados em nocaute genético ou superexpressão. Embora as sequências de genoma possam ser obtidas com máquinas de sequenciamento de última geração em curtos períodos, a extração do DNA pode ser difícil e depende da espécie. Com P. lacuna, vários protocolos foram testados. Um método modificado de cetil trimethyl amônio (CTAB) foi então estabelecido, resultando em pureza aceitável dos rendimentos de DNA e DNA de cada ciclo de purificação para o trabalho contínuo em laboratório. O genoma de cinco cepas pode ser sequenciado com este protocolo. O próximo passo de transformação lógica foi estabelecer expressão proteica em P. lacuna.

O sfGFP usado como proteína marcadora neste protocolo pode ser detectado com qualquer microscópio de fluorescência. Todos os promotores que foram testados poderiam ser usados para a expressão P. lacuna sfGFP. O aumento do número de cepas decorrentes da transformação resultou na necessidade de um método para armazenar as culturas. Tais métodos são estabelecidos para Escherichia coli e muitas outras bactérias18. Nos protocolos padrão, culturas de glicerol são preparadas, transferidas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. Este método requer apenas alguns passos e é altamente confiável para as espécies para as quais é estabelecido. O protocolo padrão não era viável para P. lacuna porque as células vivas não podiam ser recuperadas em todos os casos. No entanto, quando o glicerol foi removido após o descongelamento, células de todos os ensaios sobreviveram. Métodos simples são apresentados para a análise da motilidade de P. lacuna, que pode ser combinada com mutagênese nocaute para investigar pili tipo IV ou o papel dos fotorreceptores. Estes ensaios são diferentes dos de cianobactériasunicelulares 19,20,21 e também podem ser úteis para outras Oscillatoria.

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Protocolo

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1. Isolamento do ambiente natural

NOTA: Algas verdes, diatomas, cianobactérias filamentosas e outras microalgas podem ser isoladas. O protocolo pode ser usado para qualquer espécie de microalga de piscinas de rochas que crescem em condições laboratoriais. Cianobactérias filamentosas que pertencem aos Oscillatoriales podem ser facilmente reconhecidas por seu movimento e forma filamentosa. A espécie pode ser identificada em um estado semiuso por sequenciamento de genoma ou sequenciamento de rRNA 16S.

  1. Transfira amostras líquidas de água do mar de piscinas marinhas (ou seja, cavidades na costa rochosa) em frascos de 50 mL. Para cada frasco, observe o local exato ou as coordenadas da fonte natural. Se possível, filtre o conteúdo através de redes de 50 μm para reduzir as quantidades de zooplâncton. Armazene as amostras a 4 °C até que possam ser subculturadas.
  2. Transfira culturas de 1 mL para pratos Petri de 10 cm contendo 3% de bacto-ágar em f/2 médio22,23 (ver a Tabela de Materiais). Prepare até 20 pratos. Cultive sob luz branca de 50 μmol m-2 s-1.
    NOTA: Podem ser utilizadas maiores intensidades de luz para o cultivo. A intensidade de até 400 μmol m-2 s-1 pode ser usada para P. lacuna, embora outras espécies possam ser mais sensíveis à luz.
  3. Após uma semana, transfira as células desejadas para placas frescas de ágar usando fórceps estéreis. Isole as células sob um microscópio binóculo sob condições estéreis. Armazene a placa de ágar velha a 4 °C até que as células apareçam e cresçam na nova placa de ágar.
  4. Repita esta etapa de transferência toda semana para eliminar a contaminação. Use o olho nu para detectar contaminação pesada e um microscópio com ampliação de 400x para verificações adicionais para contaminação.
  5. Se uma amostra parece livre de contaminação, teste para contaminação bacteriana ou fúngica em placas de ágar. Transfira uma fração da cultura com uma alça de inoculação para uma placa de ágar lb24 (10 cm de diâmetro), mantenha a placa em temperatura ambiente e verifique o crescimento de contaminantes ao longo de 1-3 dias.
  6. Se uma espécie cianobacteriana fiotoner estéril for obtida, use-a para mais trabalhos culturais. Cultivar P. lacuna em líquido ou em placas de bacto-ágar. Use frascos de 250 mL com 50 mL de meio f/2 ou f/2+ para cultura líquida.

2. Extração de DNA

NOTA: Este método é adotado a partir de 25 26

  1. Prepare dois frascos com 50 mL de meio f/2. Inocular cada um com ~1 mL de filamentos p. lacuna de outras culturas em crescimento. Mantenha as culturas por 7 dias ou mais sob agitação (rotação horizontal) a 50 rpm sob luz branca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
  2. Trate a cultura com ultrassom (veja a Tabela de Materiais) por 2 minutos com energia total. Medir OD a 750 nm; verificar para garantir que é ~0,5. Continue a crescer as culturas se o OD for muito baixo.
  3. Colete os filamentos em 5.000 × g, centrifugação de 20 min. Remova o supernatante. Transfira os filamentos com líquido residual para a câmara de uma Imprensa Francesa27. Coloque a pressão da imprensa francesa em 20.000 psi e extraia as células.
    NOTA: A imprensa francesa vai lise todas as células e liberar o DNA; forças de tesoura fortes produzirão fragmentos de DNA de 1.500 bp.
  4. Centrifugar a amostra por 10 minutos a 10.000 × g e remover o sobrenante.
  5. Adicione 400 μL de tampão de lise (4 M de ureia, 0,1 M Tris/Cl, pH 7.4) e 50 μL de proteinase K (10 mg/mL) à pelota. Aqueça a amostra a 55 °C por 60 min com agitação a 550 rpm.
  6. Adicione 1 mL de tampão de extração de DNA (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) e incubar por 60 min a 55 °C e 550 rpm. Transfira as soluções para tubos de centrifugação e adicione dois volumes de clorofórmio/isoamylalcohol (24/1).
  7. Depois de tremer, centrifugar a amostra por 5 min a 9.000 × g. Transfira a fase superior e aquosa em frascos de reação e adicione 1 mL de etanol gelado e 50 μL de acetato de sódio de 3 M.
  8. Vórtice da amostra e coloque-a a -20 °C por 1h ou mais.
  9. Centrifugar por 5 min a 10.000 × g (4 °C) e descartar o supernatante. Lave a pelota com 70% de etanol.
  10. Centrifugar a amostra novamente. Retire o supernatante e seque a pelota durante a noite. Dissolva o DNA em água sem nuclease. Meça o espectro de DNA para verificar se o OD 260 nm/OD 280 nm está entre 1,6 e 1,9.
  11. Analise o tamanho do DNA em um gel de eletroforeseagarose 28.
  12. Sequencia o DNA genômico por sequenciamento de última geração para 300 ciclos, com uma configuração de extremidade emparelhada e comprimento de leitura de 150 bases (ver as Tabelas de Materiais).
  13. Executar o conjunto com o programa de computador apropriado; veja o exemplo dado na Tabela de Materiais.
  14. Envie o genoma do rascunho ao servidor RAST para anotação.
    NOTA: Carregue sequências de DNA para obter anotações completas em poucos minutos.

3. Transformação natural e expressão GFP

NOTA: A transformação é baseada em um vetor plasmídeo propagado em E. coli; pGEM-T ou pUC19 podem ser usados como vetores de espinha dorsal. As técnicas de clonagem são estabelecidas em muitos laboratórios; veja também os protocolos padrão28 e os artigos sobre vetores de transformação para P. lacuna15,29. Exemplos de vetores para expressão sfGFP são descritos na seção de resultados representativos. Detalhes de quatro vetores ainda não publicados são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

  1. Realize todas as etapas utilizando material estéril em condições de laboratório estéreis (banco limpo, vidros estéreis).
  2. Inoculação 2 x 50 mL de meio líquido f/2 em dois frascos de 250 mL com filamentos de 2 x 1 mL de P. lacuna de uma cultura em execução. Cultivar em luz branca (50 μmol m-2 s-1) sob agitação (rotação horizontal, 50 rpm) por ~5 dias a 25 °C.
  3. Prepare ~200 μg do DNA vetorial de transformação usando um kit de preparação midi (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Homogeneize 100 mL de suspensão celular P. lacuna (ver a Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min. Medir OD em 750 nm (valor desejado = 0,35).
  5. Centrifugar a suspensão celular por 15 min a 6.000 × g. Remova o supernatante e suspenda a pelota em 800 μL (volume total, incluindo líquido residual e filamentos) do líquido restante e do meio adicional f/2+ .
  6. Pegue oito placas de bato-ágar f/2+ (10 cm de diâmetro) contendo kanamycina de 120 μg/mL. Pipeta 10 μg de DNA no meio de cada placa de ágar. Imediatamente pipeta 100 μL de suspensão celular no meio de cada placa de ágar (em cima do DNA).
  7. Mantenha a placa de ágar sem tampa no banco limpo para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 °C durante 2 dias.
  8. Distribua os filamentos de cada placa de ágar com um laço de inoculação em várias placas frescas de bato-ágar contendo 120 μg/mL kanamycin. Cultive as placas em luz branca a 25 °C e verifique as culturas regularmente sob um microscópio.
  9. Identificar filamentos vivos e transformados após 7-28 dias sob o microscópio. Procure filamentos verdes saudáveis (Figura 2) diferentes de outros filamentos. Se esses filamentos verdes puderem ser identificados, continue com o próximo passo; caso contrário, mantenha a placa por mais 7 dias.
  10. Use fórceps para transferir esses filamentos vivos identificados para 50 mL de meio líquido f/2+ com kanamycina de 250 μg/mL. Cultive em luz branca a 25 °C em um agitador (rotação horizontal, 50 rpm). Observe o crescimento por até quatro semanas.
  11. Transfira os filamentos de volta para o meio ágar contendo kanamycina de 250 μg/mL e aguarde que os filamentos cresçam. Após vários dias, transfira filamentos únicos para uma placa de ágar fresco com maior concentração de kanamicina, por exemplo, 500 μg/mL. Fique com a placa original.
  12. Certifique-se de que os filamentos são propagados em uma alta concentração de kanamicina na cultura líquida ou no ágar. Aumente novamente a concentração de kanamicina para acelerar a segregação.
    NOTA: A lacuna P. transformada cresce em até 10.000 μg/mL kanamycin. Outras espécies podem não tolerar concentrações tão altas.
  13. Se as células resistentes forem cultivadas e distribuídas amplamente sobre uma placa, teste a integração da inserção no genoma de P. lacuna realizando PCR com primers externos e internos.
    1. Use primers que foram projetados para clonagem da inserção como primers internos.
    2. Para o desenho dos primers externos, selecione sequências que são de 5' e 3' do local de inserção proposto no genoma de P. lacuna, mas fora da inserção.
    3. Para reações pcr, use primers internos e primers externos. Use a cepa resistente e o tipo selvagem.
      NOTA: Os primers internos indicam que a inserção está presente; Primers externos mostram que a inserção é inserida no lócus correto.
  14. Para cada reação pcr, coloque ~10 mg dos filamentos diretamente nos tubos PCR e realize PCR de acordo com os protocolos padrão24. Se nenhum produto for obtido, varie a temperatura de ressarcido e lave os filamentos com água.
    NOTA: Muitas polimeras diferentes podem ser usadas em PCR. Polimerases padrão, como a polimerase Taq, têm uma taxa de erro maior do que polímeras de verificação de erros, que são mais caras. Este PCR analítico não requer nenhuma polimerase de verificação de erros. No entanto, a polimerase de verificação de erros deve ser testada se nenhum produto PCR for obtido com uma polimerase padrão.
  15. Analise os produtos PCR da linha resistente na eletroforeseagarose 24.
    1. Compare as posições da banda com o marcador e compare o tipo selvagem e o transformador. Com primers internos e externos, procure uma banda maior para o transformador do que o tipo selvagem (devido à inserção do de resistência) ou duas bandas para o transformador: uma com o tamanho da banda do tipo selvagem e uma maior. Como este último caso indica segregação incompleta, continue o cultivo com altas concentrações de kanammicina.
      NOTA: Para obter mais detalhes sobre PCR e eletroforese, consulte15,24 ou outra literatura padrão.
  16. Para expressão GFP: observe filamentos únicos com um microscópio de fluorescência (ver a Tabela de Materiais) em uma ampliação do conjunto objetivo em 40x ou 63x. Capture uma imagem de transmissão de brightfield e uma imagem de fluorescência. Use as seguintes configurações para GFP: bandpass de 470 nm para excitação, bandpass de 525 nm para emissão e um divisor de feixe de 495 nm, tempo inicial de exposição de 500 ms.
  17. Ajuste o tempo de exposição para sinais claros de fluorescência, evitando intensidades saturadas. Tente usar a mesma configuração para todas as amostras.
  18. Como os filamentos do tipo selvagem também exibirão fluorescência, capture imagens com as mesmas configurações acima para esta fluorescência de fundo.
    NOTA: A tensão que expressa gfp deve ter um sinal mais alto; caso contrário, não está expressando GFP.
  19. Com base nos tempos de exposição e nas intensidades dos pixels das imagens de fluorescência, calcule e compare o conteúdo GFP dos diferentes filamentos.

4. Crioconservação

NOTA: P. lacuna e o cianobacterium de células únicas Synechocystis sp. O PCC 6803 é usado. O presente método funciona melhor para P. lacuna.

  1. Cultivar P. lacuna ou Synechocystissp PCC 6803 por pelo menos 10 dias em 10 mL de f/2+ ou meio BG-11, respectivamente, sob luz branca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C sob agitação (rotações horizontais, 50 rpm).
  2. Homogeneize a cultura P. lacuna (ver a Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min ou com um dispositivo de ultrassom (ver a Tabela de Materiais) por 2 min de energia total. Determine OD 750 nm de qualquer cultura para verificar se o valor está entre 1 e 7.
  3. Recolher as células por centrifugação a 6.000 × g por 15 min. Remova o supernatante.
  4. Suspenda a pelota de celular em 800 μL de f/2+ ou bg-11 médio (volume final) e transfira para um criovial de 2 mL. Adicione 800 μL de uma solução de 50% de glicerol à suspensão da célula. Feche o frasco e misture invertendo repetidamente.
  5. Transfira o criovial para nitrogênio líquido e armazene-o em uma caixa criobox em um congelador de -80 °C. Observe a posição da caixa dentro do congelador e as coordenadas da amostra dentro da caixa.
  6. Para a recuperação das células, tire o criovial e descongele o conteúdo à temperatura ambiente. Transfira o conteúdo para um tubo de reação de 2 mL.
  7. Lave a amostra duas vezes. Para a1ª lavagem, centrífuga a 6.000 × g por 5 min. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 2 mL de f/2+ ou meio BG-11. Para a2ª lavagem, recentemente orifuge a 6.000 × g por 5 min, remova o supernasce e suspenda a pelota em 2 mL de f/2+ ou meio BG-11.
  8. Para verificar a integridade dessas células prontas para cultivo, transfira a pelota para 9 mL de média e cultive-as em luz branca (50 μmol m-2 s-1) sob agitação (55 rpm). Compare o OD 750 nm da cultura no primeiro dia e depois de 1 semana.

5. Motilidade da lacuna phormidium

NOTA: Serão descritos três ensaios diferentes. A mesma cultura é usada em todos os casos.

  1. Cultivar P. lacuna em f/2 médio sob agitação horizontal (50 rpm) em luz branca (50 μmol m-2 s-1) por ~5 dias até que o OD estimado 750 nm seja 0,35. Armazene a amostra a 4 °C até o uso.
  2. Homogeneize os filamentos (ver a Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min ou com ultrassom (ver a Tabela de Materiais) por 1 min de potência máxima e ciclo de 1. Medida OD 750 nm. Se acima de 0,35, dilua a fração com o meio f/2. Use esta solução em ensaios de motilidade nas etapas 5.3, 5.4 e 5.5.
  3. Ensaio para o movimento em meio líquido
    1. Para observação direta da motilidade, transfira 8 mL de meio contendo P. lacuna (a partir da etapa 5.2) para uma placa de Petri de 6 cm. Espere alguns minutos até que a amostra atinja a temperatura ambiente. Cubra a placa de Petri com papel alumínio.
    2. Coloque um slide de microscópio na tabela x-y de um microscópio padrão com uma câmera. Ligue a luz do microscópio. O ideal é sempre usar as mesmas configurações elétricas e ópticas para a iluminação. Mova um objetivo de 4x ou 10x para o caminho da luz.
    3. Coloque a placa de Petri em cima do slide. Ajuste os movimentos de filamentos ou filamentos únicos por x, y e z movimentos da tabela.
      NOTA: Devido ao arranjo tridimensional, apenas uma parte da seção relevante pode estar em foco. A folha de celofane permite ajustar o foco sem restrições.
    4. Observe movimentos de filamentos ou feixes únicos. Certifique-se de que a lente objetiva não toque no líquido. Registo os movimentos dos filamentos com uma câmera de microscópio padrão (ver Vídeo Suplementar S1).
  4. Ensaio para o movimento na superfície
    1. Para a observação da motilidade de filamento nas superfícies do ágar, prepare pratos petri de 6 cm com f/2 bacto-ágar. Certifique-se de que o ágar é alto o suficiente para que a lente objetiva se aproxime da superfície do ágar. Alternativamente, prepare uma camada de ágar de ~3 mm de espessura e grave os filamentos através do ágar (mantenha a placa de cabeça para baixo ou use um microscópio invertido).
    2. Pipeta 0,5 mL de uma solução contendo P. lacuna (a partir do passo 5.2) na superfície bacto-ágar de uma placa de Petri de 6 cm. Deixe o líquido entrar na superfície. Feche a placa de Petri e observe o movimento dos filamentos na superfície usando um objetivo de 4x ou 10x.
    3. Certifique-se de que as mesmas configurações elétricas e ópticas do microscópio sejam usadas durante toda a gravação e em gravações subsequentes.
    4. Capture gravações de lapso de tempo usando uma câmera ocular e um sistema de minicomputador. Certifique-se de que o intervalo de tempo entre as imagens subsequentes é de 5 s-1 min. Programe o script Linux do minicomputador para controlar a gravação de lapso de tempo. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para um script de exemplo e vídeo suplementar S2 como exemplo.
  5. Ensaio para fototaxis
    1. Para experimentos com fototaxis, prepare os suportes de diodo emissor de luz (LED) (aqui, com uma impressora 3D) em que os LEDs selecionados de 5 mm são montados para irradiar uma área de 20 mm2 de baixo para cima (Figura 3). Se necessário, use muitos suportes led em paralelo, conectando cada LED eletricamente através de um resistor e potencialiômetro a uma fonte de alimentação ajustável. Meça e ajuste as intensidades do LED, dependendo do experimento. Certifique-se de que toda a configuração esteja em uma sala escura ou em um recipiente escuro fechado.
    2. Coloque 8 mL do meio contendo P. lacuna (a partir do passo 5.2) em uma placa de Petri de 6 cm. Ajuste a intensidade da luz do LED. Feche a placa de Petri com a tampa e coloque-a em um suporte de LED para que o LED fique no centro da placa de Petri.
    3. Após a duração desejada (tipicamente 2 dias), capture uma imagem da placa de Petri com uma câmera de smartphone voltada diretamente para a posição do tratamento de luz. Use um painel LED branco para irradiação da amostra. Use as configurações manuais da câmera; evitar reflexos de luz; sempre se ajuste para obter a mesma distância entre a lente da câmera e o espécime. Certifique-se de que as configurações de exposição dão uma imagem adequada para análises posteriores usando ImageJ.
    4. Quantifique o diâmetro do círculo central dos filamentos usando o software ImageJ.
      1. Abra ImageJ, clique em Arquivo | Abra, selecione o arquivo desejado e clique em Enter.
      2. Selecione o botão Reto (com uma linha reta). Pressione o botão do mouse esquerdo para desenhar uma linha de uma extremidade da placa de Petri até a extremidade oposta. Certifique-se de que a linha passe pelo centro do círculo de filamentos.
      3. Pressione Ctrl-K no teclado ou clique em Analisar | Plot Profile no menu ImageJ. Procure por uma janela x-y com intensidades de pixels plotadas versus distância-a 1D perfil da placa de Petri. Certifique-se de que a menor intensidade de pixel está ligeiramente acima de 0 e o maior valor abaixo de 255.
      4. Estime um valor médio para a intensidade do pixel fora do círculo e outro valor médio para a intensidade do pixel no círculo. Na posição y entre esses valores, estime os valores x de ambos os lados do círculo apontando com o mouse sobre essas posições. Observe ambos os valores e calcule a diferença.
      5. Obtenha o maior valor x apontando o mouse para o eixo y à direita. Observe que este valor e representa o diâmetro da placa de Petri. Se este diâmetro for de 5 cm, calcule o diâmetro do círculo de filamento central como d/e × 5 cm.

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Resultados

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Seguindo os métodos acima mencionados, 5 cepas diferentes de P. lacuna foram isoladas de balanços e sequenciadas (Figura 1 e Tabela 1). Todas as culturas foram estéreis após ~1 ano de subcultura, exceto P. lacuna HE10JO. Esta cepa ainda está contaminada com Marivirga Atlantica, uma bactéria marinha. Durante as excursões subsequentes de Helgoland, outras cianobactérias filamentosas foram isoladas das piscinas rochosas, que são diferentes de P. l...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora muitas cepas de cianobactérias estejam disponíveis a partir de coleções culturais 32,33,34,35,36, ainda há uma demanda por novas cianobactérias da natureza porque essas espécies são adaptadas a propriedades específicas. P. lacuna foi coletado a partir de piscinas rochosas e é adaptado a variações de concentrações de sal e temperatura

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho contou com o apoio do Instituto de Tecnologia Karlsruher.

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Materiais

Meios de cultura

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Solução de água doceSigma AldrichC3061
BG-11 médioMerck73816-250ML
Ácido bóricoMerck10043-35-3H3BO3
Cloreto de cálcio di-hidratadoCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Frascos de cultura de células Cellstar com tampa de rosca de filtro, estéreis, 250 mLGreiner658190
Frascos de cultura de células Cellstar com tampa de rosca de filtro, estéril, 50 mLCentrífuga de 601975
LYNX 4000Thermo Scientific75006580e rotor
Centrífuga microstar 17VWR InternationalN/Apara até 13.000 rpm
Brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Clorofórmio : Álcool isoamílico 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Cloreto de cobalto(II) hexahidratadoMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Sulfato de cobre(II) pentahidratadoMerck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinaCarl Roth58-85-5  C10H16N2O3S
Escada de DNA 1 kbNew England BiolabsN3232
Escada de DNA 100 bpNew England BiolabsN3231
Ajuda de pipetagem elétrica accujet-pro SBrand GmbH26360para pipetagem 1-25 mL
EtanolVWR64-17-5C2H6O
Ácido etilenodiamina tetraacético sal dissódico di-hidratadoCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Microscópio de fluorescência ApoTomeZeiss
Microscópio de fluorescência Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Sistema de documentação em gel Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exuADVANCED
Glassware, diferente
GlicerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
Cloreto de ferro (III) hexahidratadoMerck10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamicinaSigma-Aldrich25389-94-0
Sulfato de canamicinaCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroilsarcosina, Sal de Sódio (Sarcosil)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
Fonte de luz, tubo fluorescente L18W/954 luz do diaOSRAMcultivo de cianobactérias
Fonte de luz, painel LED XL 6500K 140 WBloom StarN/Acultivo de cianobactérias, até 1.000 µ mol m-2 s-1
Cloreto de magnésio hexahidratadoCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Cloreto de manganês(II) tetrahidratadoServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscópio DM750Zeiss
Kit de extração de plasmídeo de preparação Midi NucleoBond Xtra Kit MidiMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputador Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDpara gravação em time-lapse
Câmera ocular EC3Leicapara gravação contínua até 30 s
Câmera ocular MikrOkular Full HDBresserpara gravações de lapso de tempo, acoplado ao minicomputador Raspberry Pi
Placas de Petri poliestirol, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
placas de Petri poliestirol, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Fotômetro Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Fotômetro Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µ LGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µ LGilsonSKU: FA10004M
Pipetas de plástico 10 mL,Greiner607107
Tubo de plástico, estéril, 15 mLGreiner188271
Tubo de plástico, estéril, 50 mLGreiner227261
Brometo de potássioCarl Roth7758-02-3KBr
Cloreto de potássioCarl Roth7447-40-7KCl
Fonte de alimentação Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
Fonte de alimentação Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicspara LED
Proteinase KPromegaMC500Cda Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polimeraseNew England BiolabsM0491S
Kit de sequenciamento NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sistema de sequenciamento NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentospara cultivo
Acetato de sódioCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Cloreto de sódioCarl Roth7647-14-5NaCl
Sódio di-hidrogenofosfato monohidratadoCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Fluoreto de sódioCarl Roth7681-49-4NaF
Hidrogenocarbonato de sódioCarl Roth144-55-8NaHCO3
Molibdato de sódio di-hidratadoServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Nitrato de sódioMerck7631-99-4NaNO3
Sulfato de sódioCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Cloreto de estrôncio hexa-hidratadoCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Cloridrato de tiaminaMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Dispositivo ultrassônico UP100H com sonotrodo MS3Hielscher Ultrasound TechnologyUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentshomogeneizador
UreiaCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamina B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Solução0,3 µ M tiamina-HCl, 2,1 nM de biotina, 0,37 nM de cianocobalamina
Destiladores de água, tratamento de águaVEOLIA water technologiesELGA_21001
Sulfato de zinco heptahidratadoSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, programa URL
gatb-minia para montagemde DNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinefaz grandes andaimes a partir de leituras curtas de DNA,
para processamento de imagens (intensidades de pixel, diâmetro do círculo)
>
Água do mar artificial0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 µ M SrCl2, 72 µ M NaF
f/2 - meio líquidodo mar artificial, 0,1 % (v/v) solução de oligoelementos, 0,05 % (v/v) solução de vitamina, 0,88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4 
f/2+ meio líquidof/2-medium, com aumento de 10 vezes NaNO3 e NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
f/2+-ágar3 % (m/v) ágar bacto, água do mar artificial, solução de oligoelementos a 0,1 % (v/v), solução vitamínica a 0,05 % (v/v), 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4
f/2-ágar3 % (p/v) de ágar bacto, água do mar artificial, 0,1% (v/v) solução de oligoelementos, 0,05% (v/v) solução de vitamina, 0,88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4Solução de
oligoelementos0,36 mM NaH2PO4, 12 µ M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 µ M MnCl2
Solução vitamínica0,3 µ M tiamina-HCl, 2,1 nM de biotina, 0,37 nM de cianocobalamina
Greiner estéril de vitamina software ImageJ baseado em LinuxServidor de anotação RAST https://rast.nmpdr.org entrada: sequência de DNA do genoma, detecta quadros de leitura abertos, lista sequências de proteínas e suas funções água

Referências

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