Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Resumo

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.

Resumo

As cianobactérias são um grupo diversificado de bactérias fotossintéticas gram-negativas que desempenham papéis críticos nos ecossistemas globais e servem como modelos essenciais de biotecnologia. Trabalhos recentes demonstraram que tanto as cianobactérias marinhas quanto as de água doce produzem vesículas extracelulares - pequenas estruturas ligadas à membrana liberadas da superfície externa dos micróbios. Embora as vesículas provavelmente contribuam para diversos processos biológicos, seus papéis funcionais específicos na biologia cianobacteriana permanecem amplamente desconhecidos. Para incentivar e avançar a pesquisa nesta área, é apresentado um protocolo detalhado para isolar, concentrar e purificar vesículas extracelulares cianobacterianas. O trabalho atual discute metodologias que isolaram com sucesso vesículas de grandes culturas de Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis. São apresentados métodos para quantificar e caracterizar amostras de vesículas dessas cepas. Abordagens para isolar vesículas de amostras de campo aquático também são descritas. Finalmente, desafios típicos encontrados com a purificação da vesícula cianobacteriana, considerações metodológicas para diferentes aplicações a jusante e as trocas entre abordagens também são discutidas.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são estruturas esféricas, variando entre ~20-400 nm de diâmetro, liberadas por praticamente todos os organismos em seu ambiente circundante ^1,2,3. Vesículas são delimitadas por um bicamado lipída e não podem se replicar. Em bactérias gram-negativas, acredita-se que essas estruturas surgem principalmente por "blebbing" de pequenas porções da membrana externa. Ainda assim, outros processos, incluindo movimento flagelar, lise celular e secreção de material de membrana interna e externa, podem produzir vesículas, bem como ^4,5. Os EVs podem conter várias biomoléculas, incluindo lipídios, proteínas solúveis e membranas, ácidos nucleicos e metabólitos, e podem transportar esse material entre as células ^4,5,6. Diante dessas características, os EVs estão sendo estudados para entender seus possíveis papéis em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo comunicação celular, formação de biofilmes, transferência horizontal de genes, dinâmica de host-phage e troca de nutrientes ^4,6.

As cianobactérias são um grande e diversificado grupo de bactérias Gram-negativas, incluindo organismos unicelulares e filamentosos. Eles são de interesse de muitas perspectivas, incluindo a compreensão de sua fisiologia e diversidade ^7,8, as funções críticas do ecossistema que eles atendem ^9,10, e sua utilidade para a biotecnologia ^11,12. As cianobactérias são encontradas em uma grande variedade de habitats, seja como organismos livres em ambientes marinhos, de água doce e terrestre, ou em associações simbióticas com musgos, samambaias, plantas ou em líquens e esponjas¹³. Eles servem como produtores primários cruciais em ecossistemas aquáticos, produzindo oxigênio e carbono orgânico através da fotossíntese^{oxigena 9,10}, e alguns são capazes de fixar nitrogênio atmosférico também 7. Cianobactérias marinhas e de água doce, incluindo Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis, produzem EVs em condições laboratoriais 14,15,16, e vesículas cianobacterianas também podem ser encontradas em ambientes naturais ^14,17. As funções biológicas e ecológicas das vesículas cianobacterianas são desconhecidas, mas novas pesquisas nessa área provavelmente fornecerão novas percepções sobre questões sobre fisiologia cianobacteriana, diferenciação, estratégias de comunicação, evolução e interações tróficas. Além disso, a capacidade dos EVs cianobacterianos de transportar diversas categorias de biomoléculas pode ter aplicações comerciais^18,19.

O presente protocolo descreve métodos para isolar e caracterizar vesículas de culturas cianobacterianas e amostras de campo para permitir e incentivar um exame mais amplo da biologia vesícula extracelular cianobacteriana. Embora o fluxo de trabalho descrito aqui seja análogo a protocolos de isolação e caracterização de EVs de outras bactérias, culturas cianobacterianas e amostras de campo normalmente contêm concentrações de células e vesículas mais baixas do que são comumente observadas com sistemas de modelos associados ao hospedeiro ou^patogênicos 20,21,22. Assim, estudos de EVs cianobacterianos exigem considerações e otimizações especiais para cultivo e isolamento vesícula, que variam ainda mais entre cepas e origens midiáticas. Como nenhum protocolo único funcionará igualmente bem para todas as cepas, condições de crescimento e aplicações a jusante, fornecemos múltiplas opções e discutimos as compensações envolvidas para que os pesquisadores possam determinar as abordagens mais apropriadas para abordar suas questões experimentais.

Protocolo

As cepas cianobacterianas são obtidas a partir de várias coleções culturais (ver Discussão para detalhes).

1. Cultivo cianobacteriano

1. Cultivar cianobactérias marinhas Prochlorococcus e Synechococcus seguindo os passos abaixo.
   1. Cultivar cepas prochlorococcus e synechococcus em frascos de policarbonato usando um meio apropriado como Pro99 ou SN (ver Tabela de Materiais). Para mais detalhes, consulte referências publicadas anteriormente^23,24.
   2. Aclimar as culturas, cultivando-as em duas ou três transferências (diluições de cultura 1:20 em mídia fresca para cada passagem) sob as condições de temperatura e irradiação desejadas para o experimento.
      NOTA: As condições típicas de crescimento ^23,25 incluem temperaturas entre 15-30 °C na irradiação entre 8-150 fótons de μmol ^{m-2 s-1}, mas as tolerâncias individuais de tensão e optima variam amplamente²⁶ e precisam ser definidas com base na orientação das instruções ou literatura de coleta de cultura relevantes. Monitorar a taxa de crescimento usando fluorescência cultural ou citometria de fluxo conta²³, e garantir que as culturas cresçam a uma taxa exponencial de estado estável consistente antes de iniciar o experimento.
   3. Realize um conjunto de transferências graduais sucessivas de volumes menores para maiores quando as células atingirem a fase exponencial tardia (por exemplo, 20 mL < 250 mL < 2 L < 10 L < 20 L).
      NOTA: Culturas de grande volume não podem ser diretamente inoculadas a partir de pequenas quantidades de cultura inicial. Observe que culturas maiores podem exigir a adição de tampões (como HEPES de 1 mM, pH 7,5 ou 3,75 mM TAPS, pH 8), juntamente com bicarbonato de sódio suplementar ou borbulhando com ar^{estéril 24}.
2. Cultivar cianobacterium de água doce Synechocystis sp. PCC 6803.
   1. Prepare uma cultura de Synechocystis sp. PCC 6803 para ser usado como inóculo, cultivando-o com aeração (ar borbulhante a 1 L/min), a 30 °C, sob uma luz de 16 h (contagem de fótons de 50 μmol ^{m-2 s-1}) / regime escuro de 8h, até uma densidade óptica a 730 nm (OD730) de 1,0 (fase exponencial) no bg11 médio²⁷.
   2. Inocular 30 mL desta cultura Synechocystis sp. PCC 6803 em 570 mL de média BG11 para um OD730 de 0,05 em garrafas de lavagem de gás de vidro 1 L.
   3. Permitir que as células cresçam com aeração, a 30 °C, sob uma luz de 16 h (contagem de fótons de 50 μmol ^{m-2 s-1}) / regime escuro de 8h, até um OD730 final de 1,0-1,5.

2. Separação da biomassa cianobacteriana da fração de partícula pequena (vesícula)

NOTA: Primeiro, recomenda-se separar células do sobrenatante através da pelotização centrífuga das células. No entanto, quando os volumes de cultura são muito grandes para que isso seja viável, é possível pular a centrifugação e passar diretamente para filtrar culturas inteiras usando filtragem de cápsulas (etapa 2.4).

1. Realize a centrifugação para células separadas (melhor para volumes de até ~4 L, dependendo da capacidade de centrífuga disponível).
   1. Autoclave ou lave completamente e limpe as garrafas centrífugas usando água de grau ultrapure tipo I (ver Tabela de Materiais), garantindo que nenhum sabão residual ou outro material permaneça.
   2. Carregue amostras de cultura em um número apropriado de garrafas de centrífugas e equilibre-as.
   3. Gire culturas para >10.000 x g a 4 °C por 10 min. Se o supernante permanecer visivelmente turvo, aumente as condições de centrifugação para 20 minutos em velocidade máxima e rejulgamento.
   4. Decante cuidadosamente ou pipet sobrenatante em um vaso limpo e proceda a uma das seguintes opções de filtragem mencionadas nas etapas 2.2-2.4.
2. Opção 1: realize a filtragem da seringa utilizando filtros de 0,2 μm (para volumes de amostra de até ~50 mL).
   1. Encha uma seringa estéril de 50 mL com um meio de cultura em grande parte livre de células e filtre-a através de um filtro de 0,2 (ou 0,45) de μm de polietrosterulfone (PES) (ver Tabela de Materiais). Colete o filtrado em um recipiente limpo e esterilizado.
   2. Repita esta etapa até que o filtro esteja entupido (por exemplo, torna-se difícil empurrar com a seringa). Substitua por um novo filtro e prossiga até que a amostra seja completamente filtrada.
3. Opção 2: realize filtragem de vácuo de 0,2 μm (até ~4 L).
   1. Lave e limpe completamente o aparelho de vácuo usando água tipo I - grau ultrapure, conectando-o a uma armadilha de vácuo e bomba (ver Tabela de Materiais).
   2. Insira um filtro de 0,2 μm de diâmetro adequado e aperte o aparelho de vácuo.
   3. Adicione uma pequena quantidade de amostra de cultura, garantindo que a pressão do vácuo permaneça <10 psi.
   4. Continue filtrando a cultura em pequenos incrementos até completar. Se a taxa de filtragem diminuir significativamente, pare o vácuo e substitua o filtro.
   5. Colete a fração de <0,2 μm contendo vesículas em um recipiente limpo.
4. Opção 3: realize filtração de cápsula de 0,2 μm (para volumes amostrais >~4 L)
   1. Limpe tubos flexíveis e recipiente de coleta adequadamente dimensionados, lavando com água e detergente suave. Enxágüe o material com água destilada e desionizada.
      NOTA: Antes da utilização, o material deve ser enxaguado com água tipo I - grau ultrauso.
   2. Coloque a cultura para ser filtrada em um local seguro e elevado com o vaso de coleta final abaixo. Conecte uma porta de saída de 0,2 μm (ver Tabela de Materiais) a um pedaço de tubulação e coloque-a em um recipiente de coleta.
   3. Coloque outra tubulação na amostra, inicie um sifão de gravidade puxando alguma amostra para dentro da tubulação com uma seringa, e conecte a tubulação ao filtro da cápsula. Use a ventilação para liberar o excesso de ar e encha a câmara com sobrenante.
   4. Deixe que o material se mova através da cápsula até que a amostra seja completamente filtrada. Se a taxa de fluxo se tornar muito lenta (<~1/10^a taxa de fluxo inicial, ou saindo em sentido de gota em oposição a um fluxo contínuo), espere ou aplique força suave com uma bomba peristáltica até que a pressão traseira aumente. Alternativamente, restaure parcialmente as taxas de fluxo desconectando temporariamente o filtro, recuando a biomassa acumulada do lado da entrada com água ultracleana até que o material não esteja mais visivelmente turvo e, em seguida, reinicie o processo de filtragem.

3. Concentrando a amostra de vesícula

1. Opção 1: realize a ultrafiltração centrífuga para concentrar o pequeno volume (<500 mL) de amostras.
   1. Enxágüe os concentradores centrífugos de ultrafiltração de 15-20 mL de escolha com a água tipo I - grau ultrapure.
   2. Coloque os concentradores na centrífuga e gire a 4.400 x g a 4 °C. Descarte a corrida e repita esta etapa pelo menos mais duas vezes.
   3. Carregue a amostra sobrenante em concentradores enxaguados com água e gire sob as mesmas condições. Dependendo das metas experimentais, o filtrado da amostra pode ser descartado ou coletado para maior concentração (com concentradores com limite nominal de peso molecular de 3 kDa) e análise.
   4. Repita esta etapa até que a amostra esteja concentrada em um volume final de ~15-30 mL.
2. Opção 2: realize a filtragem de fluxo tangencial (TFF) para concentrar um grande volume (>500 mL) de amostra.
   1. Configure o aparelho TFF de acordo com as diretrizes do fabricante (ver Tabela de Materiais). Conecte uma bomba peristáltica à linha de entrada e coloque grampos ajustáveis na linha de retentate. Higienize o TFF conforme recomendado pelo fabricante e, em seguida, lave o dispositivo com 1 L de água tipo I - ultrapure.
      NOTA: As linhas de admissão e retentate devem ser colocadas em um reservatório de amostra limpa (garrafa de vidro). As linhas filtras devem ser direcionadas para um vaso ou pia.
   2. Adicione < 0,2 μm de filtrado no reservatório de amostra. Aumente lentamente a velocidade da bomba e os níveis de pressão traseira na linha retentate para aumentar a saída das linhas filtradas.
   3. Continue a executar o TFF, reabastecendo o reservatório com a cultura supernadenante à medida que o material é removido. Evite permitir que a linha de admissão saia da amostra durante o processamento para evitar a introdução de bolhas de ar. Certifique-se de que a pressão de alimentação não exceda ~10 psi e que o retentato flua para fora do TFF a um ritmo consistente de volta para o reservatório.
   4. Pare de concentrar a amostra assim que o volume no reservatório atingir a menor quantidade possível para manter o fluxo na linha de admissão sem introduzir bolhas de ar.
   5. Feche a linha de saída com um grampo. Remova a pressão traseira na linha retentate e recircular o supernanato concentrado através do filtro por ~10 min, reduzindo a taxa de recirculação para 20-40 mL/min para maximizar a recuperação.
   6. Mova a linha de retentate para um vaso limpo, remova a linha de admissão da amostra e colete o material concentrado. Recupere qualquer material restante no reservatório de amostras usando uma pipeta.
   7. Filtre o supernante concentrado através de um filtro de seringa de 0,2 μm (etapa 2.2) para garantir que não haja células.
      NOTA: O passo 3.2.7 é opcional.
   8. Se necessário, armazene o concentrado final a 4 °C por ~3 semanas antes de passar para a purificação vesícula (etapa 4).

4. Isolamento e purificação da vesícula

1. Pelota diretamente por ultracentrifugação seguindo os passos abaixo.
   1. Coloque a amostra concentrada de cultura de <0,2 μm em um tubo de ultracentrifusagem limpo. Adicione mídia limpa ou tampão conforme necessário para garantir que o tubo esteja completamente preenchido.
      NOTA: Se a amostra de cultura final for muito grande para caber em um tubo, seja pelotar o material em vários tubos a ser combinado antes das etapas de lavagem ou pelota serialmente no mesmo tubo.
   2. Se necessário, crie um equilíbrio e gire a ~100.000 x g por 3 h a 4 °C.
   3. Remova cuidadosamente o supernatante com uma pipeta. Embora as pelotas de vesícula cianobacterianas possam mostrar alguma coloração, elas são frequentemente invisíveis.
   4. Lave o material de pelotização adicionando mídia de cultura fresca ou tampão de lavagem, como 1x salina tamponada com fosfato (PBS) (ver Discussão) ao tubo ultracentrífuga, misture por tubulação suave e gire novamente como na etapa 4.1.2. Repita o processo de lavagem uma segunda vez.
   5. Resuspenque a pelota final na cultura fresca, repetidamente, mas suavemente, pipetando para cima e para baixo ao redor da parte inferior do tubo com uma pipeta de 1 mL. Transfira para um vaso limpo.
2. Realize a ultracentrifugação de gradiente de densidade.
   1. Prepare os estoques de iodixanol (ver Tabela de Materiais) fazendo uma versão 4x concentrada do fundo tampão desejado para a amostra (ver Discussão).
   2. Misture uma parte do buffer 4x com três partes de 60% de estoque iodixanol para fazer uma solução iodixanol de 45%.
   3. Diluir 45% de iodixanol com volumes de tampão 1x para criar estoques de mídia gradiente em 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% e 10% de concentrações iodixanol finais.
      NOTA: A quantidade total necessária variará de acordo com a capacidade do rotor/tubos ultracentrifus de ultracentragem.
   4. Configure um gradiente de densidade de ultracentrifuge sobrepondo cuidadosamente quantidades iguais de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% e 0% ioxidinol em um tubo ultracentrífuga de tal forma que todo o volume do tubo seja utilizado.
      NOTA: A amostra de vesícula extracelular a ser purificada deve ser colocada na parte superior do gradiente como parte da camada de iodixanol de 0%. Se o volume final da amostra de vesícula exceder o tamanho da camada de 0%, misture qualquer amostra de vesícula em excesso com iodixanol e/ou buffer suficiente para gerar o volume necessário dos estoques optiprep de concentração de 10% ou mais, e use-os no local correspondente no gradiente.
   5. Gire o gradiente a ~100.000 x g a 4 °C por 6 h.
   6. Colete frações (tipicamente 0,5 mL cada para um gradiente de ~4,5 mL) através de tubulações cuidadosas ou usando um coletor de frações (ver Tabela de Materiais).
   7. Determine a densidade de cada fração (em g/mL) utilizando um equilíbrio analítico e pipeta calibrada para medir o peso de um volume conhecido de amostra. Remova a amostra do tubo, determine o peso e devolva a amostra diretamente.
   8. Diluir frações individuais em um novo tubo ultracentrífuga com tampão limpo e lavar o material conforme mencionado nas etapas 4.1.2-4.1.4. Alternativamente, use colunas de diálise ou ultrafiltração para recuperar partículas.
      NOTA: Vesículas extracelulares cianobacterianas normalmente migram para densidades flutuantes de ~1,14-1,19 g/mL em iodixanol.
3. Armazene as vesículas a 4 °C se elas forem usadas dentro de 1-3 semanas. Congele as vesículas a -20 °C ou -80 °C se elas não forem usadas por mais tempo do que esse período.

5. Caracterização das vesículas isoladas

1. Realizar microscopia eletrônica de transmissão de manchas negativas (ver Tabela de Materiais) (TEM; tamanho de partícula, estrutura, pureza).
   1. Para melhorar a qualidade da imagem, o brilho descarrega a superfície de uma grade TEM revestida anteriormente usando um sistema de descarga de brilho de acordo com as diretrizes do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   2. Aplique cuidadosamente ~5 μL da amostra de vesícula e deixe sentar por 5 min.
      NOTA: Amostras com concentrações de vesículas > 10^{9 mL-1} normalmente darão os melhores resultados; amostras mais diluídos terão poucos vesículos por imagem.
   3. Remova a amostra tocando a borda de uma grade em um pedaço de papel filtro limpo.
   4. Pipet uma queda de 20-50 μL de acetato de 2% deuranyl (ver Tabela de Materiais) em uma superfície plana coberta por filme plástico, e coloque a grade flutuando em cima dele por 2 minutos.
   5. Remova o acetato deuranyl usando papel filtro e flutue brevemente em uma gota de água ultrauso para lavar. Repita a lavagem de água uma segunda vez.
      NOTA: A grade seca final está pronta para visualização após a etapa 5.1.5.
2. Realizar coloração de seção ultrafina para TEM (tamanho de partícula, estrutura interna).
   1. Resuspenja a pelota a partir do passo 4.1.5 com 1 mL de glutaraldeído de 2,5% em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio (pH 7) (ver Tabela de Materiais) e fixar a amostra por 2h a 4 °C.
   2. Gire a ~100.000 x g por 1 h a 4 °C.
   3. Lave a pelota cuidadosamente com 0,1 M tampão de cacodilato de sódio (pH 7) e gire a ~100.000 x g por 1h a 4 °C.
   4. Fixar a pelota com 1 mL de 1% de tetroxida de ósmio (ver Tabela de Materiais) (preparado em tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M) por 1h e, em seguida, lavar como na etapa 5.2.3.
   5. Desidratar a amostra com 1 mL de uma série ascendente de etanol (50%, 70%, 90%, e duas vezes no etanol absoluto) em etapas de 10 min cada a 4 °C.
   6. Adicione 250 μL de resina epóxi (ver Tabela de Materiais) misturado com etanol absoluto (1:1) à pelota e incubar durante a noite a 4 °C.
   7. Transfira a pelota para 500 μL de resina pura por 24 h. Em seguida, incubar a resina a 65 °C por 48 h.
      NOTA: A resina está agora pronta para seção por ultramicrotome, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   8. Manche as grades contendo seções com acetato de uranyl de 2% (em 50% de etanol) por 5 min. Lave os slides suavemente sob água deionizada em funcionamento por 10-15 s cada. Coloque uma gota de citrato de chumbo (ver Tabela de Materiais) e manche por mais 5 minutos.
   9. Lave como antes, remova a água manchando a grade em um papel filtro e seque as grades. Visualize por TEM de acordo com as diretrizes do fabricante (ver Tabela de Materiais).
3. Realize a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) (tamanho de partícula, concentração).
   1. Usando papel da lente, limpe cuidadosamente qualquer poeira ou material visível do plano óptico. Verifique se todos os anéis O e outros selos estão limpos e intactos. Ligue o instrumento e inicie o software.
   2. Usando uma seringa limpa, encha a câmara com água ultra-pura. Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes.
   3. Clique em Iniciar câmera e visualize a região ideal da câmara sobre a 'impressão digital'. Ajuste o estágio do microscópio horizontal ou verticalmente conforme necessário para que a intensidade do sinal esteja mesmo em toda a região imagem. Mova a região de imagem horizontalmente em relação à impressão digital (à direita, em direção à linha vertical), encontrando uma região próxima com sinal de fundo baixo.
   4. Deslize os controles deslizantes de ganho de tela e nível de câmera ao máximo e, em seguida, diminua para o nível mais baixo para ver as partículas mais fracas.
      NOTA: As configurações típicas para vesículas cianobacterianas utilizam um ganho de tela de 7 e nível de câmera entre 10 e 12.
   5. Ajuste o foco conforme necessário para garantir que as partículas sejam aproximadamente igualmente visíveis em todo o campo de visão. Continue empurrando água ultra-limpa através da câmara até que você tenha confirmado visualmente que a câmara está limpa.
   6. Remova a água residual da câmara usando uma seringa diferente.
   7. Examine uma amostra da mídia/buffer em que sua amostra está para determinar a concentração de partículas de fundo preenchendo a câmara com mídia/buffer usando uma seringa limpa de 1 mL.
   8. Selecione a medição padrão na caixa suspensa SOP . Alterar configurações para coletar pelo menos três réplicas técnicas de vídeos de 60 s cada.  Pressione Criar e Executar script e siga as instruções. Empurre ~100 μL de amostra para dentro da câmara entre as réplicas.
   9. Quando a aquisição estiver concluída, remova o tampão residual com uma seringa, lave 3-5 mL de água ultra-pura através da câmara e remova a água restante.
   10. Adicione a amostra de vesícula à câmara usando uma seringa de 1 mL e confirme as configurações de aquisição. Se a contagem de partículas não estiver dentro da faixa linear do instrumento (tipicamente entre 20-80 partículas/quadro), a amostra precisará ser diluída ou concentrada. Empurre pelo menos 500 μL de amostra para dentro da câmara antes de coletar dados.
   11. Colete dados de vídeo como na etapa 5.3.8, certificando-se de limpar a câmara com água ultra-pura entre diferentes amostras.
   12. Coletar todas as amostras subsequentes do mesmo organismo/experimento usando configurações de câmera idênticas para garantir a comparabilidade dos dados; alterações na configuração do Nível da Câmera podem ter um efeito notável sobre os valores finais obtidos.
   13. Determine parâmetros de partículas usando a seção de análise do software. Selecione Análise > Experiência Aberta e carregue o arquivo de amostra. Selecione Arquivos Selecionados do processo e aguarde que a análise seja concluída. Certifique-se de usar o mesmo limiar de detecção para todas as amostras subsequentes do mesmo experimento.
       NOTA: Como as vesículas cianobacterianas são frequentemente fracas, o Limiar de Detecção normalmente precisará ser ajustado ao valor mais sensível (mais baixo).
4. Executar dispersão dinâmica de luz (DLS) (tamanho de partícula, potencial zeta).
   1. Filtre através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm para qualquer amostra que entre no DLS para rastrear grandes partículas que interferem nas medições.
   2. Adicione 1 mL da mídia/buffer em um cuvette limpo para examinar possíveis agregações ou outras nanopartículas provenientes da mídia. Coloque a cuvette com o lado fosco à esquerda no micro sampler, e feche a tampa. Deixe a amostra equilibrar por pelo menos 5 minutos.
   3. Digite o índice refrativo do material e a absorção do material se eles diferem significativamente dos padrões de água.
      NOTA: As propriedades do material teriam muito pouca influência se as vesículas fossem menores que 100 nm. Ao medir o potencial de superfície (potencial zeta) dos EVs, as vesículas devem ser resuspendidas na mídia de crescimento original.
   4. Clique no Painel de Controle de Instrumentos para verificar as leituras e iniciar a aquisição de dados clicando no ícone verde. Se os valores parecerem bons e sua mídia/buffer não contiver agregações ou outras partículas, agora você está pronto para medir sua amostra.
   5. Adicione 1 mL de amostra de vesícula em um cuvette limpo e colete dados mencionados na etapa 5.4.4. Colete pelo menos três réplicas técnicas por 10 minutos cada.
5. Realize a análise lipopoliscarídeo (LPS) para confirmar que os EVs Gram negativos estão presentes na amostra.
   1. Amostra de vesícula de desnatura térmica a 95 °C por 10 min no buffer de amostra de Laemmli padrão 1x (ver Tabela de Materiais).
   2. Incubar com 0,2 U de protease tipo XIV de Streptomyces griseus (ver Tabela de Materiais) a 37 °C por 30 min para remover glicoproteínas contaminantes.
   3. Amostras tratadas separadas por eletroforese na desnaturação 16% (w/v) Géis de poliacrilamida SDS seguindo o protocolo publicado anteriormente¹⁶.
   4. Para detectar LPS, colora o gel com kits de coloração disponíveis comercialmente ou com uma técnica modificada de coloração de prata²⁸. Quantifique a abundância relativa de LPS por análise de densitometria de géis manchados conforme referências publicadas anteriormente^29,30.

6. Medições da taxa de produção da vesícula

1. Usando análise de rastreamento de nanopartículas como na etapa 5.3, ou tecnologia equivalente, meça a concentração de partículas na mídia de crescimento para o experimento. Se for encontrada uma alta contagem de partículas, filtre através de um filtro de poros de 0,1 μm e verifique novamente.
   NOTA: Para minimizar o erro, a concentração de partículas de fundo da mídia deve ser inferior a 10% da concentração de partículas encontrada em culturas de menor densidade.
2. Aclimar a cultura cultivando células por pelo menos duas transferências seriais sucessivas sob a mídia e as condições ambientais desejadas para os experimentos como na etapa 1.1.2. As culturas precisam ser transferidas ainda em fase de crescimento exponencial. Garantir que as taxas de crescimento da cultura medidas sejam consistentes entre as transferências; se não, continue transferindo culturas até que as taxas de crescimento sejam reprodutíveis.
3. Colete amostras de curso de tempo após a inoculação e intervalos regularmente cronometrado através da curva de crescimento para a fase estacionária inicial. Pontos de tempo escalonados para ter um mínimo de 3-4 amostras coletadas em toda a gama de crescimento exponencial. Para amostrar em cada ponto de tempo, execute as seguintes etapas.
   1. Filtre 1 mL ou mais de cultura diretamente através de um filtro de seringa limpo e estéril de 0,2 μm e salve o filtrado para medir a concentração de vesículas como na etapa 5.3. Congele as amostras do curso de tempo, se desejar. Use fluorescência relativa para seguir a dinâmica de crescimento da cultura.
   2. Salve uma amostra de toda a cultura para determinar o tamanho da população usando um método apropriado para o organismo (citometria de fluxo; chapeamento de colônia; ou não).
4. Obtenha medições de células e partículas semelhantes a vesículas (por mL) em cada ponto de tempo.
5. Identifique os pontos de tempo que ocorreram durante a fase de crescimento exponencial. Para calcular r, o número de vesículas produzidas por célula por geração, entre dois pontos durante o crescimento exponencial (tipicamente o início e o fim do curso-de-tempo), utilizam a equação fornecida no Arquivo Suplementar 1.
   NOTA: Este método só é válido durante condições de crescimento de estado estável; As premissas subjacentes e a derivação do cálculo estão detalhadas na Referência¹⁴.

Resultados

A Figura 1 apresenta uma visão geral do processo de isolamento da vesícula cianobacteriana, destacando aspectos-chave do protocolo descrito aqui. Destacam-se os passos que detalham a separação da biomassa cianobacteriana da pequena fração de partículas (vesícula), concentrando a amostra de vesícula e o isolamento e purificação de vesículas (Figura 1, passos 2 a 4), que são fundamentais para a obtenção de preparações reprodutíveis de vesículas. A Figura 2 apresenta resultados representativos do isolamento e caracterização de vesículas extracelulares do cianobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. A membrana externa deste cianobacterium tem sido mostrada para conter carotenoides³¹, que conferem uma coloração laranja característica às amostras de vesículas coletadas por pelotização direta através da ultracentrifugação (Figura 2A). Uma vez que a pelota vesícula é resuspendida, as vesículas podem ser examinadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), seja por coloração negativa de amostras com acetato de uranyl (Figura 2B) ou pela observação de seções ultrafinas (Figura 2C). A distribuição e concentração do tamanho da vesícula podem ser avaliadas usando análises dinâmicas de dispersão de luz (DLS) (Figura 2D) e análises de rastreamento de nanopartículas (NTA) (Figura 2E). Com o protocolo descrito, tipicamente ~3,5 ± 1,0 x 10⁸ nanopartículas por mL foram obtidas em uma cultura exponencialmente crescente de Synechocystis sp. PCC 6803 em um OD730 de 1,0. Análises bioquímicas de EVs isolados podem ser realizadas para complementar a caracterização física das vesículas isoladas. Como exemplo, as vesículas Synechocystis sp. PCC 6803 foram separadas em um gel de poliacrilamida SDS e manchadas para lipopólise (LPS; Figura 2F). Como os LPS são específicos para a membrana externa³², a detecção de LPS pode validar a presença de vesículas ligadas à membrana e servir como um marcador para analisar o conteúdo relativo de vesícula entre as preparações da mesma cepa³³. A inspeção da abundância relativa de LPS de baixo versus alto peso molecular pode indicar alterações na composição da vesícula entre as amostras^34,35.

Figura 1: Procedimentos experimentais utilizados para isolamento e caracterização do EV cianobacteriano. Representações esquemáticas de culturas crescentes (1) e separação da biomassa cianobacteriana do meio de crescimento (2). Amostras livres de células contendo vesículas estão concentradas (3), e então os EVs são isolados e purificados (4). Dependendo da aplicação, as preparações vesículas podem ser caracterizadas usando uma ou uma combinação de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), dispersão dinâmica de luz (DLS) e perfil de lipopolysaccharide (LPS) (5). RT, temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos do isolamento e caracterização da vesícula extracelular para o cianobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografia da pelota vesícula extracelular (EVs pellet) obtida após a ultracentrifugação do meio extracelular concentrado livre de células a partir de uma cultura de 600 mL Synechocystis sp. PCC 6803 cresceu para um OD730 de 1,0-1,5. Note a coloração laranja típica da pelota vesícula derivada dos carotenoides encontrados na membrana externa. (B,C) Fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de seções de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de seções de vesículas manchadas negativamente (B) e ultrafina (C) de Synechocystis sp. PCC 6803 amostras de vesículas. Barras de escala: 200 nm e 50 nm, respectivamente. As amostras foram visualizadas em um microscópio eletrônico de transmissão operado a 80 kV. (D) Trama típica de dispersão de luz dinâmica (DLS) representando a distribuição do volume vesícula em função do diâmetro da vesícula (em nm). Linhas coloridas indicam dados de três medidas técnicas de replicação da mesma amostra. (E) Análise de rastreamento de nanopartículas representativas (NTA) da distribuição do tamanho da vesícula extracelular Synechocystis (em nm). A linha preta indica a média de três réplicas técnicas, e as linhas vermelhas representam o erro padrão da média. (F) O perfil lipopolisacarídeo (LPS) foi detectado após separar a preparação da vesícula por eletroforese em um gel de poliacrilamida SDS-poliacrilamida de 16% (w/v) e coloração com um kit comercial de coloração LPS. LPS de baixo e alto peso molecular, correspondentes a formas de LPS ásperos e suaves, respectivamente, são detectáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Equação para calcular r. O número de vesículas produzidas por célula por geração entre dois pontos durante o crescimento exponencial (tipicamente o início e o fim do curso do tempo) é determinado usando esta equação. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

Considerações gerais
O protocolo (Figura 1) é apresentado como um conjunto de opções para destacar que não existe um método "de tamanho único" para trabalhar com vesículas extracelulares cianobacterianas. Os pesquisadores interessados podem utilizar as seções deste protocolo compatíveis e apropriadas para seu organismo modelo específico, perguntas/objetivos experimentais e disponibilidade de equipamentos. Todas as abordagens de isolamento vesícula envolvem trocas e inevitavelmente resultarão em algum grau de viés. Embora se deva procurar minimizar isso sempre que possível, a consideração mais crucial é garantir que a metodologia detalhada utilizada seja relatada de acordo com as diretrizes³⁶ do MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles).

Crescimento da cultura
Culturas cianobacterianas podem ser prontamente obtidas de uma das muitas coleções culturais disponíveis em todo o mundo. Alguns exemplos são a Coleção de Cultura Roscoff (Station Biologique de Roscoff, França), a Coleção de Cultura Pasteur (Institute Pasteur, Paris, França) e o Centro Nacional de Algas Marinhas e Microbiota (NCMA, Maine, EUA). A cepa cianobacteriana de escolha deve ser cultivada nas condições médias e ambientais adequadas, variando significativamente entre diferentes cepas. Uma lista de mídias comumente usadas para cultivo cianobacteriano pode ser encontrada em sites de coleta de cultura ou outras publicações 37,38,39.

Trabalhar com vesículas extracelulares cianobacterianas apresenta alguns desafios únicos em comparação com as metodologias relatadas para muitos heterotrófos típicos de laboratório. As culturas cianobacterianas têm concentrações vesículas de ordens de magnitude inferiores às encontradas em outros micróbios, como escherichia coli 14,16,40. Essas diferenças, presumivelmente decorrentes de densidades celulares mais baixas e/ou taxas de produção de vesículas, significam que culturas relativamente grandes (~1-20 L ou mais) podem ser necessárias para produzir material suficiente para análises em massa. Assim, os pesquisadores são encorajados a testar os rendimentos de vesículas de culturas de menor escala para determinar quanto material será necessário para atingir seus objetivos finais desejados. A importância de estabelecer se a mídia utilizada para o experimento tem um fundo particulado detectável também precisa ser enfatizada antes de iniciar qualquer experimento, pois esse material pode potencialmente confundir a quantificação populacional de vesículas, reduzir a sensibilidade das medidas de concentração/tamanho vesículas ou contaminar as preparações finais da vesícula.

Outro desafio para o campo é que nem todas as cianobactérias crescem bem, ou em tudo, na cultura pura. Até que seja feita axenic, interpretações de características físicas de vesícula, taxas de produção ou conteúdo não podem necessariamente levar a conclusões claras sobre vesículas produzidas por qualquer cepa na comunidade. Os pesquisadores também são aconselhados a considerar quais outros tipos de partículas poderiam estar presentes e potencialmente confundidas com vesículas por ferramentas específicas de análise de nanopartículas, que não podem necessariamente discriminar entre diferentes tipos de partículas. Por exemplo, pode ser essencial verificar se a cepa que está sendo utilizada não possui uma prophagem, seja através de sequenciamento de genoma, ensaios de indução ou outros meios ou não libera outros tipos de material particulado. Em nossa experiência, a maioria das vesículas cianobacterianas têm <0,2 μm de diâmetro, mas quando se olha para uma nova cepa ou condição de crescimento, deve-se confirmar se o uso de um filtro de tamanho de poros de 0,45 μm altera a distribuição de tamanho de partículas purificadas.

Muitos aspectos das condições culturais podem influenciar a produção de vesículas e seu conteúdo^41,42. Assim, as condições físicas e químicas utilizadas para o crescimento da cultura (incluindo irradiação leve, temperatura e composição de mídia) precisam ser documentadas e controladas na medida do possível para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Qualquer análise química do conteúdo vesícula deve ser responsável pela composição de fundo, particularmente na realização de análises de alto rendimento ao estilo "omics". Isso pode ser especialmente crítico ao usar mídia indefinida, como aquelas baseadas em um fundo natural de água do mar ou complementadas com extrato de levedura ou triptona. O uso de um meio de crescimento definido pode ser preferível dependendo das metas experimentais.

Os pesquisadores precisam monitorar cuidadosamente a dinâmica de crescimento da cultura em intervalos regulares para garantir que eles saibam onde na fase de crescimento está uma determinada cultura de lote e não apenas coletar amostras após um período arbitrário de tempo. A composição vesícula pode variar entre as fases de crescimento, particularmente entre fases exponenciais e estacionárias^41,42. Por exemplo, pelo menos uma fração de vesículas amostradas na fase estacionária pode surgir de um mecanismo celular diferente, como a lise celular, que não ocorrerá durante o crescimento exponencial. Embora isso ainda possa ser de grande interesse biológico, é essencial conhecer a amostra. Se uma cultura cianobacteriana atingir a fase de crescimento desejada em um momento em que não é possível proceder diretamente à concentração amostral, é recomendado o armazenamento das células da fração de <0,2 μm imediatamente (com centrifugação e/ou filtragem direta de 0,2 μm), e, em seguida, é recomendado armazenar o filtrado livre de células a 4 °C. O material pode ser armazenado desta forma por dias com pouco ou nenhum impacto perceptível na concentração ou distribuição de tamanho das vesículas.

Purificações vesículas
A necessidade frequente de isolar vesículas de culturas de volume significativo é vital no fluxo de trabalho de isolamento de vesículas cianobacterianas. Ao trabalhar com volumes maiores de material, as vesículas precisarão ser concentradas antes dos fluxos de trabalho de separação a jusante. Concentradores (membranas de filtro de fluxo tangencial ou colunas centrífugas) com um limite nominal de peso molecular de 100 kDa são geralmente aconselhados, pois permitem a separação de material solúvel com baixo peso molecular, mantendo os tempos de concentração razoáveis, mas os filtros de 30 kDa também são frequentemente usados com sucesso. Enquanto vários métodos não-ultracentrifugadores de purificação de vesículas (por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, sistemas baseados em microfluidic, técnicas de captura de afinidade e abordagens baseadas em precipitação) estão se tornando populares no campo vesícula extracelular, em nossa experiência, essas abordagens podem resultar em rendimentos reduzidos e são tipicamente incompatíveis com os volumes de cultura necessários.

Os pesquisadores precisam considerar a composição do fundo iodixanol e os buffers de lavagem/ressuspensão usados durante a purificação vesícula para garantir que sejam compatíveis com as aplicações a jusante desejadas. Em muitos casos, a amostra final de vesícula pode ser resuspendida em mídia de crescimento ou um buffer definido comparável na composição ao meio de crescimento (por exemplo, natural versus água do mar artificial). No entanto, isso pode não ser possível com vesículas cianobacterianas marinhas, o que exigirá mais manipulação experimental para análise, já que altas concentrações de sal semelhantes aos níveis de água do mar podem inibir muitas reações enzimáticas. Nesses casos, tampões de laboratório padrão como 0,2 μm filtrado, 1x PBS normalmente funcionam bem para manter a estabilidade das vesículas cianobacterianas marinhas e podem ser mais compatíveis com processos experimentais a jusante.

A purificação do gradiente de densidade pode ser considerada opcional dependendo das metas experimentais e da composição da cultura, mas é fortemente recomendada para produzir uma amostra mais rigorosamente pura e reprodutível. As populações de EV são heterogêneas e podem ser encontradas em uma variedade de densidades flutuantes, que variam ainda mais de tensão, condições de crescimento e outros fatores ^4,5,6. As densidades listadas acima representam aquelas tipicamente encontradas para vesículas de culturas cianobacterianas e amostras de campo em iodixanol, mas os resultados em outras cepas podem variar. Outros materiais gradientes de densidade, como sacarose e CsCl, podem ser utilizados para vesículas, mas migrarão para diferentes densidades flutuantes nesses fundos. Diferentes fundos de mídia gradiente podem viés de recuperação de vírus lipídios⁴³ e podem potencialmente influenciar a recuperação de vesículas de diferentes cepas.

Vesículas podem ser perdidas em vários pontos através do isolamento vesícula, e processo de purificação gradiente descrito aqui, reduzindo os rendimentos e aumentando a quantidade de material inicial necessário para alcançar um determinado rendimento final de vesícula para aplicações a jusante. Deve-se tomar cuidado especial ao trabalhar com pelotas de vesícula após a ultracentrifugação. Embora algumas vesículas cianobacterianas possam ter carotenoides ou outros compostos que possam emprestar às amostras de vesícula alguma quantidade de pigmentação (Figura 2), dependendo da cepa ou quantidade de material, não é necessariamente esperado que seja capaz de visualizar a pelota de vesículas diretamente. Esteja ciente de onde a pelota deve ser dada o tipo de rotor centrífuga usado. Quando possível, as amostras de vesículas purificadas são sugeridas a serem examinadas por microscopia eletrônica para verificar a composição do material final recuperado.

O impacto das condições de armazenamento nas vesículas e seu conteúdo continua sendo uma questão em aberto. Embora se descobriu que o armazenamento não tem um efeito notável sobre o tamanho ou concentração de vesícula cianobacteriana¹⁴, a funcionalidade de preparações isoladas de vesículas pode mudar com o tempo⁴⁴. Embora os ciclos de congelamento/degelo devem ser evitados sempre que possível, o impacto do congelamento de amostras nos números e tamanhos globais de vesículas parece ser mínimo. Deve-se estar ciente do potencial de ciclos de congelamento para influenciar a composição do conteúdo vesícula, como o comprimento dos ácidos nucleicos associados à vesícula ou a estabilidade das proteínas.

Vesículas de field samples
Os métodos atuais para isolar vesículas extracelulares de ambientes aquáticos naturais são conceitual e operacionalmente semelhantes aos descritos aqui para culturas de grande volume. Ainda assim, eles podem exigir volumes ainda maiores de material. Essas amostras de campo podem envolver coleta, filtração e concentração de centenas a milhares de litros de água para obter material suficiente para análise. Dependendo da turbidez da amostra utilizada, pode ser necessária a incorporação de um ou mais passos de pré-filtragem antes do filtro de 0,2 μm. O dispositivo TFF específico utilizado deve ser apropriado para trabalhar com volumes tão grandes em uma quantidade razoável de tempo (idealmente na ordem das horas) e sem colocar pressão excessiva sobre a amostra. Na prática, isso muitas vezes envolve o uso de uma área de superfície total muito maior do que poderia ser aplicada a amostras baseadas em cultura, bem como tubos de maior diâmetro para facilitar o aumento das taxas de fluxo. Esse aumento da área da superfície do filtro provavelmente levará a um aumento marginal nas perdas de partículas em comparação com arranjos menores de TFF e um maior volume final de concentrado; no entanto, essas preocupações devem ser equilibradas com considerações do tempo total de processamento. Para situações como um cruzeiro oceanográfico estendido onde as amostras não retornarão a um laboratório por muitos dias após a amostragem, recomendamos a realização de filtragem inicial de 0,2 μm e etapas de TFF no campo. Este volume menor de material concentrado pode então ser armazenado a 4 °C ou -80 °C a bordo (dependendo da disponibilidade e considerações analíticas a jusante) até que seja devolvido ao laboratório para processamento final.

O isolamento e a separação de vesículas extracelulares de outras partículas pequenas, tanto orgânicas quanto inorgânicas, podem ser desafiadores, e os métodos para separar diferentes partículas ainda não são perfeitos. Por exemplo, gradientes de densidade iodixanol podem não separar prontamente todas as classes de vesículas e vírus presentes em uma determinada amostra. Como os tipos de partículas de confusão, e suas propriedades físicas, variam entre os locais de amostragem, atualmente é impossível fornecer um protocolo que irá dividir robustamente todas as classes de pequenas partículas aquáticas. Tentativa e erro são essenciais, e a experimentação com a faixa iodixanol usada nas condições de gradiente e ultracentrifugação será necessária para maximizar a separação; uma coleção de menores volumes, frações de densidade mais finamente resolvidas também podem ser necessárias. Dependendo do contexto, o uso de gradientes de CsCl em vez de iodixanol pode ajudar a separar partículas ambientais⁴⁵. Ainda assim, a mudança nas condições osmóticas pode levar a vieses nos produtos recuperados finais, como discutido acima.

Caracterização vesícula
Os instrumentos de análise de nanopartículas ainda não estão disponíveis rotineiramente em ambientes laboratoriais de microbiologia, mas estão se tornando cada vez mais disponíveis. Todas as metodologias têm prós e contras, e não fazemos nenhum endosso específico de uma plataforma como sendo melhor do que todas as outras para o trabalho de vesícula cianobacteriana; na verdade, todos têm compensações particulares em relação a custos, resolução, facilidade de uso, limites de detecção, compatibilidade com diferentes fundos de mídia/buffer de crescimento e reprodutibilidade de dados. Além de instrumentos baseados na análise de rastreamento de nanopartículas descritas acima, outras abordagens, incluindo citometria de nanofluxo, sensoriamento de pulso resistivo microfluido e ^{sensoriamento de} pulso resistivo, podem ser aplicadas^46,47. Os usuários devem ter cuidado para saber os detalhes de sua instrumentação disponível e verificar se ele funciona bem com seu sistema, pois encontramos dificuldades ao usar algumas plataformas com mídia baseada em água do mar. Incentivamos o campo a avançar em direção à caracterização quantitativa do tamanho da vesícula, concentrações e taxas de produção. Medir as concentrações de vesículas em uma base fundamental de partículas per mL, e não em termos de conteúdo proteico ou outras métricas, permitirá a integração das vesículas em estruturas mais quantitativas e permitirá intercomporações entre cepas e condições. Outros esforços para melhorar a capacidade de calibrar medidas de concentração para partículas de < 100nm são necessários.

O fato de as medições da taxa de produção de vesículas serem feitas diretamente a partir de 0,2 μm de cultura filtrada supernante para minimizar perdas de partículas estaria associado a outras etapas de purificação descritas acima. No entanto, isso significa que a abordagem não necessariamente discrimina entre vesículas extracelulares reais e outras pequenas partículas encontradas nas culturas. Apenas contar partículas dentro de faixas de tamanho específicas (por exemplo, 50-250 nm de diâmetro) pode ajudar a excluir alguns outliers, mas a confirmação visual de que o conteúdo de cultura de < 0,2 μm parece ser vesículas ligadas à membrana (por TEM ou outras abordagens) é necessária para ser capaz de afirmar especificamente que se está medindo a produção de vesículas em oposição à produção de partículas semelhantes à vesícula.

Um fator essencial na caracterização da vesícula é garantir que a amostra de vesícula esteja sendo analisada na faixa de sensibilidade linear apropriada do dispositivo de análise de nanopartículas. Quando uma amostra está muito concentrada, é simples diluir esse material com um tampão limpo e re-analisá-lo. Por outro lado, a densidade relativamente baixa de células e/ou vesículas de algumas culturas cianobacterianas pode às vezes produzir preparações vesículas que estão abaixo dos limites de detecção de alguns instrumentos. Nos casos em que isso ocorre com purificações de vesículas a granel, pode-se considerar o crescimento de culturas de volume maior, re-pelotas e reutilização do material final em um volume menor, ou avaliar se há um passo no processo de isolamento onde perdas excessivas estão ocorrendo e podem ser mitigadas. Ao medir as taxas de produção de vesículas, as correções não são necessariamente tão simples. As amostras podem ser concentradas se necessário, mas a primeira deve ver se os ajustes na mídia podem resultar em densidades celulares mais altas ou se amostras suficientemente concentradas poderiam ser obtidas a partir de pontos de tempo posteriores durante a fase exponencial onde as concentrações serão maiores.

Limitações
Como em qualquer protocolo, o isolamento vesícula usando essas abordagens tem claras limitações. Essas abordagens não dependem de sua garantia de que uma preparação totalmente pura de vesículas será isolada. Tanto culturas quanto amostras de campo podem conter outros materiais, que migram de forma semelhante às vesículas em gradientes de densidade. Ainda assim, no mínimo, esses tipos de metodologias adicionais de purificação são essenciais para garantir rigor e reprodutibilidade da análise vesícula. Embora descrevamos abordagens de isolamento vesícula no contexto de cianobactérias, culturas de muitos outros micróbios também conterão vesículas em concentrações relativamente baixas, e os procedimentos aqui descritos devem ser geralmente aplicáveis. Espera-se que esses métodos não sirvam como um protocolo permanente, mas como ponto de partida para estimular avanços futuros no trabalho com vesículas extracelulares de micróbios diversos. Esforços futuros são necessários para fundir esses métodos com outras abordagens, como colunas de exclusão de tamanho ou fracionamento assimétrico de fluxo de campo para melhorar a discriminação e separação de diferentes categorias de pequenas partículas de culturas e amostras ambientais. Também esperamos que essas técnicas possam continuar a evoluir ao lado de melhorias nas tecnologias de caracterização de nanopartículas para melhorar a capacidade de examinar a heterogeneidade dentro das populações vesículas, seus conteúdos e seus papéis funcionais exatos no ambiente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x Tampão de fosfato salino (PBS), pH 7.4	Tampão caseiro	---	Tampão padrão de lavagem/armazenamento que pode ser usado com vesículas; pode ser feito em laboratório ou comprado comercialmente
Solução de acetato de uranila a 2%	Microscopia Eletrônica Sciences	22400-2	Coloração negativa - TEM
4x Tampão de Amostra Laemmli	Bio-Rad	161-0747	Desnaturação da amostra de vesícula antes da proteólise, necessária para a coloração de lipopolissacarídeos (LPS)
Filtros ultracentrífugos Amicon (100 kDa)	Merck	UFC9100XX	Opção alternativa para ultrafiltração centrífuga
Meio BG11	Meio caseiro	---	Meio para cultivo de Synechocystis sp. PCC 6803
Filme de Suporte de Carbono 200 Mesh, cobre. CF200-	Electron Microscopy Sciences	71150	Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) grade
easiGlow Glow Sistema de limpeza de descarga de brilho	Ted Pella	91000	Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 resina epóxi Electron	Microscopy Sciences	14120	Seções ultrafinas - TEM
Suporte de filtro para sistema de vácuo	Thermo Fisher Scientific	300-4000	Unidades reutilizáveis com placas de suporte de membrana filtrante
Glutaraldeído  Seções ultrafinas de grau I	Sigma-Aldrich	G5882-10X1ml	- TEM
HEPES [N- (2-hidroxietil) piperazina-N′ - (ácido 2-etanossulfônico) sal de sódio]	Sigma-Aldrich	H7006	Agente tamponante para meios de crescimento de cianobactérias
Citrato de chumbo,	Microscopia eletrônica trihidratada Ciências	17800	Mancha para uso em microscopia eletrônica
Macrosep Advance Centrífuga Dispositivos com Membrana Omega 100K	Pall	MAP100C36	Para ultrafiltração centrífuga de amostras de pequeno volume
Módulo Millipore Pellicon 3 TFF	EMD Millipore	XX42P0060 ou XX42P0080	Opção TFF alternativa para concentrar amostras de grande volume
Sistema de purificação de água de referência Milli-Q	Merck	Z00QSV0WW	Sistema de purificação de água para obtenção de água de grau ultrapuro tipo I
NanoSight	Malvern Panalytical	LM14 ou NS300	Análise de rastreamento de nanopartículas
Optima L80 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	L80 XP	Ultracentrifuge (ou modelo similar)
OptiPrep / Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	Mídia de gradiente
de densidade Reagente de tetróxido de ósmio Plus	Sigma-Aldrich	201030	Seções ultrafinas - TEM
Pall Centramate Suporte de PE TFF	A Pall Corporation	FS002K10	módulo TFF bom para concentrar 10s-100s de L de amostra; requer módulos de filtro adicionais de 30 ou 100 kDa para escalar com seus volumes estimados
Bomba peristáltica Masterflex L/S	Cole-Parmer	07559-07	Bomba para acionamento de módulos TFF em grande escala
Fracionador de gradiente de pistão	Biocomp Instruments	152-001	Fracionamento automatizado de gradiente de densidade
Tubos de policarbonato para o rotor 70 Ti	Beckman Coulter	355618	Tubos de alumínio de policarbonato de ultracentrífuga reutilizáveis com montagem de tampa
Pro99 médio	caseiro	---	Médio para cultivo de Prochlorococcus
Pro-Q Kit de coloração de gel LPS	Thermo Fisher Scientific	P20495	LPS coloração
SN médio	caseiro	---	Meio para cultivo de cepas marinhas de cianobactérias, como Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250-100G	Agente tamponante na preparação de amostras de vesículas para
rotor de caçamba oscilante TEM SW32Ti	Beckman Coulter	369650	Rotor de ultracentrífuga, comporta 6 tubos de ~ 40 mL; bom para peletização de material a granel
SW60Ti oscilante rotor de balde	Beckman Coulter	335650	Rotor de ultracentrífuga, comporta 6x ~4,5 mL tubos; bom para purificações de gradiente e lavagens finais de vesículas
Seringa 1mL Luer	BD Plastipak	303172	Para isolamento de vesículas e carregamento de amostras em equipamentos de análise de rastreamento de partículas (NTA)
Filtro de seringa 0,2 µ m	Pall Corporation	4602	Para isolamento de vesículas de culturas
TAPS [N-[Tris(hidroximetil)metil]-3-ácido aminopropanossulfônico]	Sigma-Aldrich	T5130	Agente tamponante para meios de crescimento de cianobactérias
Microscópio eletrônico de transmissão	JEOL	JEM-1400	Ou microscópio similar
Tipo 70 Ti Rotor de titânio de ângulo fixo	Beckman Coulter	337922	Rotor de ultracentrífuga, comporta 8x ~39 mL tubos; bom para peletização de material a granel
Protease Tipo XIV de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	Enzima para proteólise de proteínas EVs, necessária para coloração LPS
Tubos UltraClear para o rotor SW32Ti	Beckman Coulter	344058	Tubos de ultracentrífuga de uso único
Tubos UltraClear para o rotor SW60Ti	Beckman Coulter	344062	Uso único tubos de ultracentrífuga
Ultramicrótomo PowerTome XL, PT-PC	RMC Products,  Boeckeler Instruments	75501	Micrótomo para seções ultrafinas - TEM
Centrífuga Universal 320 R	Hettich	Z654736	Esta ou qualquer centrífuga de bancada/chão de uso geral semelhante pode ser usada para peletizar células
Aparelho de vácuo	KNF Neuberger	N026.3 AT.18	Ou qualquer bomba de vácuo e armadilha semelhante
Vivaflow 200 100.000 MWCO PES	Sartorius	VF20P4	Módulo TFF, bom para 2-3L. Você pode conectar diferentes módulos para um volume maior (figura 1).
Filtro de cápsula Whatman Polycap TC (0.2/0.2µ m)	Cytiva	6717-9502	Filtro de cápsula para filtrar grandes volumes de líquido
Zetasizer	Malvern Panalytical	Zetasizer Nano ZS	Instrumento de espalhamento de luz dinâmico (DLS)