Summary
Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.
Abstract
De hersenen worden niet langer beschouwd als een orgaan dat geïsoleerd functioneert; accumulerend bewijs suggereert dat veranderingen in het perifere immuunsysteem indirect de hersenfunctie kunnen vormen. Op het grensvlak tussen de hersenen en de systemische circulatie zijn de choroïde plexussen (CP), die de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière vormen, gemarkeerd als een belangrijke plaats van periferie-naar-hersencommunicatie. CP produceert het hersenvocht, neurotrofe factoren en signaalmoleculen die de homeostase van de hersenen kunnen vormen. CP zijn ook een actieve immunologische niche. In tegenstelling tot het hersenparenchym, dat onder fysiologische omstandigheden voornamelijk door microglia wordt bevolkt, vat de heterogeniteit van CP-immuuncellen de diversiteit in andere perifere organen samen. De CP-immuunceldiversiteit en -activiteit veranderen met veroudering, stress en ziekte en moduleren de activiteit van het CP-epitheel, waardoor indirect de hersenfunctie wordt gevormd. Het doel van dit protocol is om murine CP te isoleren en ongeveer 90% van de belangrijkste immuunsubsets te identificeren die ze bevolken. Deze methode is een hulpmiddel om CP-immuuncellen te karakteriseren en hun functie te begrijpen bij het orkestreren van periferie-naar-hersencommunicatie. Het voorgestelde protocol kan helpen ontcijferen hoe CP-immuuncellen indirect de hersenfunctie moduleren in de gezondheid en over verschillende ziekteomstandigheden.
Introduction
Sinds de ontdekking van de bloed-hersenbarrière door Paul Erhlich in de late 19e eeuw, worden de hersenen beschouwd als vrijwel gescheiden van de andere organen en de bloedbaan. Toch is het afgelopen decennium het concept ontstaan dat de hersenfunctie wordt gevormd door verschillende biologische factoren, zoals darmmicrobiota en systemische immuuncellen en signalen1,2,3,4. Tegelijkertijd zijn andere hersengrenzen zoals hersenvliezen en choroïde plexussen (CP) geïdentificeerd als interfaces van actieve immuun-hersenkruispraat in plaats van inerte barrièreweefsels5,6,7,8.
De CP vormen de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière, een van de grenzen die de hersenen en de periferie scheiden. Ze bevinden zich in elk van de vier ventrikels van de hersenen, d.w.z. de derde, de vierde en beide laterale ventrikels, en grenzen aan gebieden die betrokken zijn bij neurogenese, zoals de subventriculaire zone en subgranulaire zone van de hippocampus3. Structureel zijn de CP samengesteld uit een netwerk van fenestrated bloedcapillairen omsloten door een monolaag van epitheelcellen, die onderling verbonden zijn door strakke en hechte juncties9,10. Belangrijke fysiologische rollen van het CP-epitheel omvatten de productie van hersenvocht, dat de hersenen spoelt uit afvalmetabolieten en eiwitaggregaten, en de productie en gecontroleerde bloed-naar-hersenpassage van verschillende signaalmoleculen, waaronder hormonen en neurotrofe factoren11,12,13. Uitgescheiden moleculen van CP vormen de activiteit van de hersenen, d.w.z. door neurogenese en microgliale functie te moduleren14,15,16,17,18,19, waardoor CP cruciaal is voor hersenhomeostase. CP houdt zich ook bezig met verschillende immuunactiviteiten; terwijl het belangrijkste immuunceltype in het hersenparenchym onder niet-pathologische omstandigheden microglia is, is de diversiteit van CP-immuuncelpopulaties net zo breed als in perifere organen3,7, wat suggereert dat verschillende kanalen van immuunregulatie en signalering aan het werk zijn bij de CP.
De ruimte tussen de endotheel- en epitheelcellen, het CP-stroma, wordt voornamelijk bevolkt door grensgeassocieerde macrofagen (BAM), die pro-inflammatoire cytokines en moleculen tot expressie brengen die verband houden met de presentatie van antigeen als reactie op ontstekingssignalen3. Een ander subtype van macrofagen, de epiplexuscellen van Kolmer, zijn aanwezig op het apicale oppervlak van het CP-epitheel20. CP stroma is ook een niche voor dendritische cellen, B-cellen, mestcellen, basofielen, neutrofielen, aangeboren lymfoïde cellen en T-cellen die meestal effectorgeheugen T-cellen zijn die antigenen van het centrale zenuwstelsel kunnen herkennen7,21,22,23,24. Bovendien verandert de samenstelling en activiteit van immuuncelpopulaties bij de CP bij systemische of hersenverstoring, bijvoorbeeld tijdens veroudering10,14,15,21,25, microbiota perturbatie7, stress26 en ziekte27,28. Met name werden deze veranderingen gesuggereerd om indirect de hersenfunctie te vormen, d.w.z. een verschuiving van CP CD4 + T-cellen naar Th2-ontsteking treedt op bij hersenveroudering en triggert immuunsignalering van de CP die verouderingsgerelateerde cognitieve achteruitgang kan vormen14,15,21,25,29 . Het verlichten van de eigenschappen van de CP-immuuncellen zou dus cruciaal zijn om hun regulerende functie op CP-epitheelfysiologie en -secretie beter te begrijpen en daardoor hun indirecte impact op de hersenfunctie onder gezonde en ziekteomstandigheden te ontcijferen.
CP zijn kleine structuren die slechts een paar immuuncellen bevatten. Hun isolatie vereist microdissectie na een voorbereidende stap van perfusie; immuuncellen in de bloedbaan zouden anders belangrijke verontreinigingen vormen. Dit protocol heeft tot doel de myeloïde en T-celsubsets van de CP te karakteriseren met behulp van flowcytometrie. Deze methode identificeert ongeveer 90% van de immuuncelpopulaties die muis-CP samenstellen onder niet-inflammatoire omstandigheden, in overeenstemming met recent gepubliceerde werken met behulp van andere methoden om immuun CP-heterogeniteit te ontleden7,10,28. Dit protocol kan worden toegepast om veranderingen in het CP-immuuncelcompartiment te karakteriseren met ziekte en andere experimentele paradigma's in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Commissie voor de behandeling van proefdieren, richtlijn 86/609/EEG. Ze werden goedgekeurd door de ethische commissies nr. 59, door de CETEA / CEEA nr. 089, onder het nummer dap210067 en APAFIS # 32382-2021070917055505 v1.
1. Voorbereiding van de materialen
- Bewaar alle antilichamen (materiaaltabel) bij 4 °C, beschermd tegen blootstelling aan licht.
- DAPI-stamoplossing (1 mg/ml): Resuspend het poeder in PBS-/- (Table of Materials), aliquot, en bewaren bij -20 °C.
- DAPI-werkoplossing (0,1 mg/ml): Verdun DAPI-stamoplossing met PBS-/- in een verhouding van 1:10.
- Magnetisch geactiveerde celsorteringsbuffer (MACS): Bereid 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 0,5% runderserumalbumine (BSA) (Materiaaltabel) in PBS-/-.
- Collagenase IV stockoplossing (20 E/μL): Resuspend het poeder in PBS+/+ (Table of Materials), aliquot, en bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Collagenase IV vereist mgCl2 om volledig actief te zijn; collagenase IV-oplossing niet bevriezen en ontdooien. - Anesthetisch-analgetische oplossing: Meng 150 μL ketamine (150 mg/kg), 25 μl xylazine (5 mg/kg) en 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) in 1 ml PBS-/-.
OPMERKING: Bereid extemporeus een anesthetisch-analgetische oplossing voor en bewaar deze niet langer dan een dag. - Heparine-oplossing (100 E/ml): Resuspend het poeder in PBS-/-.
- Bereid het infusie-inzetsysteem voor dat een buis verbindt met een decanter Erlenmeyer gevuld met PBS-/-. Sluit een naald van 23 G aan op het uiteinde van de infuusbuis. Open de infusie-inzet en laat de PBS lopen totdat er geen bubbels in de buis zitten.
- Bereid de verrekijkerloep voor die is uitgerust met een lampje.
2. Huisvesting van C57BL/6 muizen
- Gebruik voor de analyse van CP-myeloïde of T-cellen vier muizen voor elk en pool de vier CP (twee van elke laterale ventrikel, de derde ventrikel en de vierde ventrikel CP; voor acht muizen in totaal). Het niet poolen van CP brengt het risico met zich mee dat de zeldzame immuunpopulaties in CP niet worden gedetecteerd vanwege hun lage abundantie.
- Laat de muizen minstens 7 dagen acclimatiseren voorafgaand aan een experiment. Houd de muizen onder pathogeenvrije omstandigheden bij constante temperatuur en vochtigheid, in een licht/donkercyclus van 12/12 uur of 14/10 uur, met water en standaard pelletvoer ad libitum.
3. PBS-perfusie en hersendissectie
- Weeg elke muis en injecteer intraperitoneaal 10 μL/g van de anesthetisch-analgetische mixoplossing (stap 1.6).
- Wacht ongeveer 30 minuten op efficiënte analgesie (controleer op de diepte van de anesthesie door in de cijfers van de muis te knijpen).
- Plaats de verdoofde muis plat op zijn rug, op de dissectiesteun en plak zijn handpalmen vast aan de dissectiesteun.
- Knijp in de huid van het dier met een tang en gebruik een schaar, open de buik, het middenrif en de thorax om het hart bloot te leggen.
OPMERKING: Wanneer de thorax wordt geopend, worden de hersenen anoxisch. Men moet nauwkeurig en snel doorgaan met de volgende stappen van de perfusie. - Injecteer 20 μL van 100 E/ml heparine-oplossing rechtstreeks in de linker ventrikel.
- Maak met een fijne schaar een incisie van ten minste 3 mm in het rechteratrium om het bloed uit het lichaam te laten stromen.
- Breng onmiddellijk daarna de 23 G-naald in die aan het uiteinde van de infuusbuis is geplaatst door de punt van de linker ventrikel.
- Open het infusiesysteem maximaal en wacht op volledige perfusie: Met behulp van een naald van 23 G, met een stroomsnelheid van ongeveer 6 ml /min, is de perfusie voltooid in 3 minuten.
OPMERKING: De gelijkmatige verkleuring van organen zoals de lever getuigt van perfusie-werkzaamheid. - Sluit het infusiesysteem en verwijder de naald uit de hartkamer.
- Verwijder de tape van de handpalmen van de muis. Plaats de muis in een ventrale positie.
- Knijp de huid van het dier met een tang en gebruik een schaar, verwijder de huid van de bovenkant van het hoofd van de ogen naar de oren.
- Knip met behulp van een schaar de schedel eerst tussen de ogen en vervolgens zijdelings van elk oog naar het ruggenmerg net boven de kauwspieren. Gebruik hiervoor de extremiteit van de schaar en ga voorzichtig te werk om te voorkomen dat de hersenen met de schaar worden beschadigd.
- Open de schedel met een tang door deze vanaf het uiteinde tussen de ogen te knijpen.
- Gebruik een schaar om het ruggenmerg door te knippen en de hersenen met een tang te extraheren, plaats hun twee punten aan de laterale kant van de hersenen om het te kantelen en plaats het in een petrischaal gevuld met ijskoude PBS + / +. De CP worden dan direct opgehaald.
OPMERKING: Controleer op verkleuring van de hersenen om de werkzaamheid van de perfusie te verifiëren.
4. Dissectie van de Choroid Plexus uit de hersenen
- Plaats de dorsale kant van de hersenen naar boven in de petrischaal en onder de doelen van de binoculaire loepen.
- Met behulp van een tang om de hersenen op hun plaats te houden, steekt u de twee uiteinden van een andere tang door de middellijn tussen de hemisferen naar beneden.
- Gebruik de tang om de cortex met het callosum en de hippocampus weg te trekken van het septum, waardoor de laterale ventrikel en een deel van de derde ventrikel worden blootgesteld.
- Identificeer de laterale CP als een lange sluier die de laterale ventrikel bekleedt die aan beide uiteinden affakkelt. Gebruik de twee uiteinden van een dunne tang om de laterale CP te vangen. Zorg ervoor dat u het driehoekige achterste deel verzamelt dat verborgen kan zijn door de achterste plooi van de hippocampus.
- Trek de cortex met het corpus callosum en de hippocampus van de contralaterale hemisfeer weg van het septum om de hele derde ventrikel en de tegenovergestelde laterale ventrikel bloot te leggen.
- Verzamel met fijne tang de derde CP, die kan worden geïdentificeerd als een korte structuur met een korrelig oppervlakteaspect.
- Verzamel de andere laterale CP.
- Steek de twee uiteinden van een tang naar beneden tussen het cerebellum en de middenhersenen. Maak het cerebellum los van de pons en medulla om de vierde ventrikel bloot te leggen.
- Identificeer de vierde CP als een lange bolvormige structuur met een korrelig oppervlakteaspect dat de vierde ventrikel van het laterale rechtereinde naar het linkereinde tussen het cerebellum en het medulla bekleedt. Verzamel de vierde CP met fijne tang.
OPMERKING: Silaan-basis coating van tang kan kleverigheid van CP op tang voorkomen. - Herhaal stap 3.1-4.9 voor elk van de andere zeven muizen. In de tussentijd kan de verzamelde CP tijdelijk worden bewaard in een buis die op ijs wordt geplaatst.
5. Voorbereiding van monsters voor flowcytometrie-analyse
- Vul de buis met alle ontlede CP tot 750 μL PBS+/+.
OPMERKING: De afzetting van ontleed CP met dunne tang in de buis brengt een klein volume PBS +/+. Vul het bestaande volume liever aan tot 750 μL dan het te verwijderen en te vervangen door verse 750 μL PBS +/+ om mogelijk verlies van het CP-weefsel te voorkomen. - Voeg 15 μL collagenase IV-stamoplossing van 20 E/μL toe (zie stap 1.5) voor een eindconcentratie van 400 E/ml.
OPMERKING: DNAse I (150 μg/ml) kan overmatige celklontering voorkomen. - Incubeer CP met Collagenase IV bij 37 °C onder milde agitatie (300 RPM) gedurende 45 min.
- Pipetteer voorzichtig ongeveer 10 keer op en neer om de CP-dissociatie te voltooien.
- Vul de CP-buis tot 1,5 ml met MACS-buffer (zie recept stap 1.4) om de collagenase IV-activiteit te stoppen.
OPMERKING: Collagenase IV-activiteit wordt gestopt bij lage temperatuur en geremd door serumalbumine. - Centrifugeer de cellen bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en was de cellen met 1,5 ml MACS-buffer.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten, bij 4 °C. Gooi de supernatant- en resuspendcellen weg in 220 μL MACS-buffer.
- Scheid een aliquot van 10 μL van de celsuspensie om te worden gebruikt als niet-gekleurde controle (volgende stap 5.18).
- Scheid een aliquot van 10 μL van de celsuspensie om te worden gebruikt als DAPI-mono-gekleurde controle (volgende stap 5.12).
- Preïnculeer de resterende 200 μL met anti-muis CD16/CD32 blokkerend antilichaam (1:100) gedurende 20 minuten, bij 4 °C, om niet-specifieke Fc-gemedieerde interacties te blokkeren.
- Splits de cellen in twee buizen van 100 μL (één voor analyse van myeloïde cellen, de andere voor analyse van T-cellen) (volgende stap 5.14).
- Neem het monster met 10 μL cellen voor de DAPI-mono-gekleurde controle (stap 5.9) en vul het tot 100 μL met MACS-buffer (volgende stap 5.14).
- Bereid elf nieuwe buisjes met 100 μL MACS voor het antilichaam mono-gekleurd (stap 5.14.4) en alle gekleurde controles (stap 5.14.5) en voeg een druppel compensatieparels toe aan elk.
OPMERKING: De compensatieregelaars maken het mogelijk om de spanning van fluorescerende detectielaser in te stellen en de potentiële niet-specifieke signaaldetectie van fluorescerende kleurstof in de andere kanalen te beoordelen die verder worden gecompenseerd. - Antilichaam incubatie van monsters:
- Myeloïde monster: Voeg 0,1 mg/ml DAPI (1:100) toe (zie stap 1.3), FITC anti-muis CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-muis CD11b (1:100), APC anti-muis CX3CR1 (1:100), BV711 anti-muis Ly6C (1:100), PE anti-muis F4/80 (1:100) en APC-Cy7 anti-muis IA-IE (1:100).
- T-cellenmonster: voeg 0,1 mg/ml DAPI (1:100), FITC anti-muis CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-muis CD11b (1:100), APC anti-muis TCRβ (1:100), PE anti-muis CD8a (1:100) en APC-Cy7 anti-muis CD4 (1:50) toe.
- DAPI-mono-gekleurde controle (vanaf stap 5.12): Voeg 0,1 mg/ml DAPI (1:100) toe.
- Antilichaam mono-gekleurde compensatie kralen: Voeg elk van de negen eerder gebruikte antilichamen voor myeloïde en T-cellen monsters (dezelfde verdunning), afzonderlijk (één voor elke buis) toe aan de negen buizen met de kralen.
OPMERKING: De mono-gekleurde compensatieregelaars maken het mogelijk om positieve fluorescentiepieken te bepalen voor elk van de gebruikte fluorescerende markers tijdens de compensatiestap. De analysator vergelijkt ze met het negatieve signaal dat wordt waargenomen in de niet-gekleurde cp-cellen van de controle. - Antilichaam all-stained compensatie kralen: Voeg alle antilichamen die worden gebruikt voor myeloïde kleuring toe aan de ene buis en die gebruikt voor T-cellen kleuring aan een andere.
OPMERKING: De volledig gekleurde compensatieregelaars maken het mogelijk om de spanning van elke fluorescerende laserdetectie in te stellen en de potentiële niet-specifieke signaaldetectie van fluorescerende kleurstof in de andere kanalen te beoordelen. - Incubeer gedurende 30-45 minuten op ijs, beschermd tegen blootstelling aan licht.
- Vul alle buizen tot 1,5 ml met MACS-buffer. Centrifugeer de cellen en compensatieparels bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en was de cellen en compensatieparels in 1,5 ml MACS-buffer.
- Centrifugeer de cellen en compensatieparels bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Resuspend de cellen en compensatieparels in 500 μL MACS-buffer. Vul onbevlekte controle (stap 5.8) tot 500 μL met MACS-buffer.
- Filter elke buis met CP-cellen door een zeef van 70 μm (onbevlekte CP, DAPI mono-gekleurde controle en myeloïde en T-cellenmonsters).
6. Flowcytometrie
OPMERKING: De flowcytometer die in dit protocol wordt gebruikt, is uitgerust met de volgende 5 lasers: een 355 nm UV-laser, een 405 nm Violette laser, een 488 nm Blauwe laser, een 561 nm Geel-Groene laser en een 637 nm Rode laser.
- Voer de dagelijkse kwaliteitscontroles op de cytometer uit met behulp van de cytometer setup, tracking (CST) interface en de CST-controleparels om consistentie tussen analyses, instrumentkwaliteit en consistente doelfluorescentie-intensiteiten te garanderen.
- Om het flowcytometrie-experiment op te zetten, maakt u een nieuw experiment met bivariate plots en histogrammen. Zorg voor de opname van een forward scatter area (FSC-A) en side scatter area (SSC-A) plots en histogram plots voor elke kleur om de acquisitie te monitoren.
- Definieer de celmorfologie door de PMT-spanning in te stellen voor FSC-A- en SSC-A-parameters op niet-gekleurde cp-cellen.
- Definieer de spanningen van elke fluorescerende marker door de negatieve pieken van de fluorochromen op niet-gekleurde cp-cellen en de positieve pieken van de fluorochrooms in te stellen met behulp van compensatieparels die met alle antilichamen zijn gekleurd en ervoor te zorgen dat de detectorsignalen niet van de schaal zijn en niet te sterk worden gedetecteerd in andere kanalen.
- Maak een compensatiematrix om elk van de eenkleurige compensatiebesturingselementen te analyseren. Controleer na het gateneren van geschikte FSC-A / SSC-A-populaties enkele bevlekte controles op histogramplots en registreer compensatiecontroles. Nadat u alle enkelvlekke monsters hebt geregistreerd, berekent u de compensatiematrix.
- Noteer alle gedetecteerde gebeurtenissen voor zowel myeloïde als T-celpopulaties.
7. CP myeloïde cellen gating
- Selecteer FSC-A vs. SSC-A en gate voor cellen (op basis van grootte).
- Maak een dochterpoort voor afzonderlijke cellen met FSC-A vs. voorwaartse strooihoogte (FSC-H).
- Maak een dochterpoort voor levende cellen met DAPI vs. FSC-A om DAPI+ -cellen uit te sluiten.
- Maak een dochterpoort voor CD45+ immuuncellen met CD45 vs. FSC-A.
- Maak een dochterpoort van de CD45+ cellen en selecteer CD11b vs. F4/80, identificeer de volgende twee groepen: de CD11b+ F4/80+ en de CD11b+ F4/80- populaties (volgende stap 7.8).
- Maak een dochterpoort voor CD11b+ F4/80+ cellen en selecteer CX3CR1 vs. IA-IE. Identificeer zowel CX3CR1+ IA-IE+ BAM die verder worden aangeduid als CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, als CX3CR1+ IA-IE- macrofagen.
- Maak een dochterpoort voor CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- macrofagen en selecteer F4/80 vs. CD11b. Identificeer zowel de CD11bhigh F4/80intermediate als de CD11b+ F4/80high populaties die verder CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus macrofagen en CD11b+ F4/80high CX3 worden genoemd CR1+ IA-IE- BAM, respectievelijk.
OPMERKING: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- en CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- cellen verschenen een beetje vermengd tussen F4/80intermediate-F4/80high en CD11bhigh-CD11b+ niveaus. - Van de CD11b+ F4/80- bevolking (stap 7.5), poort voor Ly6C vs. IA-IE. Selecteer zowel IA-IE+ Ly6C-populatie- als IA-IE- Ly6C+ cellen die voornamelijk overeenkomen met monocyten/neutrofielen.
OPMERKING: Een hoge aanwezigheid van IA-IE-Ly6C+ cellen weerspiegelt waarschijnlijk problemen in de perfusie-werkzaamheid van dieren zonder ontstekingsaandoening; hun overvloed moet laag zijn. - Maak een dochterpoort voor CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- populatie en selecteer CD11b vs. CX3CR1, identificeer zowel CD11bhigh CX3CR1low- als CD11b+ CX3CR1-populaties.
8. CP T-cellen gating
- Selecteer FSC-A vs. SSC-A en gate voor cellen (op basis van grootte).
- Maak een dochterpoort voor afzonderlijke cellen met FSC-A vs. voorwaartse strooihoogte (FSC-H).
- Maak een dochterpoort voor levende cellen met DAPI vs. FSC-A om DAPI+ -cellen uit te sluiten.
- Maak een dochterpoort voor CD45+ immuuncellen met CD45 vs. FSC-A.
- Maak een dochterpoort van de CD45+ cellen en selecteer TCRβ vs. CD11b. Sluit CD11b+ myeloïde cellen uit en selecteer TCRβ+ CD11b- T cellen populatie.
- Maak een dochterpoort voor TCRβ+ CD11b-populatie en selecteer CD4 vs. CD8a. Identificeer zowel CD8- CD4+ T-cellen als CD8+ CD4- T-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde flowcytometrieanalyses onthulden met succes de belangrijkste subsets van myeloïde en T-cellen (respectievelijk figuur 1 en figuur 2) en hun relatieve totale aantal per muis op een zeer reproduceerbare manier (figuur 3).
De flowcytometrie-analyse van myeloïde cellen toonde aan dat CP wordt bevolkt door CD11b + CX3CR1 + F4 / 80high BAM, die bijna 80% van de CD45 + immuuncellen bij de CP vertegenwoordigen. Deze BAM werden verdeeld in twee verschillende populaties op basis van hun expressie van MHC-II: de IA-IE + BAM die de belangrijkste groep vormde (72% van de CD45 + immuuncellen), in overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens7, en de IA-IE- BAM. De CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE-populatie van Kolmer's epiplexus macrofagen7,2 werd ook geïdentificeerd en vertegenwoordigde slechts ongeveer 1,2% van de CD45+ CP immuuncellen, consistent met de literatuur7. Onder de CD11b+ F4/80- immuuncellen werden twee verschillende populaties van Ly6C- IA-IE+ cellen gekarakteriseerd die waarschijnlijk overeenkomen met dendritische cellen, en die kunnen worden onderverdeeld in CD11bhigh CX3CR1low en CD11b+ CX3CR1- populaties die respectievelijk ongeveer 3,1% en 3,7% van de CD45+ CP-immuuncellen vormden. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ celpopulatie met zowel monocyten als neutrofielen vormde slechts 0,5% van de CD45+ immuuncellen in overeenstemming met eerdere rapporten en waaruit blijkt dat de PBS-perfusie zeer effectief is3. Deze resultaten komen grotendeels overeen met eerder gepubliceerde gegevens die CP-immuunpopulaties beoordelen door middel van eencellige RNA-sequencing7.
De analyse en gating strategie van T-cellen benadrukte de aanwezigheid van de kleine populatie van CD45+ CD11b- TCRβ+ cellen. Onder hen, ongeveer 30-50 CD8- CD4 + en CD8 + CD4- T cellen per muis bevolkt CP onder fysiologische omstandigheden, die respectievelijk 1,3% en 0,9% van de CD45 + CP immuuncellen vertegenwoordigen. CD4+ cellen waren iets overvloediger dan CD8+ T-cellen, wat consistent is met eerdere resultaten in termen van zowel aantal als verhouding21,30. Deze gating-strategie onthulde ook een populatie van CD45 + CD11b- TCRβ + CD4- CD8-cellen, die NKT-cellen kunnen omvatten, en een recent beschreven regulerende T-celsubset10,28,31. De voorgestelde flowcytometrie-analyse en gatingstrategieën maakten de celtype-annotatie mogelijk van bijna 90% van de immuuncellen (CD45 +) waaruit de muis CP bestaat.
Figuur 1: Flowcytometrie analyse en gating strategie van myeloïde cellen uit CP van perfused muizen. Cellen worden gated op basis van grootte met fsc-a versus ssc-a. Singlet cellen worden geselecteerd met FSC-A vs. FSC-H. Levende cellen worden afgesloten door DAPI+ cellen op DAPI vs. FSC-A plot uit te sluiten. CD45+ immuuncellen worden vervolgens geïdentificeerd op een CD45 vs. FSC-A plot. Gating CD11b vs. F4/80, de CD11b+ F4/80+ en de CD11b+ F4/80- populaties worden geselecteerd. Gating CD11b + F4/80 + populatie met behulp van CX3CR1 vs. IA-IE, zowel de CD11b + F4/80hi CX3CR1 + IA-IE + BAM en de CX3CR1 + IA-IE- populaties worden bepaald. Deze laatste populatie wordt vervolgens afgesloten met behulp van F4/80 vs. CD11b om CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- BAM en CD11bhigh F4/80 beter te scheiden CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus macrofagen. Gating Ly6C vs. IA-IE op CD11b+ F4/80-, zowel CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ cellen die voornamelijk overeenkomen met monocyten en neutrofielen en CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- cellen die waarschijnlijk dendritische celpopulatie vertegenwoordigen worden geselecteerd. CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C-cellen zijn gated met behulp van CD11b vs. CX3CR1 waardoor identificatie van CD11bhigh CX3CR1low en CD11b+ CX3CR1- cellen mogelijk is. Indien niet gespecificeerd, vertegenwoordigen waarden onder elke gated populatie de frequentie van de ouderpopulatie. hoi: hoog; int: gemiddeld; lo: laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Flowcytometrie analyse en gating strategie van T cellen uit CP van geperfuseerde muizen. Cellen worden gated op basis van grootte met fsc-a versus ssc-a. Afzonderlijke cellen worden geselecteerd met FSC-A versus FSC-H. Levende cellen worden geïdentificeerd met uitzondering van DAPI + -cellen op DAPI vs. FSC-A-plot. CD45+ immuuncellen worden vervolgens afgesloten op een CD45 vs. FSC-A plot. Gating CD11b vs. TCRβ, CD11b- TCRβ+ zijn geselecteerd. Gating CD4 vs. CD8, de verhoudingen van CD8- CD4+ en CD4- CD8+ T cellen worden bepaald. Indien niet gespecificeerd, vertegenwoordigen waarden onder elke gated populatie de frequentie van de ouderpopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Aantallen van de belangrijkste immuuncelsubsets bij de CP per muis. Gemiddelde van het totale aantal cellen per muis van de verschillende immuunsubsets geïdentificeerd in de vier CP samengevoegd. Representatie: Gemiddelde + standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studies gericht op het begrijpen van de immunologische bijdragen aan hersenhomeostase en -ziekte hebben zich voornamelijk gericht op cellen die zich in het hersenparenchym bevinden, waarbij hersengrenzen zoals CP worden verwaarloosd, die niettemin cruciale bijdragen leveren aan de hersenfunctie2,3. De analyse van immuuncelpopulaties bij CP is een uitdaging vanwege de kleine omvang van CP, lage aantallen residente immuuncellen en gecompliceerde toegang tot dit weefsel. Flowcytometrie uitgevoerd op totale hersenimmuuncellen (CD45+) laat de karakterisering van de zeldzame immuunpopulaties die zich in de CP bevinden niet toe. Om de immuunsamenstelling van de CP met hoge precisie te karakteriseren, werden flowcytometrie-analyses uitgevoerd op CP ontleed van PBS-geperfuseerde muizen. Deze aanpak maakt de uitsluiting van circulerende CD45+ cellen en CP CD45-cellen zoals pericyten, endotheel- en epitheelcellen32 mogelijk. De gatingstrategieën gericht op myeloïde en T-celpopulaties identificeren de belangrijkste CP-immuunsubsets.
Een cruciale stap van het huidige protocol is de PBS-perfusie. Omdat de CP-immuuncellen zeldzaam zijn, kan bloedverontreiniging hun lokale heterogeniteit volledig maskeren. Lever- en hersenverkleuring wordt altijd gecontroleerd als controle, en daarom is bloedbesmetting minimaal. Consequent was CD11b + F4 / 80- Ly6C +, dat zowel monocyten als neutrofielen in het bloed bevat in plaats van de hersenen in niet-inflammatoire omstandigheden3, goed voor slechts 0,5% van de CD45 + -cellen, wat een hoge werkzaamheid van PBS-perfusie aantoont. Een andere nuttige controle voor de werkzaamheid van PBS-perfusie kan de opname van antilichamen tegen Ter119 zijn, een marker die specifiek is voor erytrocyten. Ten slotte kan een aanvullende analyse van de CP van PBS-geperfundeerde muizenhersensecties door immunostaining en microscopie ook nuttig zijn om te verifiëren of bloedimmuuncellen die sterk aan het endotheel kunnen hechten, de PBS-perfusie hebben weerstaan en vast blijven zitten aan het lumen van de vasculatuur.
De myeloïde gating-strategie onthulde twee populaties van macrofagen: CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE + / -BAM en CD11b + F4 / 80intermediate CX3CR1 + IA-IE- Kolmer's epiplexuscellen, die hoge niveaus van CD11b en lage niveaus van F4 / 807 tot expressie brengen. De poorten van Kolmers epiplexuscellen7,20 en IA-IE-BAM waren niet duidelijk gescheiden met cd11b- en F4/80-markers. Integratie van de CD206-marker in deze gating-strategie kan helpen om CD206 + IA-IE- BAM beter te onderscheiden van cd206low Kolmer's epiplexuscellen7.
Bijna 7% van de CP-immuuncellen bleek CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ te zijn. Deze subset was samengesteld uit twee populaties op basis van hun niveaus van CD11b- en CX3CR1-expressie. Deze cellen komen waarschijnlijk overeen met dendritische cellen, maar dit moet nog worden bevestigd door hun CD11c-expressie te analyseren door FACS3 of immunofluorescentie33. De CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ populatie omvat waarschijnlijk ook mestcellen. Het opnemen van antilichamen voor de detectie van CD117 en c-kit in de gating-strategie zou helpen om ze te onderscheiden van CD11c + dendritische cellen3,34. Het aandeel CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ cellen onder CP immuuncellen werd bepaald. Ze omvatten echter zowel monocyten als neutrofielen, en de toevoeging van de Ly6G-marker aan de gatingstrategie van CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + -cellen zou de verhouding van Ly6G-monocyten tot Ly6G + neutrofielen bepalen. Naast de beschreven CD45+ CD11b- TCRβ+ populatie, kan de gating strategie op CD45+ CD11b- populaties worden verrijkt met NK1.1 en CD11c markers om NK cellen te identificeren, TCRγδ om γδ T cellen te analyseren, CD19 en/of B220 om B cellen te karakteriseren, en CD138 om plasmacellen te identificeren3. Expressie van reportergenen kan ook in deze analyse worden opgenomen. Het gebruik van Foxp3-GFP transgene muizen kan bijvoorbeeld nuttig zijn bij het identificeren van CP-resident T regulerende (Treg) cellen3,30. Ten slotte kan dit protocol ook intracellulaire kleuring van transcriptiefactoren of cytokines bevatten21.
Terwijl de immuuncellen van het hersenparenchym uitgebreid zijn bestudeerd, is er veel minder bekend over immuuncellen die hersenbarrières bevolken, zoals de CP3,35,36. CP bij muizen zijn kleine weefsels in vier verschillende gebieden van de hersenen en hun isolatie vereist een vrij complexe microdissectie. Daarom werden de CP meestal bestudeerd met behulp van beeldvorming. Kleuring van CP-immuuncellen uit volledig CP-ontleed weefsel of uit hersensecties gevolgd door microscopische analyse leverde grote vooruitgang op in het begrip van CP-immuunmechanismen14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Deze methode maakt echter geen uitgebreide analyse van de CP-immuunceldiversiteit mogelijk, omdat slechts vier tot zes markers tegelijk kunnen worden geanalyseerd. Bovendien zijn sommige subpopulaties zoals CD4 + of CD8 + T-cellen vrij zeldzaam bij de CP, en kwantitatieve analyse van hun fenotypen met microscopie zou een uitdaging zijn. De flowcytometriebenadering maakt de analyse van tientallen markers parallel voor elke immuuncel mogelijk, wat een beter geschikt hulpmiddel biedt voor kwantitatieve beoordeling van de CP-immuunsamenstelling.
Meer recent kwam single nuclei transcriptomic technology (snRNA-seq) naar voren als een krachtige methode om CP-heterogeniteit te bestuderen10,28. Het is echter niet goed geschikt voor het analyseren van CP-immuuncellen, omdat ze slechts een klein deel van de CP-cellen vormen. Omdat snRNA-seq de cellen bemonstert in de verhouding waarin ze in het weefsel aanwezig zijn, zijn de immuuncellen ondervertegenwoordigd in de snRNA-seq en vormen hun lage aantallen een obstakel voor diepgaande analyse10,28.
Single-cell transcriptomics (scRNA-seq) is onlangs toegepast om de immuuncel heterogeniteit van geïsoleerde CP-immuuncellen nauwkeurig in kaart te brengen7. Hoewel scRNA-seq vrij complex en duur is om uit te voeren, kan flowcytometrie dienen als een meer toegankelijke manier om immuunsubpopulaties te onderzoeken bij de CP. Ten slotte kan dit protocol dienen als onderdeel van een celsorteerprotocol, waarbij de geselecteerde subtypen cellen worden gesorteerd met behulp van FACS voor analyse met moleculaire methoden, zoals scRNA-seq of bulk RNA-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Wij danken het Institut Pasteur Animalerie Centrale en de leden van de CB-UTechS-faciliteit voor hun hulp. Dit werk werd financieel ondersteund door het Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -W.
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
