Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En reporterassay for at analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Vi udviklede et intronisk mikroRNA biogenese reporterassay til brug i celler in vitro med fire plasmider: en med intronisk miRNA, en med målet, en til at overudtrykke et regulatorisk protein og en til Renilla luciferase. MiRNA'et blev behandlet og kunne kontrollere luciferaseekspression ved at binde til målsekvensen.

Abstract

MicroRNA'er (miRNA'er) er korte RNA-molekyler, der er udbredt i eukaryoter. De fleste miRNA'er transskriberes fra introner, og deres modning involverer forskellige RNA-bindende proteiner i kernen. Modne miRNA'er formidler ofte genhæmning, og dette er blevet et vigtigt redskab til at forstå post-transkriptionelle begivenheder. Derudover kan det udforskes som en lovende metode til genterapier. Der mangler imidlertid i øjeblikket direkte metoder til vurdering af miRNA-ekspression i pattedyrcellekulturer. Her beskriver vi en effektiv og enkel metode, der hjælper med at bestemme miRNA-biogenese og modning gennem bekræftelse af dets interaktion med målsekvenser. Dette system tillader også adskillelse af eksogen miRNA-modning fra dets endogene aktivitet ved anvendelse af en doxycyclin-inducerbar promotor, der er i stand til at kontrollere primær miRNA (pri-miRNA) transkription med høj effektivitet og lave omkostninger. Dette værktøj tillader også modulering med RNA-bindende proteiner i et separat plasmid. Ud over dets anvendelse med en række forskellige miRNA'er og deres respektive mål kan det tilpasses forskellige cellelinjer, forudsat at disse er modtagelige for transfektion.

Introduction

Forløber mRNA-splejsning er en vigtig proces til regulering af genekspression i eukaryoter1. Fjernelsen af introns og foreningen af exoner i modent RNA katalyseres af splejseosomet, et 2 megadalton ribonukleoproteinkompleks sammensat af 5 snRNA'er (U1, U2, U4, U5 og U6) sammen med mere end 100 proteiner 2,3. Splejsningsreaktionen forekommer co-transkriptionelt, og splejseosomet samles ved hver ny intron styret af genkendelse af konserverede splejsningssteder ved exon-intron-grænser og inden for intron4. Forskellige introns kan have forskellige splejsningshastigheder på trods af den bemærkelsesværdige bevarelse af splejsningskomplekset og dets komponenter. Ud over forskellene i bevarelse af splejsningssteder kan regulatoriske sekvenser fordelt på introns og exoner guide RNA-bindende proteiner (RBP) og stimulere eller undertrykke splejsning 5,6. HuR er en allestedsnærværende udtrykt RBP og er en vigtig faktor for at kontrollere mRNA-stabilitet7. Tidligere resultater fra vores gruppe viste, at HuR kan binde til introner indeholdende miRNA'er, hvilket indikerer, at dette protein kan være en vigtig faktor for at lette miRNA-behandling og modning, hvilket også fører til generering af alternative splejsningsisoformer 6,8,9.

Mange mikroRNA'er (miRNA'er) er kodet fra introniske sekvenser. Mens nogle er en del af intronen, er andre kendt som "mirtrons" og er dannet af hele intron 10,11. miRNA'er er korte ikke-kodende RNA'er, der spænder fra 18 til 24 nukleotider i længden12. Deres modne sekvens viser delvis eller total komplementaritet med målsekvenser i mRNA'er, hvilket påvirker translation og / eller mRNA-henfaldshastigheder. Kombinationerne af miRNA'er og mål driver cellen til forskellige resultater. Flere miRNA'er kan drive celler til pro- eller antitumorfænotyper13. Onkogene miRNA'er er normalt målrettet mod mRNA'er, der udløser en undertrykkende egenskab, hvilket fører til øget cellulær proliferation, migration og invasion14. På den anden side kan tumorundertrykkende miRNA'er målrette onkogene mRNA'er eller mRNA'er relateret til øget celleproliferation.

Forarbejdning og modning af miRNA'er er også afhængige af deres oprindelse. De fleste introniske miRNA'er behandles med deltagelse af mikroprocessoren, dannet af ribonuklease Drosha og proteinkofaktorer12. Mirtroner behandles med aktiviteten af splejseosomet uafhængigt af Drosha15. I betragtning af den høje frekvens af miRNA'er, der findes i introns, antog vi, at RNA-bindende proteiner involveret i splejsning også kunne lette behandlingen og modningen af disse miRNA'er. Især RBP hnRNP A2 / B1 har allerede været forbundet med mikroprocessoren og miRNA-biogenese16.

Vi har tidligere rapporteret, at flere RNA-bindende proteiner, såsom hnRNP'er og HuR, er forbundet med introniske miRNA'er ved massespektrometri17. HuR's (ELAVL1) tilknytning til miRNA'er fra miR-17-92 intronisk klynge blev bekræftet ved anvendelse af immunoprecipitation og i silicoanalyse 9. miR-17-92 er en intronisk miRNA-klynge sammensat af seks miRNA'er med øget ekspression i forskellige kræftformer 18,19. Denne klynge er også kendt som "oncomiR-1" og består af miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b og miR-92a. miR-19a og miR-19b er blandt de mest onkogene miRNA'er i denne klynge19. Den øgede ekspression af HuR stimulerer miR-19a og miR-19b syntese9. Da introniske regioner, der flankerer denne klynge, er forbundet med HuR, udviklede vi en metode til at undersøge, om dette protein kunne regulere miR-19a og miR-19b ekspression og modning. En vigtig forudsigelse af vores hypotese var, at HuR som et regulatorisk protein kunne lette miRNA-biogenese, hvilket førte til fænotypiske ændringer. En mulighed var, at miRNA'er blev behandlet ved stimulering af HuR, men ikke ville være modne og funktionelle, og derfor ville virkningerne af proteinet ikke direkte påvirke fænotypen. Derfor udviklede vi et splejsningsreporterassay for at undersøge, om en RBP som HuR kunne påvirke biogenesen og modningen af et intronisk miRNA. Ved at bekræfte miRNA-behandling og modning viser vores assay interaktionen med målsekvensen og dannelsen af et modent og funktionelt miRNA. I vores assay kobler vi ekspressionen af en intronisk miRNA-klynge med et luciferaseplasmid for at kontrollere, om miRNA-målbinding i dyrkede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En oversigt over den protokol, der er beskrevet her, er afbildet i figur 1.

1. Plasmid konstruktion

  1. pCAGGS-Cre: Dette plasmid blev leveret af Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Forstærk pre-miR-17-92 ved PCR ved hjælp af 0,5 μM af hver specifik primer (materialetabel), 150 ng cDNA, 1 mM dNTP'er, 1x Taq PCR-buffer og 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase. Udfør en pcr-reaktion uden skabelonkontrol (brug vand i stedet for cDNA) for at kontrollere, om DER er DNA-forurening.
    2. Ligat PCR-produktet i pRD-RIPE (venligst leveret af Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 inde i intronen mellem EcoRI- og EcoRV-begrænsningsstederne ved hjælp af DNA-ligase, hvilket skaber pRD-miR-17-92. Bekræft sekvensintegritet ved Sanger-sekventering.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Design fremadgående og omvendte primere flankeret af XhoI / XbaI-begrænsningssteder og med et NotI-begrænsningssted indeni. Der blandes ækvivalente mængder frem- og bakprimere, og blandingen inkuberes ved 90 °C i 5 min., hvorefter den overføres til 37 °C i 15 min. Som kontrol skal du bruge primere med krypterede målsekvenser (Materialetabel).
    2. Kløv de udglødede fragmenter ved hjælp af XhoI / XbaI-restriktionsenzymer og ligat dem nedstrøms for luc2-sekvensen i pmiR-GLO, hvilket genererer pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) og pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) reporterkonstruktioner. Bekræft ligering med NotI spaltning.
      BEMÆRK: Sørg for, at de udhæng, der er skabt efter grundglødning, supplerer vektoren efter spaltningsreaktion.
  4. pFLAG-HuR
    1. For at generere et HuR-overekspresserende plasmid forstærkes HuR-sekvensen med specifikke primere. Bland 300 ng cDNA, 0,5 μM af hver specifik primer, 1 mM dNTP-blanding, 1x PCR-buffer og 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase.
    2. Ligat PCR-produktet i pGEM-T og bekræft DNA-sekvensintegriteten ved Sanger-sekventering. Fjern HuR-fragmentet fra pGEM-T, og subklone det til pFLAG-CMV-3 pattedyrekspressionsvektor for at generere pFLAG-HuR-vektoren.

2. Cellekultur

BEMÆRK: HeLa-Cre-cellelinjen var en gave fra Dr. E. Makeyev21, og den papillære skjoldbruskkirtelkræftcelle (BCPAP) blev venligt leveret af Dr. Massimo Santoro (University "Federico II", Napoli, Italien). HeLa-celle, papillær thyreoideacancercelle (BCPAP) og HEK-293T blev brugt til at overudtrykke HuR.

  1. Cellerne i DMEM/højglukose suppleres med 10 % føtalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 200 mM L-glutamin og 1x penicillin-streptomycin (100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin) i 100 mm petriskåle, medmindre andet er angivet. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator i kontrolleret atmosfære (5 % CO2).
  2. Vedholdende celler inkuberes med trypsin/EDTA (0,5 % opløsningsblanding) ved 37 °C i 3-5 min. Lad dem løsne sig fra pladen (inkubationsperioden kan variere alt efter celletype).
  3. Udfør transfektioner med et lipidbaseret transfektionsreagens efter producentens anvisninger. Sørg for, at cellekulturerne er ca. 70% sammenflydende. Brug lignende mængder DNA til alle transfektionskombinationer, som beskrevet nedenfor, ved at tilføje de relevante DNA'er. Udfør transfektionseksperimenter i replikater.
    1. Bland 200 ng DNA og 1,25 μL transfektionsreagens i 100 μL af kulturmediet. Tilsæt transfektionsblandingen til cellerne. Cellerne inkuberes med transfektionsblandingerne i 4 timer ved 37 °C. Udskift derefter mediet med medium indeholdende 10% FBS, og inkuber i yderligere 24 timer, før antibiotika tilsættes til udvælgelse.

3. HuR overekspression

  1. Transfekt pFLAG-HuR og tøm pFLAG til HeLa. Vælg celler ved at øge koncentrationen af geneticin (G418) (1 μg / ml) fra 100 μg / ml til 1000 μg / ml, hvilket genererer stabile cellelinjer.
  2. Bekræft overekspression med kvantitativ PCR ved hjælp af specifikke primere til HuR mRNA, som beskrevet i trin 7.

4. Total RNA-isolering

  1. Brug friskopsamlede celler. Trypsinize 70% sammenflydende cellekulturer (til dette assay blev HeLa-Cre-celler anvendt), som beskrevet i trin 2.2.
  2. Cellepillet opsamles ved centrifugering i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C, og det vaskes med 1x PBS (fosfatbufferet saltvand). gentag centrifugeringen.
  3. Resuspender cellepillen i 1 ml 1x PBS og overfør den til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  4. Centrifuger i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C.
  5. Vej tørcellepillen, og juster mængderne og størrelsen af rørene i overensstemmelse hermed. 1 mg celler giver ca. 1 μg total RNA.
  6. I en hætte tilsættes 500-1.000 μL phenol / chloroform til cellepillet (ideelt 750 μL pr. 0,25 g celler) og homogeniseres ved at pipettere op og ned og blande med hvirvelen.
  7. Blandingen inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (20 °C til 25 °C) for at muliggøre fuldstændig dissociation af nukleoproteinkomplekser.
  8. Prøven centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  9. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes 200 μL chloroform pr. 1 ml anvendt phenol:chloroform. Prøverørene lukkes forsvarligt.
  10. Bland kraftigt i 15 s (i hånden eller kortvarigt hvirvel ved en lavere hastighed) og inkuberes ved stuetemperatur (20 ° C til 25 ° C) i 2 minutter til 3 minutter.
  11. Prøverne centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  12. Kontroller for tilstedeværelsen af en nedre rød phenol-chloroformfase, en mellemfase og en farveløs øvre vandig fase. RNA forbliver i den øvre vandige fase. I en hætte opsamles den vandige fase, undgå at kontakte mellemfasen og overføres til et nyt rør.
  13. Bundfælde RNA ved at blande den vandige fase med 400 μL isopropanol af molekylær kvalitet (1: 1 forhold til anvendt phenol / chloroform) og 2 μL glykogen i hvert rør (det vil hjælpe med at visualisere tilstedeværelsen af pelleten).
  14. Bland kraftigt i hånden eller homogeniser med spidsen i ~ 10 s. Inkuberes i 15 minutter eller natten over ved -20 °C.
  15. Prøven centrifugeres ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres.
  16. Rna-pelleten vaskes ved tilsætning af 3 volumener 100% ethanol (ca. 1 ml, fortyndet med DEPC-vand) og blandes prøven ved hvirvel, indtil pelleten frigives og flyder fra bunden.
  17. Centrifuger ved 7.500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  18. Vask RNA-pelleten 1x ved at tilsætte 1 ml 75% ethanol og bland prøven ved hvirvel, indtil pelleten frigives og flyder fra bunden. Centrifugeringen gentages som beskrevet i trin 4.17.
  19. Udfør yderligere 5 sekunders centrifugeringsspin for at opsamle restvæske fra siden af røret, og fjern eventuel restvæske med en pipette uden at forstyrre pelleten.
  20. Lufttørre RNA-pelleten kortvarigt ved at åbne rørets hætte ved stuetemperatur i 3-5 min og opløs RNA-pelleten i 20-50 μL RNase-frit DEPC-behandlet vand. Inkuber RNA'et i 10 minutter ved 55-60 °C for at lette genoplivning af pelleten.

5. Bestemmelse af total RNA-koncentration og kvalitet

  1. Bestem RNA-koncentrationen ved at måle absorbansen ved 260 nm og 280 nm ved hjælp af et spektrofotometer. Få fuldspektrale data, før du bruger prøverne i downstream-applikationer.
  2. Kontroller RNA-kvaliteten ved at opløse 800-1000 ng på en 1,5% agarosegel ved hjælp af 0,5X TBE-buffer (45 mM Tris-base, 45 mM borsyre, 1 mM EDTA). Total RNA adskilles i to bånd, der henviser til 28S og 18S rRNA'er.
    1. Lav alle reagenser og vask alt udstyr, der bruges til at køre gelen, med DEPC-behandlet vand. DEPC-behandlet vand fremstilles i emhætten ved at tilsætte 1 ml diethylpyrocarbonat til 1000 ml ultrarent vand. Inkuberes i ~ 2 timer ved stuetemperatur eller ved 37 ° C og autoklave. Opbevares ved stuetemperatur i op til 10 måneder.
      BEMÆRK: Elektroforese af pattedyrs samlede RNA'er fører til adskillelse af 28S og 18S rRNA'er i et forhold på ca. 2: 1. Båndene skal være intakte og synlige som to skarpe bånd. Nedbrudt RNA vil resultere i slørede bånd.

6. Omvendt transkription

  1. Indstil den omvendte transkriptionsreaktion ved hjælp af 1 μg total RNA.
  2. Udfør omvendt transkription (RT) ved hjælp af omvendt transkriptaseenzym (se materialetabel) og 50 ng / μL tilfældige dekamerprimere.
    1. Bland RNA, tilfældige primere og 1 mM dNTP-blanding (10 mM) i 10 μL. Inkuber ved 65 ° C i 5 minutter og på is i 1 minut. Tilsæt følgende reagenser: 1x RT buffer, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNase inhibitor og 200 U omvendt transkriptase.
    2. Inkuberes i 10 minutter ved 25 °C og i 1 time ved 50 °C (temperaturerne kan ændre sig, hvis der anvendes forskellige enzymer). Afslut reaktionen ved at inkubere ved 85 °C i 5 min. cDNA'er kan opbevares ved −20 °C.

7. Kvantitativ PCR

  1. For at samle reaktionen i et endeligt volumen på 15 μL blandes 3 μL cDNA (100 ng / μL), 3,2 pmol af hver primer, 6 μL masterblanding indeholdende dNTP'er og enzymet og 2,8 μL ultrarent vand.
    BEMÆRK: Brug primere til endogene konstitutive gener som kontroller (husholdningsgener) for at normalisere ekspressionsniveauer af HuR mRNA og miRNA'er. β-Actin og snRNA U6 (RNU6B) er tilgængelige muligheder for normalisering af henholdsvis mRNA'er og miRNA'er, men andre gener kan også være egnede afhængigt af sagen.
  2. Kvantificer ekspressionsniveauerne ved hjælp af delta-delta Ct (2-ΔΔCt) metoden20.

8. Journalistens analyse

  1. Celler, der anvendes til analysen
    1. Transfekt plasmiderne i HeLa-Cre-celler som følger. Transfekt med pTK-Renilla (40 ng), derefter pRD-miR-17-92, der genererer HeLa-Cre-miR-17-92 og vælger med 1 μg / ml puromycin.
    2. Transfekt HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla med pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR eller pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, separat. Vælg ved hjælp af penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 μg / ml). Disse transfektioner genererer Luc-RAP-1-B og Luc-scrambled.
    3. Transfektér cellerne med pFLAG-HuR eller tom pFLAG (trin 3).
    4. Fortsæt til cellekultur, som beskrevet i trin 2.2., med HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR og HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc indtil ca. 80% af sammenløbet. Inducer med 1 μL doxycyclin (1 μg/ml) i 30 minutter ved 37 °C. Opbevar også alle cellerne uden doxycyclin som kontroller i samme periode.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af doxycyclin afhænger af den valgte cellelinje. Et overskud af doxycyclin kan være giftigt for pattedyrceller.
  2. Selvlysende analyse
    1. For at kvantificere og sammenligne forskellige luminescensintensiteter skal du bruge Dual-luciferase reporter assay kit. Optø luciferaseassayopløsninger og lad dem stå ved stuetemperatur, inden analysen påbegyndes.
    2. Forbered blandingen Stop og Glo (blå hætterør) ved at blande 200 μL af substratet i 10 ml Luciferase Assay Buffer II. Bland LAR II (grønne hætterør) ved at blande 10 ml Luciferase Assay Buffer II i det gule hætteglas med Luciferase Assay Substrate II og ryst godt.
    3. Opløsningerne overføres til 15 ml centrifugerør, der tidligere er identificeret og beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Som et alternativ kan opløsningerne tidligere fremstilles i 1-2 ml alikvoter og fryses ved -80 ° C beskyttet mod lys i aluminiumsfolie.
    4. Udfør luminescensaflæsningerne ved hjælp af et udstyr som Synergy; mål udtrykt luciferase som relative lysenheder (RLU).
    5. Eksportér resultaterne til et regneark for yderligere statistisk analyse.
    6. Udfør normalisering af firefly-luciferase aktivitet ved kontrol Renilla (luciferase / Renilla) og plot det som relative lysenheder (RLU) i en grafik. Gentag dette for grupper med og uden doxycyclin induktion.
    7. Beregn middelværdien og standardfejlen for middelværdien (SEM). Udfør en studerendes t-test eller tovejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post-test for at muliggøre gruppesammenligning. Disse analyser er tilgængelige i en pakke som GraphPad Prism. Forskelle ved p-værdier < 0,05 betragtes som signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vores oprindelige hypotese var, at HuR kunne lette intronisk miRNA-biogenese ved at binde til dets præ-miRNA-sekvens. Forbindelsen mellem HuR-ekspression og miR-17-92 klyngebiogenese kunne således pege på en ny mekanisme, der styrer modningen af disse miRNA'er. Overekspression af HuR ved transfektion af pFLAG-HuR blev bekræftet i tre forskellige cellelinjer: HeLa, BCPAP og HEK-293T (figur 2). Som kontroller blev utransficerede celler og celler transficeret med tomme pFLAG-vektorer anvendt. Det er vigtigt, at vi observerede, at HuR-overekspression i disse celler stimulerer ekspressionen af miR-19a (Supplerende tabel 1-resultater rapporteret i Gatti da Silva et al.9).

For at bekræfte, at de inducerede miRNA'er virkelig var funktionelle, blev der designet et in vitro-reportersystem som beskrevet her. Den kunstige intron i pRD-RIPE adskiller to kodende regioner i eGFP. Denne kassette er under kontrol af et tetracyclin responsivt element (TRE). Ekspressionen af eGFP styres således af tilstedeværelsen af antibiotikumet doxycyclin (DOX) i cellemediet (figur 3).

En in silico-søgning ved hjælp af miRbase og TargetScan afslørede mulige mRNA-mål for miR-19a og miR-19b (komponenter i miR-17-92-klyngen). Som et potentielt mål for begge miRNA'er blev sekvensen 5' TTTGCACA 3', der findes i RAP-IB 3' UTR-regionen, valgt (supplerende tabel 2). RAP-IB er et GTPase-medlem af Ras-associeret proteinfamilie (RAS). De inducerede miRNA'er blev korrekt behandlet og funktionelle i vores assay, da det hybridiserede til målsekvensen klonet ved siden af luciferase (se figur 3, pmiR-GLO-mål). Derfor blokerede det luciferaseoversættelse, hvilket blev afspejlet i reduceret luciferaseaktivitet (figur 3). Som en kontrol for dette assay krypterede vi målsekvensen og erstattede den med 5 'GGGTAAA 3' i Luc-scrambled plasmid (mål- og krypterede sekvenser er understreget i oligossekvenserne i materialetabellen).

Under regelmæssige forhold og uden induktion af pRD-miR-17-92 plasmidet fandt endogen miR-19a og / eller miR-19b målet på pmiR-GLO, hvilket førte til reduceret luciferaseaktivitet (data ikke vist). Efter DOX-tilskud blev der observeret en lille og ikke statistisk signifikant reduktion i luciferaseaktivitet i celler med en krypteret målsekvens. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af målsekvenser for andre miRNA'er i denne sekvens. En stærk reduktion i luciferaseaktivitet blev observeret med RAP-IB 3'UTR ved øget miR-19a og miR-19b ekspression fra pRD-miR-17-92 sammenlignet med HeLa-Cre-celler (se figur 4, sammenlign orange og sorte søjler). Transfektionen af pFLAG-HuR i disse celler ændrede ikke i sig selv luciferaseaktiviteten (se figur 4, sammenlign grå og sorte søjler). Imidlertid reducerede overekspression af HuR kombineret med doxycyclintilskud, stimulerende ekspression af miR-17-92-klyngen, yderligere luciferaseaktivitet (se figur 4, sammenlign grå og røde søjler). Dette indikerer en positiv regulering af HuR over miR-19a og miR-19b kombineret med korrekt behandling og modning af disse miRNA'er, som var i stand til med succes at finde deres mål (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (se figur 4).

Brugen af dette reportersystem bekræftede, at HuR inducerer ekspression og korrekt modning af miR-19a og miR-19 b i HeLa-celler.

Figure 1
Figur 1: En konceptuel oversigt over den protokol, der er beskrevet her. Plasmider indeholdende miRNA, målsekvens, regulatorisk protein og pTK-Renilla blev transficeret i dyrkede celler. Efter antibiotisk udvælgelse blev disse celler anvendt til inducering af miRNA-ekspression (med doxycyclin) med efterfølgende kvantificering af luciferaseaktivitet og til RNA-analyse for at bekræfte HuR-overekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Bekræftelse af FLAG-HuR-overekspression i (A) HeLa-, (B) BCPAP- og (C) HEK293T-celler med qPCR. Transfektion med tom pFLAG blev brugt som kontrol (hvide bjælker). β-actin blev brugt til at normalisere Ct-værdier. Y-aksen repræsenterer foldændringen af udtryk beregnet efter normalisering. Fejllinjerne repræsenterer standardfejl beregnet ud fra tre uafhængige målinger. **P <0,005, ****P < 0,0005 (figur tilpasset fra Gatti da Silva et al.9). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Intronic miRNA reporter system. (A) Skematisk repræsentation af pRD-RIPE plasmid, der genererede pRD-miR-17-92. pre-miR-17-92 blev indsat inde i intronen og var under kontrol af en dox-inducerbar promotor; til højre pmiR-GLO-plasmidet med RAP-IB 3'UTR-målsekvens (pmiRGLO-RAP-IB); kontrollen havde den krypterede målsekvens (pmiRGLO-scrambled). (B) Detaljer om sekvensen af pmiRGLO-RAP-IB med fokus på målsekvensen, der supplerer miR-19a og miR-19b. Luciferaseaktivitet reduceres ved interaktionen mellem miRNA og målet (figur tilpasset fra Gatti da Silva et al.9). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: HeLa-Cre-celler blev co-transficeret med reporterplasmider pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 og pFLAG-HuR. Luciferaseaktivitet på utransficerede HeLa-Cre-celler (sort), HeLa-Cre miR-17-92-krypteret (hvid), HeLa-Cre-HuR (grå), HeLa-Cre miR-17-92-luc (orange) og HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rød). Luciferaseaktivitet blev kvantificeret som beskrevet i protokollen som den relative aktivitet af firefly luciferase til Renilla luciferase (observeret med pTK-Renilla) og normaliseret efter doxycyclintilsætning. Det vises som "relative lysenheder" (RLU) på y-aksen. **P < 0,005; P < 0,0005 (figur tilpasset fra Gatti da Silva et al.9). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Rå Ct-værdier observeret for qPCR for at analysere miR-19-ekspression. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: RAP-IB 3'UTR-sekvens og miR-19 målsekvens. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Præ-mRNA-splejsning er en vigtig proces til regulering af genekspression, og dens kontrol kan udløse stærke virkninger på cellefænotypiske modifikationer22,23. Mere end 70% af miRNA'er transskriberes fra introner hos mennesker, og vi antog, at deres behandling og modning kunne lettes ved at splejse regulatoriske proteiner 24,25. Vi udviklede en metode til at analysere intronisk miRNA-behandling og funktion i dyrkede celler. Vores assay bruger fire forskellige plasmider og giver os mulighed for at teste modningen af endogene og eksogene eller inducerede miRNA'er. Metoden beskrevet her kan udføres om 2-3 dage og kræver ikke dyre reagenser.

I betragtning af at HuR er et RNA-bindende protein, der er vigtigt for mRNA-stabilitet og er immunudfældet med miR-18 og miR-19a miRNAAs17, testede dette assay, om det kunne drive intronisk miRNA-biogenese og modning. HuR findes ikke i kernen af splejsesomer, men interagerer med proteiner involveret i mRNA-stabilisering26. Konsekvent har overekspression af HuR været forbundet med udviklingen af æggestok- og blærekræft27,28. I papillære skjoldbruskkirtelcancerceller observerede vi, at HuR øger celleproliferation, migration og invasion9. HuR påvirker også mRNA-stabiliteten af cellecyklusregulatorer såsom PTEN, cyclin A2 og cyclin D2, hvilket øger celleproliferation og migration og fører til tumorigeniske egenskaber29,30. Imidlertid har en væsentlig del af disse mRNA'er også målsekvenser for miR-19a og miR-19b. Især kan HuR binde sig til det introniske område, hvor disse miRNA'er transskriberes, hvilket fører til forestillingen om, at det kan kontrollere splejsning og modning af disse miRNA'er og følgelig forbedre tumorigeniske træk.

For at teste det blev dette assay udviklet med fire forskellige plasmider. Den første indeholder miRNA-klyngen miR-17-92 indsat inde i en intron, og dens ekspression styres ved doxycyclintilsætning. Det andet plasmid er den kommercielle pmiR-GLO, der bærer målsekvensen ved siden af 3' af luc2-genet. Binding af miRNA til denne målsekvens påvirker luc2-ekspression, som kan måles ved et luminescensassay. Det tredje plasmid er pFLAG-HuR, som inducerer overekspressionen af dette regulatoriske protein. Endelig bruges pTK-Renilla også til at inkludere Renilla luciferase fluorescens. Vores resultater viste, at HuR stimulerer miR-17-92 ekspression og øger sammenhængen mellem dets komponenter og målsekvenserne, hvilket resulterer i modne og funktionelle miRNA-molekyler. Vi beskriver sammenhængen mellem HuR og miRNA i et andet papir9. De målsekvenser, der blev anvendt i denne undersøgelse, var specifikke for miR-19a og miR-19b miRNA'er. Denne metode kan dog også tilpasses til brugen af kortere eller længere målsekvenser, herunder flere målsteder. I dette tilfælde skal uspecifik binding af endogene miRNA'er til målsekvensen eller sekvenserne i nærheden overvejes i analysen. De anvendte sekvenser kan have andre mulige målsteder, som kan påvirke luciferaseaktiviteten. Metoden beskrevet her kunne også bruges til at validere forskellige mål for et miRNA eller en gruppe miRNA'er transskriberet sammen, hvilket muliggør funktionelle undersøgelser af miRNA'er og deres specifikke fænotypiske ændringer. Det skal også bemærkes, at det gør det muligt at sammenligne resultaterne mellem forskellige cellelinjer og genetiske baggrunde.

De mest kritiske trin for den bredere anvendelse af denne protokol i pattedyrceller er effektiviteten af transfektions- og induktionstrinnene. Da forskellige plasmider transficeret i cellerne, er tilstrækkelig kontrol også kritisk. Disse parametre ændres med størrelsen af plasmiderne og påvirkes af den omfattende tid i cellekultur. Derfor er et vigtigt punkt, der skal overvejes, inden analysen påbegyndes, den lette transfektion af de valgte celler. Derudover kan den omfattende anvendelse af forskellige antibiotika til at vælge for de forskellige plasmider (gentamicin, puromycin og doxycyclin) og aktivere ekspressionen være skadelig for celler og reducere effektiviteten af følgende eksperimenter. Det er vigtigt, at dette assay først optimeres med celler med kendt transfektionseffektivitet.

Reporteren viste med succes, at øget HuR-ekspression kunne inducere miRNA-biogenese og bekræftede dets funktionelle modning. Det er vigtigt, at overekspression af HuR ikke påvirkede mængden af produceret intron, da vi ikke observerede reduceret luciferaseaktivitet i denne tilstand (figur 4). Yderligere eksperimenter kan udføres for at karakterisere RBP'er og miRNA'er ved hjælp af dette reportersystem. For eksempel ville det være vigtigt at skabe enkeltmutationer i miRNA-sekvenser eller i deres flankerende regioner og analysere virkningen af regulatoriske proteiner i miRNA-biogenese. Dette ville muliggøre den specifikke karakterisering af biogenesen af individuelle miRNA'er og kunne også forbedre viden om konserverede sekvenser til miRNA-behandling og modning.

Vi mener, at dette er et vigtigt metodologisk bidrag til studiet af miRNA-biogenese og modning og rollen som splejsning af regulatoriske proteiner i disse processer. Det kan også anvendes til undersøgelser af regulering og kontrol af mRNA'er og miRNA'er i forskellige typer celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) for HeLa-Cre-cellerne og pRD-RIPE og pCAGGS-Cre plasmider. Vi takker Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes og Anselmo Moriscot for deres støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Tags

Kræftforskning nummer 184
En reporterassay for at analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter