Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microglia, as células imunes inatas residentes no cérebro, são os respondentes primários para inflamação ou lesão no sistema nervoso central (SNC). A microglia pode ser dividida em estado de repouso e estado ativado e pode mudar rapidamente o estado em resposta ao microambiente do cérebro. A microglia será ativada em diferentes condições patológicas e apresentará diferentes fenótipos. Além disso, existem muitos subgrupos diferentes de microglia ativada e grande heterogeneidade entre diferentes subgrupos. A heterogeneidade depende principalmente da especificidade molecular da microglia. Estudos revelaram que a microglia será ativada e desempenhará um papel importante no processo patológico da desmielinização inflamatória. Para entender melhor as características da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias, como esclerose múltipla e distúrbio do espectro neuromielite optica, propomos um protocolo de triagem microglial primária perilesional. Este protocolo utiliza a triagem celular ativada por colunaar (MACS) para obter microglia primária altamente purificada e preservar as características moleculares da microglia para investigar os efeitos potenciais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias.
Introdução
A microglia é originária de progenitores de gema-sac, que atingem o cérebro embrionário muito cedo e participam do desenvolvimento do CNS 1,2. Por exemplo, eles estão envolvidos na poda sináptica3 e na regulação do crescimento axonal4. Eles secretam fatores que promovem a sobrevivência neuronal e ajudam a localização neuronal5. Ao mesmo tempo, eles estão envolvidos na remoção de células anormais e células apoptóticas para garantir o desenvolvimento cerebral normal6. Além disso, como as células ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China.
1. Materiais
- Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo.
- Prepare o tampão de carga adicionando soro bovino fetal (FBS, 2%) à solução salina tamponada de fosfato (PBS).
- Adicione corante vermelho neutro (NR) (1%) final ao PBS.
- Prepare as seguintes soluções utilizando o Kit de Dissociação cerebral Adulta disponível comercialmente (veja a Tabela de Materiais).
- Para preparar a....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Microglia isolada usando contas CD11b têm alta pureza
As células microgliais ao redor das lesões em modelos de camundongos desmielinização foram isoladas usando o protocolo acima mencionado e testadas por citometria de fluxo. As células são rotuladas fluorescentemente com isothiocyanato cd11b-fluoresceína (FITC) e CD45-alophycocyanin (APC) para determinar microglia na citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Existem várias literaturas demonstrando que os anticorpos CD11b e CD45 s.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo propõe um método para isolar a microglia em torno das lesões desmielinizantes, que podem ajudar a estudar as características funcionais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias. Microglia capturadas usando contas CD11b exibem alta pureza e viabilidade. As etapas críticas do protocolo incluem a localização precisa de focos e a purificação microglial ideal. No protocolo passo 2.1, é necessário injetar a solução NR 2 h antes de sacrificar o mouse para garantir que as lesões possam ser exibidas com .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado pela Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de Micro Centrífuga de 1,5 mL | BIOFIL | CFT001015 | |
| Tubos de Centrífuga de 15 mL | BIOFIL | CFT011150 | |
| Tubos de Centrífuga de 50 mL | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µ m Filtro | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Kit de Dissociação do Cérebro Adulto, camundongo e rato | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Camundongos | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Grânulos, humanos e camundongos | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Soro Fetal Bovino | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separador | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Colunas MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Vermelho Neutro | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Citômetro de Fluxo | Agilent | Um sistema que consiste de várias peças | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Estereomicroscópio | MshOt | MZ62 |
Referências
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
