O manuscrito apresenta protocolos de espectrometria de massas versáteis, robustos e sensíveis para identificar e quantificar várias classes de lipídios de fotorreceptores de Drosophila .
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Artigo de método
O manuscrito apresenta protocolos de espectrometria de massas versáteis, robustos e sensíveis para identificar e quantificar várias classes de lipídios de fotorreceptores de Drosophila .
A ativação da fosfolipase Cβ (PLCβ) é uma etapa essencial durante a transdução sensorial em fotorreceptores de Drosophila . A atividade do PLCβ resulta na hidrólise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato lipídico da membrana [PI(4,5)P2] levando, em última análise, à ativação do potencial receptor transitório (TRP) e canais semelhantes a TRP (TRPL). A atividade do PLCβ também leva subsequentemente à geração de muitas espécies lipídicas, várias das quais foram propostas para desempenhar um papel na ativação do TRP e do TRPL. Além disso, várias classes de lipídios foram propostas para desempenhar papéis importantes na organização da biologia celular dos fotorreceptores para otimizar as reações de sinalização para uma transdução sensorial ideal. Historicamente, essas descobertas foram impulsionadas pela capacidade de isolar mutantes de Drosophila para enzimas que controlam os níveis de lipídios específicos e realizam análises da fisiologia dos fotorreceptores nesses mutantes. Mais recentemente, poderosos métodos de espectrometria de massa para isolamento e análise quantitativa de lipídios com alta sensibilidade e especificidade foram desenvolvidos. Estes são particularmente adequados para uso em Drosophila , onde a análise lipídica agora é possível a partir de fotorreceptores sem a necessidade de marcação de radionuclídeos. Neste artigo, são abordadas as considerações conceituais e práticas no uso da espectrometria de massa lipídica para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa de vários lipídios de sinalização em fotorreceptores de Drosophila . Juntamente com os métodos existentes em genética molecular e análise fisiológica, esse lipídio provavelmente aumentará o poder dos fotorreceptores como um sistema modelo para descobertas em biologia.
A fototransdução em Drosophila é mediada por uma cascata de PLCβ acoplada à proteína G que leva à ativação dos canais ativados por luz TRP e TRPL1. O PLCβ hidrolisa o fosfolipídio ligado à membrana, fosfatidilinositol 4,5 bifosfato [PI (4,5) P2] e gera diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5 trifosfato (IP3). O DAG é então fosforilado pela DAG-quinase para gerar ácido fosfatídico (PA). Posteriormente, por meio de uma série de reações que envolvem a geração de intermediários lipídicos, o PI(4,5)P2 é regenerado2. Vários componentes deste ciclo PI(4,5....
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1. Criação de moscas e preparação de produtos químicos
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Determinação da linearidade da medição em MS. A linearidade é a capacidade do método MS de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito lipídico. A linearidade depende de (a) eficiência de ionização do analito lipídico e (b) comportamento de ionização do analito lipídico em diferentes concentrações depende da fonte de íons utilizada. Na ionização por eletrospray (ESI) usada neste estudo, a linearidade se mantém em concentrações mais baixas, dependendo (a) do transporte de íons .......
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Várias linhas de evidência convergem para múltiplos papéis de lipídios sinalizadores na regulação da organização e função dos fotorreceptores de Drosophila. Além do papel bem estudado dos lipídios na regulação da fototransdução3, os lipídios sinalizadores também têm sido implicados no tráfego de proteínas e na organização subcelular 23,30,39,40,41.
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Os autores não têm nada a divulgar.
O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado pelo Departamento de Energia Atômica, Governo da Índia (Identificação do Projeto No. RTI 4006), o Departamento de Biotecnologia do Governo da Índia (BT / PR4833 / MED / 30/744/2012) e uma bolsa sênior da India Alliance (IA / S / 14/2/501540) para PR. Agradecemos ao NCBS Mass Spectrometry Facility, especialmente ao Dr. Dhananjay Shinde e aos membros do laboratório de relações públicas por suas contribuições para o desenvolvimento desses métodos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,1 N metanólico HCL | Para isolamento lipídico total | ||
| 0,88% KCl | Sigma Aldrich | P9541 | Para isolamento lipídico total |
| 1,5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tubos | Eppendorf,022431081 | /022431102 | Para isolamento lipídico total |
| 2.3.18 16:0/18:1 Diether PE | Avanti lipídios polares | 999974 | Padrão interno de lipídios |
| 37% HCl puro | Sigma Aldrich | 320331 | Para isolamento lipídico total |
| Placa | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Acetona | Fisher Scientific | 32005 | Para dissecações |
| Molibdato | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Ácido | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Sonicador | de banho | ||
| Coluna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm] | Waters India Pvt. Ltd. | 186002352 | LC |
| Suporte de lâmina | Fine Scientific Tools | 10052-11 | Para dissecações |
| Incubadora | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Lâminas quebráveis | Fine Scientific | 10050-00 | Para dissecações |
| Papel | manteiga GE healthcare | 10347671 | Para dissecações |
| C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] coluna | Waters India Pvt. Ltd. | ||
| vidro de cor âmbar de cromatografia LC 186004623 com inserções | Merck | 27083-U | |
| d18: 1 / 17: 0) | Lipídios polares Avanti | 860517 | Padrão interno lipídico |
| d5-Fosfatidilinositol 3,5-bifosfato [PI (3,5) P < sub>2 < / sub>] -16: 0 / 16: 0 Avanti | lipídios polares | 850172 | de padrão interno lipídico |
| Olympus | SZ51 | Para dissecações | |
| Banho de calor seco. | |||
| Eluente A | Hexano:Álcool isopropílico:100 mM acetato de amônio aquoso (68:30:2) , para LC | ||
| Eluente B | Hexano:Álcool isopropílico:100 mM acetato de amônio aquoso (70:20:10), para LC | ||
| Papel de filtro | Indica-HM2 | 74039 | Para dissecações |
| Frascos | Borosil | Para dissecações | |
| Moscas | NA | Laboratório NA | Raghu Padinjat |
| Comida para moscas | Na | NA | Cozinha do laboratório NCBS, composição: farinha de milho 80 g/L, D-glicose 20 g/L, sacarose 40 g/L, ágar 8 g/L, extrato de levedura 15 g/L, ácido propiônico 4 mL, TEGO (metil para hidroxibenzoato) 0,7 g/L, ácido ortofosfórico 0,6 mL) |
| Fórceps | Fine Scientific Tools | 11254-20 | Para dissecações |
| Funil | |||
| Borosil | Para dissecações | ||
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A35-500 | Para derivatização |
| Frascos de vidro: cor transparente e âmbar | Para isolamento total de lipídios | ||
| Tubos de vidro sem fosfato resistentes a altas temperaturas. | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Tubos de homogeneização com grânulos | Para isolamento lipídico total | ||
| Instrumento homogeneizador | Precellys | ||
| CO2 umidificado conectado a almofadas de | Para empurrar mosca | ||
| Incubadoras controladas por iluminação | Panasonic Sanyo | MIR-553 | Para mosca criação |
| Mistura | metanol: clorofórmio (2:1), Para isolamento lipídico total | ||
| Clorofórmio Sigma | Aldrich | 650498 | Para isolamento lipídico total |
| Grau LC-MS Metanol | Sigma Aldrich | 34860 | Para isolamento lipídico total |
| Água grau LC-MS | Sigma Aldrich | 34877 | Para isolamento lipídico total |
| Luz medidor | de instrumentos HTC | LX-103 | |
| Pontas de baixa retenção | Eppendorf | 0030072006/72014/72022/72030 | Para isolamento lipídico total |
| LTQ Orbitrap XL instrumento | Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha | ||
| Ácido lisofosfatídico (LPA)- 13:0 | Lipídios polares | Avanti LM-1700 | Lipídio Padrão Interno |
| Ácido lisofosfatídico (LPA)- 17:1 | Lipídios polares | Avanti LM 1701 | Padrão Interno Lipídico |
| Lisofosfatidilcolina (LPC) -13:0 | Lipídios polares Avanti | LM-1600 | Padrão Interno Lipídico |
| Lisofosfatidilcolina (LPC) -17:1 | Lipídios polares Avanti | 855677 | Padrão Interno Lipídico |
| Lisofosfatidilcolina (LPC)- 19:0 | Lipídios polares Avanti | 855776 | Padrão |
| ácido perclórico | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Fosfato di-hidrogenofosfato | Ensaio de fosfato orgânico total | ||
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | NA | NA | Composição: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, e 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 |
| Ácido fosfatídico (PA)- 12:0/13:0 | Lipídios polares Avanti, | LM-1400 | Lipídio Padrão Interno |
| Ácido fosfatídico (PA)- 17:0/14:1 | Lipídios polares | Avanti LM-1404 | Lipídio Padrão Interno |
| Ácido fosfatídico (PA)-(17:0/17:0) | Lipídios polares | Avanti 830856 | Lipídio Padrão Interno |
| Ácido fosfatídico (PA)-16:0-D31/18:1 | Lipídios polares Avanti | 860453 | Padrão Interno Lipídico |
| Fosfatidilcolina (PC) -12:0/13:0 | Lipídios polares Avanti | LM-1000 | Padrão Interno de Lipídios |
| Fosfatidilcolina (PC) - 17:0/14:1 | Lipídios polares Avanti | LM-1004 | Padrão Interno de Lipídios |
| Fosfatidiletanolamina (PE) - 17:0/14:1 | Lipídios polares Avanti | LM-110 | Padrão Interno de Lipídios |
| Fosfatidilinositol (PI) - 17:0/14:1 | Lipídios polares Avanti | LM-1504 | Padrão Interno de Lipídios |
| Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4 | Lipídios polares Avanti | LM-1904 | Lipídio Padrão Interno |
| Fosfatidilinositol 4-fosfato (PI4P) - 17:0/20:4 | Lipídios polares Avanti | LM-1901 | Padrão Interno Lipídico |
| Fonte robótica de íons de nanofluxo | TriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, EUA) | ||
| Rotospin instrumento | Tarsons | 3090X | |
| Almofadas de | Para dissecações | ||
| solvente A | 0,1% ácido fórmico em água, para | ||
| solvente LC B | 0,1% ácido fórmico em acetonitrila, para LC | ||
| Centrífuga | |||
| Termo-misturador | |||
| TMS-diazometano | Acros | AC385330050 | para derivatização |
| Espectrômetro de massa quadrupolo triplo | AB Sciex | QTRAP 6500 | |
| Sistema UPLC | Waters Acquity | ||
| Concentrador centrífugo a vácuo | Scanvac, | ||
| Vortex |
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