Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

Resumo

Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.

Resumo

A microscopia crio-elétron (crio-EM) foi estabelecida como um método rotineiro para a determinação da estrutura proteica durante a última década, tomando uma parcela cada vez maior dos dados estruturais publicados. Os recentes avanços na tecnologia e automação TEM aumentaram tanto a velocidade de coleta de dados quanto a qualidade das imagens adquiridas, ao mesmo tempo em que diminuíram o nível de experiência necessário para a obtenção de mapas crio-EM em resoluções sub-3 Å. Embora a maioria dessas estruturas de alta resolução tenha sido obtida usando sistemas crio-TEM de última geração de 300 kV, estruturas de alta resolução também podem ser obtidas com sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente quando equipadas com um filtro de energia. Além disso, a automação de alinhamentos de microscópios e coleta de dados com avaliação da qualidade da imagem em tempo real reduz a complexidade do sistema e garante configurações ideais de microscópio, resultando em aumento do rendimento de imagens de alta qualidade e rendimento geral da coleta de dados. Este protocolo demonstra a implementação de recentes avanços tecnológicos e recursos de automação em um microscópio eletrônico criotransiência de 200 kV e mostra como coletar dados para a reconstrução de mapas 3D suficientes para a construção do modelo atômico de Novo . Focamos nas melhores práticas, variáveis críticas e questões comuns que devem ser consideradas para permitir a coleta rotineira de tais conjuntos de dados crio-EM de alta resolução. Particularmente os seguintes tópicos essenciais são revisados em detalhes: i) automação de alinhamentos de microscópio, ii) seleção de áreas adequadas para aquisição de dados, iii) parâmetros ópticos ideais para coleta de dados de alta qualidade, coleta de dados de alto rendimento, iv) ajuste de filtro de energia para imagem de perda zero e v) gerenciamento de dados e avaliação da qualidade. A aplicação das melhores práticas e melhoria da resolução alcançável usando um filtro de energia será demonstrada no exemplo da apo-ferritin que foi reconstruída a 1,6 Å, e thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstruída à resolução 2.1-Å usando um TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto.

Introdução

A determinação da estrutura proteica é fundamental para entender a arquitetura molecular, a função e a regulação dos complexos proteicos envolvidos nos principais processos celulares, como metabolismo celular, transdução de sinais ou interações hospedeiro-patógeno. A microscopia crio-elétron (crio-EM) emergiu como uma técnica poderosa capaz de resolver a estrutura 3D de muitas proteínas e seus complexos que eram muito desafiadores para as técnicas estruturais tradicionais, como difração de raios-X e espectroscopia de NMR. Particularmente, a crio-EM tem sido comprovada como o método de escolha para proteínas de membrana, que não podem ser prontamente cristalizadas ou preparadas em quantidades suficientes para as técnicas estruturais tradicionais, e forneceu novas percepções sobre a estrutura e função de importantes receptores celulares e canais de íons 1,2,3,4,5 . Mais recentemente, a crio-EM desempenhou um papel importante no combate à pandemia Covid-19, determinando o mecanismo da infecção pelo SARS-CoV-2 no nível molecular, que elucidou as origens da doença de Covid-19 e forneceu a base para o rápido desenvolvimento de vacinas eficientes e terapêuticas 6,7,8,9,10.

Normalmente, microscópios eletrônicos de transmissão de 300 kV high-end (TEM) são usados para determinação de estrutura de alta resolução de biomoléculas por análise de partículas únicas crio-EM (SPA) para revelar sua conformação e interações. Recentemente, a técnica SPA atingiu uma nova fronteira quando a amostra de referência comum crio-EM apo-ferritin foi reconstruída em resolução atômica (1.2 Å)^11,12 usando um TEM de 300 kV equipado com a pistola de emissão de campo frio (E-CFEG), um detector de elétrons direto e um filtro de energia. Nesta resolução, foi possível resolver inequivocamente posições de átomos individuais na estrutura, conformação de cadeias laterais de aminoácidos individuais, bem como ligação de hidrogênio e outras interações, que abrem novas possibilidades para a descoberta de medicamentos baseado em estrutura de novos alvos e otimização de candidatos a medicamentos existentes.

Microscópios TEM de médio alcance de 200 kV são frequentemente usados para triagem de amostras e otimização de amostras antes da coleta final de dados de alta resolução usando os microscópios TEM high-end, particularmente em instalações maiores crio-EM. Normalmente, amostras de imagem podem ser resolvidas na faixa de resolução de 3-4 Å que é suficiente para mover-se para um TEM de 300 kV high-end para coleta final de dados. Consequentemente, a coleta de dados usando o TEM de 200 kV muitas vezes não é mais otimizada para os resultados de resolução mais altos possíveis. Além disso, muitas questões biológicas interessantes já podem ser respondidas e publicadas nessas resoluções, pois todas as cadeias laterais de aminoácidos já estão resolvidas, e a ocupação de locais de ligação de ligantes também pode ser determinada de forma confiável¹³. Já foi demonstrado que tems de 200 kV podem alcançar resoluções além de 3 Å para inúmeras amostras 14,15,16,17,18. Imagens tiradas a 200 kV exibem contraste inerentemente maior de partículas de imagem, o que pode até facilitar um alinhamento inicial mais preciso das partículas, apesar do sinal mais atenuado em alta resolução em comparação com as imagens TEM de 300 kV. É importante notar que a resolução alcançada de mapas crio-EM reconstruídos também é limitada pela flexibilidade estrutural e heterogeneidade conformacional das amostras imagens, o que impacta tanto as reconstruções de 200 kV quanto de 300 kV. Na verdade, muito mais reconstruções crio-EM obtidas usando os sistemas de 300 kV foram resolvidas na faixa de resolução 3-4 Å do que em resoluções mais altas¹⁹. Como os microscópios TEM de 200 kV são menos complexos e se encaixam em salas menores, esses microscópios representam uma boa opção de menor custo para a determinação da estrutura de macromoléculas biológicas por crio-EM, preservando a automação de coleções de dados longas de várias amostras armazenadas dentro do sistema de microscópio Autoloader.

A coleta de conjuntos de dados crio-EM para determinação da estrutura de alta resolução requer um alinhamento preciso da óptica do microscópio. Os alinhamentos das colunas prosseguem sistematicamente da fonte eletrônica até o sistema de lentes condensadoras, a lente objetiva e o filtro de energia com um detector de elétrons. A sequência completa de alinhamentos normalmente não é necessária. Quando necessário, o usuário é guiado por procedimentos semi-automatizados com uma descrição adequada de cada etapa em uma janela de ajuda consciente do contexto durante todo o procedimento de alinhamento na interface do usuário do microscópio (painel de controle de Alinhamentos Diretos). Uma vez que o microscópio está totalmente alinhado, a óptica eletrônica permanece estável, e os alinhamentos não precisam ser alterados por pelo menos alguns meses. Apenas os alinhamentos mais sensíveis, como a iluminação paralela do plano amostral, o astigmatismo objetivo e o alinhamento sem coma, devem ser refinados pouco antes de iniciar a coleta de cada conjunto de dados. A qualidade dos dados coletados pode então ser monitorada durante a coleta de dados usando diferentes pacotes de software, como EPU Quality Monitor, crioSPARC Live²⁰, Relion²¹, Scipion²², WARP²³ ou Appion²⁴.

Além de alinhamentos precisos do microscópio, a alta qualidade de amostras bem purificadas com heterogeneidade conformacional e composicional mínima também é um pré-requisito para a coleta de conjuntos de dados de alta resolução e resolução de estruturas de alta resolução. Mais detalhes sobre protocolos típicos, desafios frequentes e possíveis remédios podem ser encontrados em outras revisões dedicadas a este tópico 25,26,27. Essencialmente, é fundamental encontrar áreas em uma determinada grade crio-EM que tenha gelo suficientemente fino para preservar informações de alta resolução, e partículas individuais são densamente distribuídas em orientações aleatórias sem sobreposições. No entanto, as grades crio-EM típicas têm espessura de gelo não uniforme e, portanto, é importante encontrar e selecionar as áreas ideais para imagens. Diferentes meios para estimativa de espessura de gelo na rede estão disponíveis em pacotes de software dedicados à coleta automatizada de conjuntos de dados crio-EM, como EPU 2, Leginon²⁸ ou SerialEM²⁹.

O advento de detectores de elétrons diretos rápidos e sensíveis possibilitou a coleta de imagens em muitas frações como filmes que permitiram a compensação dos movimentos induzidos pelo feixe e resultaram em um aumento substancial na qualidade e quantidade de dados usados no processamento de imagens e na reconstrução 3D final³⁰. Ao mesmo tempo, a automação e a coleta de dados de alto rendimento fornecem enormes conjuntos de dados com milhares de imagens/filmes que representam desafios para armazenamento e acesso de dados. O modelo adotado com grandes instalações crio-EM que atendem dezenas a centenas de usuários, especialmente solicita o gerenciamento de dados organizado com rastreamento adequado e compartilhamento de dados em dutos crio-EM estabelecidos^31,32.

Este estudo descreve um protocolo para coleta de rotina de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando o microscópio DE 200 kV Glacios TEM. Os alinhamentos necessários da óptica do microscópio são descritos juntamente com procedimentos para avaliação de amostras crio-EM e seleção de áreas adequadas para coleta de dados de alta resolução. A organização de dados coletados e metadados relacionados com informações amostrais é demonstrada na Athena - uma plataforma de gerenciamento de dados que facilita a revisão das informações amostrais e dados coletados. Usando a amostra de apo-ferritina do mouse, foi possível alcançar uma reconstrução 3D a 1,6 Å resolução¹³. Usando o protocolo descrito, também reconstruímos o mapa de densidade 3D do proteasome 20S a partir de Thermoplasma acidophilum com resolução de 2,1 Å.

Protocolo

Todas as etapas do protocolo são descritas para o sistema Glacios TEM de 200 kV (referido a partir de agora como 200 kV TEM) equipado com o filtro de energia Selectris-X (referido doravante como filtro de energia) e o detector Falcon 4 (referido a partir de agora como detector de elétrons direto). As etapas do protocolo são específicas para o aplicativo EPU, que é o software padrão de coleta de dados SPA pré-instalado em cada sistema Glacios. As etapas do protocolo abaixo correspondem à versão 2.14 do EPU e pequenas modificações são esperadas ao usar uma versão EPU diferente. Os pré-requisitos para este protocolo são: i) os alinhamentos de armas e colunas estão bem alinhados, ii) as calibrações EM estão corretas e iii) as funções automáticas EPU estão corretamente calibradas.

1. Carregar grades no microscópio

NOTA: O TEM de 200 kV usado neste experimento pode conter até 12 autogrids (ou seja, grades TEM convencionais cortadas em um cartucho especial) dentro de um que é carregado dentro do Autocarregador do microscópio e constantemente mantido em temperaturas abaixo de -170 °C para evitar a desvitarificação da amostra.

1. Insira autogrids no Autoloader em condições de nitrogênio líquido.
2. Insira o com autogrids em uma cápsula de transferência resfriada com nitrogênio líquido.
3. Insira a cápsula no microscópio e clique no botão Dock na interface do microscópio UI para carregar o da cápsula no Autocarregador do microscópio.
4. Clique no botão Inventário para verificar a presença de autogrids no carregado.
5. Clique nos botões Carregar e Descarregar para inserir autogrids na coluna para imagens TEM.

2. Definir um projeto em uma plataforma de gerenciamento de dados (Opcional)

NOTA: As informações de amostra e os dados coletados podem ser organizados na plataforma de gerenciamento de dados fornecida que permite o armazenamento de dados estruturados para todos os instrumentos conectados. Um projeto pode ser criado para o qual quaisquer etapas de fluxo de trabalho podem ser definidas para capturar as imagens e metadados de forma organizada para revisão e exportação.

1. Inicie o aplicativo do portal de gerenciamento de dados e faça login com um nome de usuário e senha.
2. No painel esquerdo da interface do portal UI, clique no botão Adicionar projeto para criar um novo projeto ou clique em um botão de um projeto existente na lista abaixo para abrir um projeto.
3. Clique no botão Adicionar experimento para criar um novo experimento dentro do projeto aberto.
4. Preencha a descrição no painel Metadados do novo experimento e clique no botão Adicionar fluxo de trabalho para criar um novo fluxo de trabalho dentro do experimento (por exemplo, Análise de Partículas Únicas).
5. Opcionalmente, clique no botão Adicionar passo no painel do meio para criar um fluxo de trabalho personalizado ou adicionar etapas adicionais ao fluxo de trabalho SPA predefinido (Figura 1 e Figura 2).
   NOTA: As etapas podem representar preparação da amostra, caracterização da amostra por técnicas de bioquímica, vitrificação de amostras, triagem de grades crio-EM, sessões de coleta de dados e análise de dados.
6. Opcionalmente, preencha as descrições nas Notas de cada etapa, que podem incluir imagens e fotos.
7. Crie uma etapa de conjunto de dados no fluxo de trabalho e selecione o tipo de conjunto de dados como EPU.
   NOTA: Isso permitirá que o software de análise coloque todos os dados/metadados de resultados no lugar correto no portal de gerenciamento de dados automaticamente durante a aquisição de dados e exporte os dados automaticamente para o destino preferido, mantendo um registro completo de todas as etapas e transferência de dados.
8. Preencha os modelos sobre as grades Sample e EM na etapa de Bioquímica e associe cada grade a uma amostra (observe que uma amostra pode estar associada a várias grades).
9. Associe combinações de grades de amostra na seção metadados da etapa Dataset .

3. Configure predefinições de imagem e calibrações de mudança de imagem no software de análise

1. Defina parâmetros de imagem para modos de imagem individuais, conforme mostrado na Tabela 1. Considerações para a seleção de configurações específicas são descritas detalhadamente na seção Discussão.
2. Definir iluminação paralela para a ampliação escolhida no predefinito de Aquisição de Dados do software de análise
   NOTA: Há apenas uma configuração da lente C2 para iluminação paralela da amostra no tamanho spot dado (ou seja, pontos fortes predefinidos da lente C1) em sistemas TEM de 2 condensadores, como o TEM de 200 kV utilizado neste estudo. A taxa de dose de elétrons por área unitária (e^-/Ų/s) só pode ser ajustada alterando as configurações de tamanho SPOT e reajustando a força C2 (intensidade do feixe) de acordo com as etapas abaixo.
   1. Mova-se para uma área com papel alumínio de suporte e fino ou sem gelo.
   2. Selecione a abertura objetiva de 100 μm ou 70 μm no menu abertura da interface do usuário TEM.
   3. Pressione o botão Difração nos painéis de controle para mudar para o modo de difração.
   4. Insira a tela fluorescente e altere o modo FluCam para Alta Resolução.
   5. Mova o ponto de difração central para uma borda da abertura. Se a borda de abertura não estiver visível, aumente o comprimento da câmera (usando o botão de ampliação).
   6. Gire cuidadosamente o botão Focus no painel de controle para colocar o plano back-focal em foco. O plano back-focal é focado quando a borda de abertura é visivelmente afiada.
   7. Reduza a sensibilidade do FluCam para o nível mais baixo e mova o ponto de difração central para o centro da FluCam.
   8. Minimize o tamanho do ponto central usando o botão Intensidade no painel de controle.
   9. Retraia a abertura objetiva na interface do usuário TEM e volte para o modo de imagem.
   10. Clique no botão Obter no software de análise para salvar as configurações da predefinição de Aquisição de Dados.
3. Ajuste a taxa de dose de elétrons no predefinito de Aquisição de Dados que é ideal para o detector usado:
   1. Mova-se para uma área vazia na rede (por exemplo, um quadrado de grade com folha de carbono quebrada)
   2. Clique no botão Medir dose no software de análise para medir a taxa de dose de elétrons.
   3. Altere o tamanho SPOT para alcançar a taxa de dose ideal. No caso do detector de elétrons direto usado neste protocolo, uma taxa de dose de 4-5 e^-/pixel/s é normalmente usada para aquisição de dados de alta resolução. Isso normalmente corresponde ao tamanho SPOT 4-6.
   4. Verifique e ajuste a iluminação paralela na nova configuração de tamanho SPOT, conforme descrito acima.
   5. Selecione a opção EER em Frações para usar o modo EER no detector de elétrons direto³³.
   6. Clique no botão Obter no software de análise para salvar as configurações da predefinição de Aquisição de Dados.
   7. Mude para a predefinição de foco automático e pressione o botão Obter para salvar as configurações de iluminação para o foco. Altere manualmente o tempo de exposição para 1 s e o modo binning 2.
   8. Mude para a predefinição de Anéis Thon e pressione o botão Obter para salvar as configurações de iluminação para esta predefinição. Altere manualmente o tempo de exposição para 1-2 s e o modo binning 2.
   9. Mude para a predefinição de Perda Zero e pressione o botão Obter para salvar as configurações de iluminação para esta predefinição. Altere manualmente o tempo de exposição para 0,5 s e o modo binning 4.
4. Calibrar as mudanças de imagem entre as configurações ópticas definidas como está descrito no manual do software de análise usando a tarefa de calibração de mudança de imagem na guia Preparação (Figura Suplementar 1).

Tabela 1: Configurações típicas de imagem para aquisição de dados de alta resolução usando um crio-TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto. As configurações são mostradas para cada predefinição óptica usada na configuração da coleta automatizada de dados (seção 3 do Protocolo). Essas configurações são específicas para o microscópio TEM de 200 kV e detector de elétrons diretos utilizados neste estudo. Clique aqui para baixar esta Tabela.

4. Mapeamento de grade e seleção das melhores grades crio-EM para coleta de dados

1. Selecione a guia Atlas e clique no botão Nova Sessão para abrir uma nova sessão.
2. Preencha detalhes como nome da sessão e localização de armazenamento de dados e clique no botão Aplicar para abrir uma nova janela de tarefas de triagem , que mostra uma lista de todas as grades do inventário do Autoloader. Opcionalmente, edite os nomes das grades.
3. Selecione as grades de interesse selecionando uma caixa de seleção ao lado do número de grade correspondente.
4. Clique no botão Iniciar para iniciar uma coleção totalmente automatizada de atlas de todas as grades selecionadas.
5. Quando a coleção for concluída, clique em etiquetas de grade para revisar os atlases adquiridos.
   NOTA: Os quadrados de grade individuais são classificados de acordo com sua espessura relativa do gelo, que é baseada na avaliação relativa do valor da escala de cinza em cada atlas. Os quadrados de grade classificados são retratados em diferentes esquemas de cores que podem ser usados para orientar a seleção de áreas de aquisição de dados. Uma grade produzida com um Vitrobot Mk IV normalmente exibirá um gradiente de espessura de gelo sobre toda a grade, o que pode ajudar a identificar a espessura ideal do gelo para coleta de dados. Uma grade ideal deve conter o mínimo possível de contaminação de gelo de transferência e exibir quadrados de grade ininterruptos e livres de crack (Figura 3). Redes com distribuição de gelo adequada podem ser investigadas para avaliar a distribuição de partículas no gelo em alta ampliação (ou seja, densidade e orientações de partículas individuais).
6. Clique no botão Amostra de Carga no menu superior para inserir uma grade escolhida com distribuição de gelo adequada na coluna de microscópio.
7. Selecione a guia Atlas , clique com o botão direito do mouse em um quadrado de grade adequado na imagem do atlas e selecione a opção Mover o estágio Aqui do menu suspenso para mover o palco para o quadrado da grade.
8. Selecione a guia Funções automáticas para definir o quadrado da grade à altura eucêntrica. Mude para a predefinição de altura eucêntrica , clique na função auto-eucêntrica de inclinação de feixe no meio do quadrado da grade escolhida e clique no botão Iniciar .
9. Mude para a predefinição grid square e adquira uma imagem. Mova o palco para um orifício com gelo e sem contaminação mínima por um clique com o botão direito e a opção Mover o Palco Aqui .
10. Mude para a predefinição Hole/Eucentric Height e adquira uma imagem. Mova o palco para uma área de carbono ao lado do buraco de interesse por um clique com o botão direito do mouse e a opção Mover o Estágio Aqui .
11. Clique na função automática AutoFocus e defina valores para o desfoco desejado para 0 μm e Iterate para -2 μm. Mude para a predefinição de foco automático e clique no botão Iniciar .
12. Selecione novamente a guia Preparação e alterne para a predefinição de altura furada/eucêntrica . Na imagem de furo adquirida anteriormente, selecione uma área de interesse dentro do orifício e mova o palco para esta posição clicando com o botão direito do mouse e selecionando a opção Mover estágio aqui .
13. Mude para a predefinição de Aquisição de Dados e ajuste o tempo de espera após o turno do feixe para 0,5 s e o tempo de espera após a mudança do estágio para 20 s. Adquira uma imagem usando desfoco entre -3 μm e -5 μm para aumentar o contraste de baixa resolução para melhor visualização de partículas individuais.
14. Opcionalmente, repita as etapas 4.7-4.13 para partículas de imagem em diferentes buracos e diferentes quadrados de grade com diferentes espessuras de gelo, conforme necessário.
15. Uma vez que a grade mais adequada para coleta de dados de alta resolução seja identificada e selecionada, clique no botão Amostra de carga no menu superior para carregar a grade selecionada no TEM.
    NOTA: Alternativamente, se mais informações forem necessárias e/ou automação desse processo de triagem, realize a seção 5.

5. Configuração de uma sessão de coleta de dados no software de análise de partículas única

NOTA: Se usar as grades de papel alumínio, o refinamento de alinhamentos objetivos de astigmatismo e coma (seção 6) pode não funcionar de forma confiável. É aconselhável carregar uma grade em grade de folha de carbono ou grade EM de grade cruzada e executar esses alinhamentos finais antes de configurar a coleta de dados.

1. Selecione a guia EPU e clique no botão Criação de sessão para criar uma nova sessão no painel esquerdo. Selecione a opção Nova Sessão para usar predefinições ópticas atuais ou a opção Novo de Preferências para carregar a configuração de sessão previamente exportada.
2. Preencha o nome da sessão e o local de armazenamento de dados.
   NOTA: Este local será usado para salvar imagens e metadados integrados da sessão de coleta de dados em uma subpasta com o nome da sessão. Embora esses dados não tomem uma quantidade significativa de espaço de armazenamento, é recomendável salvar esses dados no Falcon descarregar o armazenamento de dados do servidor DMP, pois os quadros de câmera EER são sempre armazenados no diretório raiz deste armazenamento de dados em um diretório com o nome da sessão.
3. Selecione o tipo Manual da sessão para ter controle sobre a seleção de furos individuais em quadrados de grade selecionados para coleta de dados posteriormente no protocolo.
4. Selecione o modo de aquisição mais rápido para usar a mudança de imagem livre de aberração (AFIS) para coleta de dados para reduzir os movimentos de estágio entre os buracos individuais, reduzir a deriva geral da amostra e aumentar o throughput da coleta de dados sem deterioração da qualidade da imagem.
5. Selecione o formato mrc padrão de imagens integradas salvas.
6. Especifique a grade usada e seu tipo. Este protocolo utilizou o R-1.2/1.3 UltraAufoil para apo-ferritin e a grade R-2/1 Quantifoil para o proteasome 20S. Selecione Quantifoil em porta-amostras e R1.2/1.3 ou 2/1 sob tipo quantifoil.
7. OPCIONAL: Clique no botão Athena Login no canto inferior direito para utilizar o EPU Quality Monitor (EQM).
   1. Digite detalhes de login na janela pop-up do navegador para ativar a seção configurações na visão geral da configuração da sessão .
   2. Clique no botão Selecionar na seção Configurações e navegue pelo conjunto de dados criado anteriormente (seção Protocolo 2) para associá-lo à coleta de dados atual. Alterne a caixa de seleção Habilitar monitor de qualidade.
8. Clique no botão Aplicar para criar uma nova sessão.
   NOTA: Esta ação abrirá novas tarefas no menu da coluna esquerda. Em qualquer momento durante a sessão, se alguns detalhes estiverem incorretos, é possível retornar à tarefa de configuração da sessão , alterar/atualizar os detalhes e clicar em Aplicar novamente para atualizar a sessão.
9. Selecione a tarefa Seleção quadrada no painel esquerdo para mostrar o atlas coletado da grade.
10. Opcionalmente, clique duas vezes em qualquer azulejo do atlas para ver uma imagem de maior qualidade para avaliar melhor a qualidade do gelo nos quadrados da grade. Clique duas vezes na imagem para retornar ao atlas da grade.
11. Identificar quadrados de grade com as seguintes características (Figura 4): (i) A folha de suporte no quadrado da grade está intacta sem danos, (ii) gelo fino vitreous em buracos de papel alumínio (os orifícios parecem mais brilhantes que a folha de carbono de suporte), (iii) Como pouca contaminação cristalina de gelo (manchas pretas) no quadrado da grade possível, (iv) Gradiente de brilho mínimo através da grade quadrada e dentro de manchas individuais.
    NOTA: Com as predefinições escolhidas e com uma boa grade, o crio TEM de 200 kV utilizado neste estudo pode imagem a uma taxa de ~200-300 filmes/h. Com isso em mente, selecione quantos quadrados for necessário, ou adicione mais tarde retornando à tarefa de seleção quadrada de acordo com a quantidade de tempo de microscópio disponível. Para referência, 3000 filmes foram coletados para alcançar 1,6 Å resolução de apo-ferritin.
12. Selecione quadrados de grade para coleta de dados, seja em imagens completas do atlas ou de azulejos de alta qualidade
    1. Clique com o botão direito do mouse em um quadrado de grade de interesse e escolha a opção Selecionar no menu de contexto
    2. Alternativamente, segure a tecla Ctrl no teclado e clique à esquerda nos quadrados de grade desejados
    3. Por outro lado, clique à direita e desmarque ou segure a tecla Shift e clique à esquerda para remover quadrados
    NOTA: Os próximos passos são fundamentais para garantir que a coleta de dados resulte em uma reconstrução de alta resolução. Inicie a seleção de orifícios no quadrado da grade com uma fina camada de gelo. Clique com o botão direito do mouse neste quadrado de grade e selecione a opção Selecionar buracos para iniciar a tarefa Seleção de furos .
13. Selecione a tarefa Seleção de furos no painel esquerdo para selecionar furos nos quadrados de grade selecionados.
14. Clique no botão Auto-Eucentric para mover-se automaticamente para o primeiro quadrado de grade selecionado, ajustar a altura eucêntrica e adquirir uma imagem quadrada da grade para encontrar buracos de papel alumínio.
15. Clique no botão Encontrar buracos para encontrar buracos de papel alumínio na imagem.
    NOTA: Se a localização do furo não funcionou bem (ou seja, há furos ignorados ou furos de tamanho incorreto na imagem), verifique se os valores corretos foram inseridos na entrada do Tipo Quantifoil da tarefa de configuração da sessão e encontre furos novamente. Se os furos ainda não forem encontrados corretamente, clique no botão Medir o tamanho do orifício para definir o diâmetro do orifício e a distância manualmente e encontrar furos novamente.
16. Clique no botão Remover buracos perto do botão da barra de grade para desmarcar orifícios perto das barras de grade.
17. Ajuste os limites no histograma de brilho do filtro de gelo (no canto inferior direito da janela de software) para remover todos os orifícios com gelo muito grosso (usando a linha de limite esquerdo) bem como todos os orifícios vazios (usando a linha de limite direito) como mostrado na Figura 4.
    NOTA: Para o refinamento, valores de intensidade específicos também podem ser inseridos nas caixas de texto correspondentes ao lado do botão Aplicar .
18. Opcionalmente, use o Pincel de Seleção para refinar a seleção de orifícios manualmente: Clique esquerdo e arraste o pincel para desmarcar orifícios indesejados. Segure a tecla Ctrl e o clique esquerdo para resemar os orifícios de folha. Segure a tecla Shift e role com a roda do mouse para ajustar o tamanho da escova.
19. Selecione um orifício para definir e testar um modelo de aquisição de dados que será usado repetidamente durante toda a coleta de dados: Clique com o botão direito do mouse em um orifício na imagem quadrada da grade e selecione a opção Mover o palco para o local.
20. Selecione a tarefa Definição de modelo no painel esquerdo.
21. Selecione a predefinição Hole/Eucentric e clique no botão Adquirir para adquirir uma imagem.
22. Clique no botão Encontrar e Centralizar para centralizar um buraco na imagem.
23. Defina valores para atraso após a mudança de imagem para 0,5 s (padrão) e atraso após o turno de estágio para 20 s.
    NOTA: Como o diâmetro do feixe paralelo é fixado no sistema crio-TEM de 200 kV utilizado neste estudo e normalmente corresponde a 1,6-1,7 μm com uma abertura de 50-μm, apenas 1 imagem pode ser adquirida por orifício usando as grades R-1.2/1.3 e 2 imagens por orifício (bordas próximas opostas) usando as grades R-2/1 ou R-2/2. Observe que o tamanho das áreas de aquisição do conjunto na tela não corresponde ao diâmetro real do feixe. A barra de escala de imagem pode ser utilizada para estimar uma distância de colocação adequada.
24. Selecione o botão Adicionar área de aquisição e clique na imagem para selecionar o local no buraco centrado no qual será feita a aquisição de imagens de alta ampliação.
25. Selecione o botão Adicionar área de foco automático e clique na imagem para selecionar o local na folha de suporte ao lado do orifício centrado onde o foco automático da imagem será realizado.
    NOTA: O tamanho do feixe para o foco é de 1,6-1,7 μm e deve ser colocado equidistantly de buracos vizinhos no carbono.
26. Clique na área de aquisição verde para definir uma sequência de valores de desfocado na Lista Defocus na seção superior da janela de software. Insira o desfoco mais alto como primeiro para melhorar a visualização de partículas em um teste da seguinte tarefa de execução de modelo .
27. Clique na área de foco automático azul para definir as configurações específicas do foco automático na mesma área:
    1. Escolha a opção Depois de centralizar para focar automaticamente no início de cada cluster AFIS.
    2. Escolha a opção Lente Objetiva para foco automático mais rápido e redução do drift de estágio.
28. Selecione a tarefa Execução de modelos e clique no botão Executar.
    1. Observe etapas individuais do procedimento de aquisição de dados (centralizar o orifício, foco automático na área selecionada e aquisição de imagens nas áreas definidas) e verifique a qualidade das partículas imagens na imagem final de alta ampliação.
    2. Clique no botão FFT no canto inferior direito da janela de imagem de alta ampliação para verificar a imagem FFT e avaliar visualmente se os anéis Thon mostram múltiplas oscilações e se estendem à alta resolução na imagem FFT.
29. Se a execução do modelo for concluída com sucesso, clique no botão Preparar todos os quadrados na tarefa Seleção de furos para ter a coleta de dados definida automaticamente em todos os outros quadrados de grade selecionados de acordo com as configurações usadas neste primeiro quadrado de grade.

6. Alinhamentos finais de microscópio antes de iniciar a coleta de dados

NOTA: Para alcançar os melhores resultados de alta resolução, os alinhamentos mais sensíveis devem ser feitos exatamente nas mesmas configurações do modo de aquisição de dados no software de coleta de dados e pouco antes de iniciar a aquisição real de dados. Esses alinhamentos devem ser feitos em uma posição com fino carbono de suporte da rede, suficientemente distante de qualquer barra de grade, e alinhados na altura eucêntrica.

1. Selecione a tarefa De execução de modelo , adquira uma nova imagem e mova-se com o palco para uma área limpa em folha de carbono por um clique com o botão direito do mouse e selecione a opção de menu Mover o Palco Aqui.
2. Selecione a guia Funções automáticas e defina o desfoque desejado para 0 μm e Iterado para -2 μm. Mude para a predefinição de foco automático e clique no botão Iniciar para executar a função Foco automático.
3. Coloque a tela fluorescente para baixo e abra o menu de Alinhamentos Diretos na interface do usuário TEM.
4. Para obter melhores resultados, usuários experientes podem verificar alinhamentos de pontos pivôs: Escolha a tarefa nP Beam Tilt pp X no menu Alinhamentos Diretos e sobreponham ao máximo os feixes de salto usando os botões Multifuncional nos painéis de controle. Repita para a tarefa np Beam Tilt pp Y .
5. Clique no botão EF no menu da câmera de tela fluorescente para mostrar um círculo verde que indica a abertura de entrada do filtro de energia e centralizar o feixe sobre o círculo verde.
   NOTA: Certifique-se de que a bomba Turbo está parada antes de continuar; vibrações a partir dele reduzem o número de anéis thon visíveis e frequentemente fazem com que as funções automáticas falhem.
6. Volte para a janela do software e selecione a guia Funções automáticas na barra de menu.
7. Selecione a tarefa Autostigmate , mude para a predefinição do anel de Thon e pressione o botão Iniciar . Observe o processo para ter certeza de que (i) as imagens tiradas estão em carbono, (ii) os anéis Thon são claramente visíveis, e (iii) o ajuste CTF calculado (linhas pontilhadas) estão bem colocados no minima thon-ring (Figura Suplementar 2).
8. Selecione a tarefa Autocoma e pressione o botão Iniciar. Observe o processo para ter certeza de que as imagens tiradas estão em carbono e que os anéis Thon são claramente visíveis e que os ajustes calculados (linhas pontilhadas) estão bem colocados no minima thon-ring. Amplie em cada imagem do anel Thon usando a roda de rolagem do mouse (Figura Suplementar 3).
   NOTA: Se o microscópio estiver equipado com um filtro de energia, a sintonia do filtro de energia deve ser feita como parte da sequência de alinhamento para centralizar a fenda do filtro ao pico de perda zero e corrigir quaisquer distorções no prisma do filtro de energia (passos 6.9-6.14). Esses alinhamentos devem ser feitos em uma área vazia da grade, como dentro de um quadrado de grade quebrado.
9. Abra a Interface do Usuário Sherpa e selecione o aplicativo Filtro de Energia (Figura Complementar 4).
10. Ajuste a câmera para EF-Falcon, bin 4x, tempo de exposição 0.2 s na janela Configurações .
11. Clique no botão Centro na opção Perda Zero para centralizar a fenda do filtro de energia de perda zero.
12. Clique no botão Sintonizar na opção Isochromaticity (Figura Suplementar 4).
13. Clique na Ampliação de Melodia e Distorções de Sintonia na opção de Distorções Geométricas e Cromáticas (Figura Suplementar 5, Figura Suplementar 6)
14. Se os resultados não estiverem dentro das especificações indicadas e mostrados na cor vermelha no relatório de saída, iterar novamente os alinhamentos da etapa 6.11.
    NOTA: Embora a referência direta de ganho do detector de elétrons possa ser estável ao longo dos meses, uma nova referência de ganho deve ser tomada usando o Falcon 4 Reference Image Manager se imagens de áreas vazias não mostrarem intensidade uniforme, mas exibir listras ou outras características distintas. Alternativamente, calcule uma Transformação Fourier Rápida (FFT) de tal imagem e certifique-se de que nenhuma linha seja visível.
15. Na janela de software, selecione a guia Preparação e alterne para a predefinição de aquisição de dados .
16. Defina a configuração da dose para 40 e^-/Ų e clique no botão Medir a Taxa de Dose .
17. Vá para a guia EPU , selecione a tarefa Aquisição Automatizada e verifique opcionalmente a função Perda automática zero ; clique no botão Iniciar Execução para iniciar a coleta de dados totalmente automatizada.

7. Monitoramento e otimização da qualidade dos dados durante a coleta de dados

NOTA: Enquanto a coleta de dados está em andamento, os dados coletados podem ser monitorados usando o EQM através do portal de gerenciamento de dados. A EQM realiza correção de movimento e determinação ctf na hora e exibe os resultados no portal. O usuário é então capaz de julgar a qualidade das aquisições individuais, ver gráficos em vários indicadores de qualidade, filtrar aquisições indesejadas e exportar os dados para seu armazenamento final, seja em tempo real ou como um trabalho em lote.

1. Navegue até o conjunto de dados que o software de análise coloca os dados para usar um navegador da Web.
2. Na visão geral do conjunto de dados, as placas de aquisição exibem as informações sobre correção de movimento e determinação ctf em um formato gráfico. Clique em cartões individuais para obter mais informações.
3. Habilite o painel DataViz para mostrar gráficos agregados do conjunto de dados completo que mostram o desfoco, astigmatismo e faixa de confiança CTF por aquisição (Figura Suplementar 7).
4. Use os filtros na parte superior do painel para selecionar apenas os dados que estão dentro da faixa de desfocus solicitada, tenha astigmatismo próximo de zero e o CTF possa ser determinado até a resolução especificada (target). Uma vez configurados os filtros, pressione o botão Aplicar para exibir apenas os dados escolhidos na janela de visão geral do conjunto de dados.
5. Quando a maioria das imagens adquiridas estiverem dentro dos critérios definidos, deixe que a sessão de coleta de dados continue a ser concluída. Se apenas uma fração muito pequena das imagens adquiridas preencher os critérios definidos, ou reconfigurar as configurações do software de análise, mover-se para outra área na amostra (pressione o botão Next Grid Square no software de análise) ou interromper a coleta de dados.

Resultados

O portal de gerenciamento de dados fornece armazenamento eficiente e estruturado de imagens coletadas, dados e metadados de vários fluxos de trabalho experimentais em uma única plataforma de software. Cada experimento definido em um projeto criado consiste em um fluxo de trabalho com etapas definidas pelo cliente para capturar informações amostrais, dados coletados e metadados relacionados sem quaisquer restrições para fornecer flexibilidade máxima e usabilidade para quaisquer experimentos possíveis e todos os casos de uso (Figura 1, Figura 2). O portal de gerenciamento de dados também possui uma funcionalidade de nota de laboratório para ilustrar etapas de fluxo de trabalho, incluindo o processamento de imagens com resultados intermediários, que podem estar todos associados a um projeto e fornecer o máximo de registro possível para análise e criação de relatórios e publicações.

Figura 1: Exemplo de possível organização de dados e metadados na plataforma de gerenciamento de dados. Cada projeto pode consistir em vários experimentos, como crio-EM ou espectroscopia em massa (viz. Protocolo passo 2.3). Cada experimento pode incluir vários fluxos de trabalho definidos pelo usuário (viz. Protocolo passo 2.5), cada um consistindo de múltiplas etapas configuráveis (viz. Protocolo passo 2.7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Veja um fluxo de trabalho de projeto aberto na plataforma de gerenciamento de dados. A figura mostra metadados associados e notas à etapa aberta no fluxo de trabalho. A barra esquerda com ícones fornece acesso rápido a diferentes opções e menus da plataforma de gerenciamento de dados. O painel esquerdo inclui uma lista de fluxos de trabalho salvos (mostrado apenas um fluxo de trabalho salvo "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") e um botão azul para adicionar um novo Fluxo de Trabalho. O painel central mostra etapas individuais no Fluxo de Trabalho aberto, como é mostrado para o fluxo de trabalho SPA aqui. O botão azul no canto superior direito pode adicionar um passo adicional ao fluxo de trabalho aberto. O painel direito inclui espaço para metadados gravados ou notas de entrada de usuário do fluxo de trabalho, que podem incluir texto, tabelas e imagens. Diferentes opções de formatação para o texto estão disponíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As grades Crio-EM produzidas com dispositivos tradicionais de congelamento de mergulho, como o Vitrobot, normalmente exibirão um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da rede. Algumas grades também podem ser danificadas (dobradas) após o manuseio manual e/ou o corte em um porta-anéis com raiva automática. A Figura 3 mostra exemplos de diferentes grades, como mostrado na visão geral do Atlas. As grades com gelo espesso ou danos devem ser excluídas de investigações mais aprofundadas.

Figura 3: Galeria de diferentes grades como visto na visão geral do Atlas. (A) Uma grade ruim com gelo espesso, (B) uma grade dobrada com má contaminação de gelo e gelo, (C) uma grade aceitável com bom gradiente de gelo, (D) uma grade típica com gelo fino bom e pequeno gradiente de gelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A seleção de quadrados de grade sem danos e espessura de gelo ideal é fundamental para a coleta de conjuntos de dados de alta resolução. A espessura do gelo pode variar mesmo no nível de quadrados de grade individuais, e é, portanto, importante selecionar apenas orifícios com gelo fino de cada quadrado de grade selecionado. A Figura 4 mostra um quadrado de grade adequado com papel alumínio intacto e gelo fino no centro. O quadrado de grade mostrado é bom para definir um filtro para seleção automatizada de orifícios com gelo fino em todos os quadrados de grade selecionados, pois contém uma gama de diferentes espessuras de gelo, bem como buracos vazios sem gelo, o que é extremamente útil para definir uma faixa apropriada de intensidade no filtro de gelo na tarefa de seleção de buracos.

Figura 4: Um exemplo quadrado de grade com um gradiente de espessura de gelo, de quadrados de grade vazios no centro e gelo espesso perto das barras de grade. O filtro de qualidade do gelo pode ser usado para selecionar a faixa de intensidades dentro dos orifícios com a espessura ideal de gelo que são assim selecionadas no quadrado da grade (os orifícios com sobreposição verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados de benchmark utilizando o protocolo descrito foram obtidos utilizando-se a amostra de apo-ferritina de rato (apoF) do grupo Kikkawa¹¹. ApoF é uma proteína altamente α helical que forma uma gaiola octaédral muito estável. A alta estabilidade e alta simetria fazem do ApoF uma amostra ideal para imagens crio-EM de alta resolução e processamento de imagens. A ApoF tornou-se, portanto, uma amostra padrão para avaliar o desempenho dos instrumentos crio-EM 11,12,13. Uma alíquota congelada contendo 15 mg/mL purificada amostra de apoF foi descongelada no gelo e esclarecida por centrifugação a 10.000 x g por 10 min. O supernante foi diluído para 5 mg/mL com 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL da amostra diluída foi aplicado em uma R-1.2/1.3, 300 grades de ouro de malha para 30 s. Em seguida, as grades foram borradas por 5 s antes de mergulhar congelando em etano líquido resfriado por nitrogênio líquido. O congelamento foi realizado utilizando um sistema de vitrificação totalmente automatizado a 100% de umidade e 4 °C. Todas as grades foram cortadas em autogrids e carregadas em um Cryo-TEM de 200 kV. Cerca de 3000 filmes foram coletados em um throughput de 300 filmes/h. Os dados foram processados utilizando-se os métodos descritos¹¹ com as seguintes modificações: i) A versão Relion 4-beta foi usada em vez de Relion 3.1, ii) a coleta automatizada de partículas foi feita utilizando-se médias de classe 2D de reconstruções apoF anteriores como referências, e iii) o modelo 3D inicial foi gerado a partir da reconstrução apoF anterior baixamente aprovada para resolução de 15-Å. O agrupamento óptico não foi feito para este conjunto de dados, pois o procedimento AFIS³⁴ usado tem sido comprovado para minimizar de forma eficiente e confiável mudanças de fase induzidas por inclinação de feixe que não limitam a qualidade dos dados para reconstruir mapas 3D nas resoluções relatadas. O refinamento 3D após o polimento bayesiano e o refinamento CTF levaram a um mapa de resolução de 1,68 Å. A resolução foi melhorada com a correção da esfera de Ewald resultando em um mapa de resolução de 1,63 Å. A visão geral dos parâmetros de coleta e processamento de dados é mostrada na Tabela 2, e o mapa final de densidade reconstruída é mostrado na Figura 5, com a curva Fourier Shell Correlation (FSC) mostrada na Figura Suplementar 8.

Tabela 2: Parâmetros de coleta de dados e processamento de imagens utilizados para a reconstrução 3D da apo-ferritin. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 5: Reconstrução crio-EM de apo-ferritin. (Painel esquerdo) renderização 3D do mapa crio-EM reconstruído apoF com resolução de 1,6 Å. (Painel direito) Visão detalhada do mapa reconstruído ao nível de cadeias laterais de aminoácidos individuais. A densidade de sidechains de aminoácidos é bem resolvida, e o modelo atômico pode ser inequivocamente construído dentro deste mapa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os efeitos e benefícios do uso de um filtro de energia nas reconstruções de SPA foram avaliados utilizando-se o proteasome procariótico 20S isolado de T. acidophilum. O proteasome procariótico 20S também tem sido usado como uma amostra crio-EM padrão, pois representa o núcleo catalítico estável do complexo proteasome com a simetria D7. As grades foram preparadas adicionando 4,5 μL da amostra purificada de proteasome T. acidophilum 20S em uma grade de cobre R 2/1 de tiragem de brilho. As amostras foram vitrificadas em uma mistura líquida de etano/propano utilizando um sistema de vitrificação totalmente automatizado definido para 4 °C e 100% de umidade com força de mancha de 20 e tempo de mancha de 4,5 s.

Três conjuntos de dados diferentes foram coletados da mesma grade crio-EM com quadrados de grade semelhantes usando uma largura de fenda diferente do filtro de energia na ordem: i) fenda totalmente aberta (sem fenda inserida), ii) 20 eV fenda e iii) 10 eV fenda. Os quadrados de grade foram selecionados usando um filtro de qualidade de gelo dentro do software de análise. Todos os outros parâmetros para coleta de dados e processamento de dados foram mantidos os mesmos. Os conjuntos de dados foram coletados por 15 h com um total de 4000 filmes e processados usando os métodos descritos¹¹ usando o Relion 3.1 com a modificação de que o algoritmo de colheita de partículas laplaciana-da-gaussiana foi usado para produzir médias iniciais de classe 2D para a coleta de partículas baseadas em referência a partir dos conjuntos de dados completos. O mesmo número (102.200) de partículas selecionadas aleatoriamente foi escolhido e utilizado para a iteração final e reconstrução 3D de cada conjunto de dados. As variáveis de processamento de dados estão descritas na tabela (Tabela 3) abaixo para alcançar o mapa final de densidade EM reconstruído mostrado na Figura 6 com a curva FSC mostrada na Figura Suplementar 9. O agrupamento óptico e a correção da esfera de Ewald também não foram feitos para esses conjuntos de dados.

Tabela 3: Parâmetros de coleta de dados e processamento de imagem utilizados para a reconstrução 3D do proteasome T. acidophilum 20S. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: Resumo da resolução alcançada e fator B para reconstruções crio-EM do proteasome T. acidophilum 20S usando conjuntos de dados com largura de fenda de energia diferente. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 6: Efeito da filtragem de energia em imagens crio-EM. (A) Imagens Cryo-EM em diferentes valores de desfoco coletados com ou sem fenda de 10 eV. (B) Visão geral do mapa crio-EM proteasome 20S com subunidades segmentadas. (C) Versá-lo zoom no mapa proteasome 20S com um modelo atômico equipado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Calibração da tarefa de mudança de imagem (elipse amarela) para alinhar mudanças de imagem entre diferentes predefinições ópticas (elipses vermelhas) no software de análise, usando um cristal de gelo hexagonal que é visível na faixa de ampliação total entre 100x e 165.000x. (Topo) Calibração entre as predefinições de aquisição de dados e predefinições de altura (média) (média) entre as predefinições hole/eucentric Height e Grid Square, (inferior) calibração entre as predefinições grid Square e Atlas. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Função autostigmate no software de análise (elipse amarela). (Imagem à esquerda) Imagem adquirida. (Imagem correta) Transferência de fourier da imagem adquirida mostrando anéis Thon concêntricos e seu ajuste CTF mostrado em feixes radiais. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Interface de usuário da função Autocoma em software de análise (elipse amarela) para alinhamento coma. O painel de imagens mostra imagens de transferência de Fourier adquiridas em diferentes inclinações de feixe e seus ajustes ctf que são usados para o cálculo do coma. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 4: Interface de usuário da sintonia do filtro de energia. Exemplo de um bom relatório de sintonia da isoquimalidade do filtro de energia com todos os parâmetros (mostrados em texto verde) dentro das especificações. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 5: Interface de usuário da sintonia do filtro de energia. Exemplo de bom relatório de ajuste das distorções de ampliação do filtro de energia com todos os parâmetros (mostrados em texto verde) dentro das especificações. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 6: Interface de usuário da sintonia do filtro de energia. Exemplo de boa sintonia das distorções cromáticas do filtro de energia com todos os parâmetros (mostrados em texto verde) dentro das especificações. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 7: Painel DataViz do EPU Quality Monitor com uma visão geral da qualidade dos dados em um conjunto de dados crio-EM coletado. Os gráficos com dados agregados de todas as imagens/filmes coletados mostram valores (parcelas de pontos) e distribuição (parcelas de barra) de indicadores de qualidade crítica selecionados, como o CTF fit confidence (azul), defocus (laranja) e astigmatismo (verde). Um subconjunto das imagens/filmes coletados pode ser selecionado definindo filtros de parâmetro na parte superior do painel DataViz. Após a aplicação dos filtros, imagens/filmes selecionados podem ser exportados para processamento posterior em outro pacote de processamento de imagem, como Relion ou CryoSpark. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 8: Curva FSC da reconstrução final da resolução apoF para 1,6 Å, conforme relatado pelo Relion 4-beta. A curva azul mostra o FSC de mapas 3D mascarados de duas reconstruções 3D refinadas independentemente de dois conjuntos de meio-dados mutuamente exclusivos. De acordo com o padrão-ouro FSC em 0,143, a resolução do mapa 3D final reconstruído a partir do conjunto de dados completo corresponde a 1,6 Å. A curva laranja mostra o FSC das reconstruções 3D mascaradas com fases aleatórias. A queda rápida da curva FSC indica que a máscara usada não contribuiu para o FSC observado dos mapas original reconstruídos (curva azul) além da resolução ~2 Å. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 9: Curvas FSC da reconstrução final do proteasome T. acidphilum 20S utilizando diferentes larguras de fenda do filtro de energia, conforme relatado pelo Relion 3.1. As curvas azuis mostram o FSC de mapas 3D mascarados de duas reconstruções independentemente refinadas a partir de dois conjuntos de meio-dados de cada conjunto de dados, respectivamente. O FSC padrão-ouro em 0,143 indica as resoluções alcançadas dos mapas 3D finais reconstruídos a partir dos respectivos conjuntos de dados completos (resolução 2.3 Å, 2.2 Å e 2.1 Å, respectivamente). As curvas vermelhas mostram o FSC de mapas mascarados com fases aleatórias. A queda rápida das curvas FSC vermelhas indica que a máscara usada não contribuiu para o FSC dos mapas originais reconstruídos além da resolução ~3 Å. As curvas verdes mostram o FSC de mapas 3D desmascarados, que são influenciados pelo ruído em todo o volume 3D reconstruído e, portanto, caem mais cedo que o FSC dos mapas 3D mascarados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Disponibilidade de dados: Os mapas de densidade crio-EM foram depositados no EM Data Bank sob números de adesão: apoferritina: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasome: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Discussão

O protocolo descrito pressupõe que a óptica do microscópio TEM usado está em um estado bem alinhado. Para os 200 kV TEM utilizados neste Protocolo, tais alinhamentos de coluna são feitos, verificados e salvos por um engenheiro de serviço experiente após a instalação do microscópio ou qualquer intervenção significativa do serviço. Essas configurações de alinhamento podem ser retiradas a qualquer momento na interface do microscópio. Os usuários podem usar os procedimentos de Alinhamento Direto na interface do microscópio UI para reejustar parâmetros críticos. Alguns alinhamentos, como inclinação de arma e troca de armas, são estáveis e não precisam ser ajustados pelos usuários diariamente. Verificações e re-alinhamentos (se necessário) de inclinação de arma e mudança pelo supervisor de microscópio são aconselhados duas vezes por ano. Por outro lado, alguns alinhamentos são críticos e devem ser alinhados antes de cada coleta de dados, conforme descrito no protocolo acima (como astigmatismo objetivo e alinhamento sem coma). Se a função Autocoma no software de análise não convergir, o alinhamento dos pontos de pivô de inclinação do feixe e/ou centro de rotação deve ser verificado e ajustado, e o centro correto da abertura C2 deve ser confirmado. Posteriormente, a função Autostigmate deve ser executada à medida que os estigmas objetivos também são usados para correção de coma. Esses alinhamentos devem ser iterados até que tanto o Autostigmate quanto o Autocomafunctions tenham sucesso em sua primeira iteração. Se necessário, outra área pode ser selecionada (por exemplo, suporte a folha de carbono sem gelo), desfoco ajustado por imagem ou tempo de aquisição de imagem aumentado para otimizar a relação sinal-ruído em imagens adquiridas e a visibilidade de múltiplos anéis Thon na transformação Fourier das imagens adquiridas.

Microscópios crio-EM modernos geram grandes quantidades de dados que muitas vezes excedem 1 TB por conjunto de dados para alcançar reconstruções 3D de alta resolução, particularmente para proteínas com baixa simetria. Os dados e os resultados crio-EM também são tipicamente complementados por dados e resultados de métodos ortogonais para entender completamente as relações estrutura-função em cada projeto científico. A organização dos dados coletados, sua transferência para um pipeline de processamento de imagens e o compartilhamento de uma reconstrução crio-EM resultante entre os colaboradores colocam requisitos adicionais sobre novos adotantes da metodologia crio-EM para configurar sua infraestrutura local de TI. Softwares de gerenciamento de dados, como o Athena, facilitam o armazenamento centralizado de dados adquiridos por qualquer instrumento ou software conectado operado por um usuário registrado. Dados e metadados armazenados são acessíveis usando uma interface simples do navegador da Web por vários usuários, que podem ter diferentes funções no projeto com diferentes direitos de acesso (seja como proprietário, colaborador ou visualizador) com base em suas credenciais de login e definição de compartilhamento de dados na configuração do Experimento. Essa digitalização dos fluxos de trabalho experimentais fornece meios para o compartilhamento de dados e metadados entre colaboradores sem duplicação desnecessária e aumenta a produtividade e rastreabilidade dos fluxos de trabalho usados. A implementação de uma estrutura geral e personalizável de projetos, experimentos e fluxos de trabalho em softwares de gerenciamento de dados é universal e permite a personalização e integração de experimentos ortogonais usando métodos complementares em um único banco de dados de projetos.

A seleção de áreas para a coleta de dados em uma grade crio-EM é fundamental para a aquisição bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução. As grades Crio-EM produzidas com dispositivos tradicionais de congelamento de mergulho, como o Vitrobot (um sistema de vitrificação totalmente automatizado), normalmente exibirão um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da grade (Figura 4). Isso pode ser benéfico, pois a rede contém áreas com diferentes espessuras de gelo; no entanto, áreas com a espessura ideal do gelo para coleta de dados devem ser identificadas conforme descrito no protocolo acima. Uma grade crio-EM ideal deve conter o mínimo possível de contaminação de gelo de transferência e conter quadrados de grade suficientes com papel alumínio de suporte furado intacto. A coleta de dados em quadrados de grade que tenham rachaduras ou áreas quebradas não é recomendada, pois as imagens coletadas serão afetadas por uma deriva geral significativamente mais forte após a iluminação por um feixe de elétrons em comparação com os quadrados de grade com papel alumínio intacto. O excesso de gelo cristalino pode ocluir a maioria dos buracos de papel alumínio e/ou interferir no foco automático e tais quadrados de grade também devem ser evitados. Quadrados de grade com gelo fino geralmente exibem grandes áreas vítreas e muitos buracos de folha brilhante que são visíveis em uma imagem tirada usando a predefinição do Atlas. A ocorrência de gelo mais espesso perto de barras de grade é esperada e acrítica, pois os buracos de papel alumínio nessas áreas da grade quadrada são excluídos durante o processo de Seleção de Buracos. A presença de vários buracos vazios em um quadrado de grade pode significar que o gelo vítreo nos orifícios circundantes é extremamente fino e pode conter partículas danificadas ou nenhuma partícula. Geralmente, é sábio escolher quadrados de grade com uma variedade de espessuras de gelo em diferentes regiões da rede para triagem inicial e avaliação para entender quais áreas têm as melhores condições para coleta de dados de alta resolução e exibir a densidade ideal de partículas e distribuição de orientação. Para as amostras proteassentas apoF e 20S utilizadas neste estudo, as áreas com o gelo mais fino observável contêm as melhores condições para imagens de alta resolução dessas amostras.

Ao selecionar os orifícios automaticamente em todos os quadrados de grade selecionados usando o software de coleta de dados, é aconselhável executar a tarefa de execução de modelos em um orifício representativo em cada quadrado de grade para verificar e garantir que não foram escolhidos quadrados excessivamente grossos, nem excessivamente finos, nem inesperadamente não vitreous para coleta de dados. Durante a aquisição de dados, os principais indicadores de qualidade das imagens coletadas, como deriva de imagem e encaixe ctf, podem ser monitorados usando EQM. A coleta de dados pode então ser otimizada pulando áreas que produzem imagens de má qualidade. No entanto, imagens com ajustes ctf de alta resolução ainda podem conter imagens com partículas em algumas orientações preferidas ou partículas desnaturadas em uma camada de gelo muito fina. A colheita de partículas em tempo real e a classificação 2D de imagens coletadas forneceriam informações adicionais sobre a qualidade dos dados estruturais em partículas imagens e revelariam as orientações preferidas de partículas intactas no gelo ou estrutura inconsistente de partículas (parcialmente) desnaturadas. O cálculo das médias de classes pode, portanto, ajudar a refinar ainda mais regiões apropriadas para coleta de dados, como já foi implementado e mostrado em outros pacotes^{de software 23,28}.

A seleção das configurações de imagem para aquisição de dados, como ampliação, taxa de dose de elétrons e intervalo de desfoco, depende de vários critérios, como a resolução de destino, tamanho da proteína, concentração de amostras, rendimento do microscópio desejado, etc. Para a câmera do detector de elétrons diretos usada nestes experimentos, a taxa de dose de elétrons foi escolhida na faixa de 4-5 e^-/pix/s, selecionando um tamanho e intensidade SPOT apropriados para manter a iluminação paralela. Como mostrado na Tabela 1, um tamanho SPOT diferente pode ser usado na predefinição hole/eucentric Height para garantir a relação sinal-ruído suficiente na imagem para o centro de furos durante a coleta de dados. A ampliação deve ser escolhida de modo que o tamanho do pixel seja pelo menos 2-3x menor do que a resolução de destino para a reconstrução crio-EM. No entanto, a ampliação mais alta (ou seja, menor tamanho de pixel) é usada, o campo de visão menor é capturado em imagens, e há menos partículas por imagem, o que acaba levando a um tempo de coleta de dados mais longo para coletar imagens com partículas suficientes para reconstruir mapas 3D para uma alta resolução. Para a amostra apoF, utilizamos o tamanho do pixel de 0,43 Å, pois tínhamos concentração amostral suficiente para alta densidade de partículas em imagens e resolução sub-2 Å da reconstrução. Para a amostra proteasome 20S, usamos o tamanho do pixel de 0,68 Å para cobrir um campo de visão maior em imagens adquiridas. Normalmente para microscópios TEM de 200 kV, as imagens crio-EM são adquiridas na faixa de desfocus de 0,8 a 2,0 μm. No entanto, com a melhor relação contraste e sinal-ruído usando o filtro de energia, as aquisições de dados podem ser feitas muito mais perto de se concentrar para preservar melhor as informações de alta resolução em imagens adquiridas devido a aberrações menores e a decadência correspondentemente reduzida da função do envelope CTF. Também não usamos uma abertura objetiva, pois a abertura pode introduzir aberrações adicionais de imagem, enquanto o contraste de imagem já é suficientemente aprimorado usando o filtro de energia. Para as amostras proteassentas apoF e 20S, utilizou-se as configurações de desfoco de 0,5 μm, 0,7μm e 0,9 μm. Para proteínas menores (<200 kDa), utilizamos configurações de desfoco de -0,5 μm, -0,7 μm e -0,9 μm para melhorar o contraste das partículas e facilitar a colheita de partículas e alinhamento inicial grosseiro na etapa de refinamento 3D da reconstrução 3D, o que levou à resolução 3D de ~2,5 Å (resultados inéditos).

Já mostramos que a imagem com um filtro de energia melhora a relação sinal-ruído (SNR) em imagens crio-EM coletadas nos microscópios TEM de 300 kV^{high-end 11}. De fato, quando os elétrons passam por uma amostra, dois tipos principais de interações ocorrem: i) Elétrons dispersos elásticos mantêm sua energia e contribuem para a formação de imagens por interferência com o feixe de incidentes não dispersos através do mecanismo de contraste de fase ii) elétrons inelasticamente dispersos perdem alguma energia na amostra e contribuem principalmente para o ruído nas imagens. Portanto, o SNR pode ser significativamente melhorado filtrando os elétrons inestaticamente dispersos, que têm energia menor do que o feixe de incidentes e elétrons dispersos esteticamente, usando uma fenda de energia estreita. No entanto, é fundamental usar um filtro de energia suficientemente estável, como o Selectris ou Selectris-X, para poder usar fendas muito estreitas (10 eV ou menores) ao longo (mais de 12 horas) de aquisição automatizada de dados de conjuntos de dados crioEM de alta resolução.

As imagens Crio-EM adquiridas com microscópios TEM de 200 kV nas mesmas condições que com microscópios TEM de 300 kV exibem SNR menor em alta resolução (particularmente <4 Å) devido à decadência mais rápida das funções do envelope CTF. Consequentemente, um maior número de partículas (e, portanto, um maior número de imagens coletadas) é necessário para alcançar uma certa resolução ao usar TEMs de 200 kV. Além disso, a profundidade de campo (10-25 nm na faixa de resolução 2-3 Å) também é cerca de 20% menor em imagens de 200 kV³⁵, o que significa que menos partículas na camada de gelo (tipicamente de 20-50 nm de espessura) estarão totalmente em foco e contribuirão construtivamente para todas as características de alta resolução de uma reconstrução 3D calculada, a menos que os valores de desfocto sejam refinados para cada partícula independentemente nos estágios posteriores do procedimento de reconstrução 3D. Para partículas maiores (como virões icosaedrais ou outros conjuntos macromoleculares), o tamanho das partículas pode exceder a profundidade do campo em altas resoluções e introduzir erros de fase devido à aproximação planar da esfera Ewald nos algoritmos de reconstrução 3D padrão³⁶. Esses erros podem ser refinados por algoritmos avançados que já são implementados em pacotes comuns de processamento de imagens crio-EM 37,28,39. Como a esfera Ewald tem maior curvatura em dados de 200 kV do que os dados de 300 kV, a correção da esfera de Ewald é necessária em resoluções relativamente menores e/ou para conjuntos macromoleculares relativamente menores ao usar TEMs de 200 kV. Por outro lado, imagens de 200 kV exibem maior contraste de partículas em gelo fino (20-50 nm) que é significativamente mais fino que o elétron de 200-300 keV caminho livre médio (220-280 nm). O contraste maior ajuda a melhorar o alinhamento global correto das partículas individuais, particularmente para dispersar fracamente proteínas menores cuja estrutura ainda não é conhecida, e o modelo de referência 3D ainda não está bem estabelecido.

Aqui, demonstramos no exemplo de um proteasome 20S que o contraste e a qualidade da imagem poderiam ser igualmente melhorados com um filtro de energia ao usar um microscópio TEM de 200 kV. Utilizando o mesmo número de partículas, os dados coletados usando a fenda de 20 eV foram reconstruídos para resolução de 2,26 Å em comparação com os dados coletados com a fenda de energia totalmente aberta que foi reconstruída apenas para resolução de 2,34 Å. A melhor reconstrução foi obtida a partir de dados coletados utilizando a fenda de 10 eV que foi reconstruída para resolução de 2,14 Å. Esses resultados estão de acordo com a previsão teórica de que a filtragem dos elétrons inestaticamente dispersos aumenta o SNR em imagens coletadas e facilita maior resolução nas reconstruções crio-EM a partir do determinado número de partículas, como resumido na Tabela 4. Esses resultados foram ainda confirmados pelos fatores B calculados a partir desses conjuntos de dados que indicam maior qualidade das imagens nos conjuntos de dados filtrados por energia.

Podemos, portanto, concluir que, embora os microscópios TEM de 300 kV ofereçam o maior rendimento e a maior resolução possível em reconstruções crio-EM, os microscópios TEM de 200 kV também fornecem conjuntos de dados de alta qualidade para reconstruções crio-EM de alta resolução. Mostramos aqui que a qualidade das imagens adquiridas e, portanto, o tempo geral para estrutura, pode ser melhorada usando o TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto. O Protocolo apresentado descreve todas as etapas necessárias sobre como obter rotineiramente dados crio-EM de alta resolução usando esta configuração e revelar detalhes estruturais finos das estruturas 3D macromoleculares, que são essenciais para entender as principais relações estruturais-funções na biologia estrutural e no design de medicamentos baseados em estruturas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anéis AutoGrid	Thermo Fisher Scientific	1036173	Pacote de 100 anéis AutoGrid para as grades EM padrão.
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	Pacote de 100 clipes que fixam as grades EM padrão dentro dos anéis AutoGrid.
Plataforma de gerenciamento de dados	Thermo Fisher Scientific	1160939	Parte da configuração básica do Glacios; inclui o software Athena Monitor de
qualidade EPU	Thermo Fisher Scientific	1179770
o software EPU	Thermo Fisher Scientific	1025080	Parte da configuração básica do Glacios
Ethane 3.5	Westfalen	A06010110	Gás etano usado para fazer etano líquido (pureza de pelo menos N35, ou seja, 99,95% vol)
Falcon 4 200kV	Thermo Fisher Scientific	1166936	Detector de elétrons direto
Glacios	Thermo Fisher Scientific	1149551	200 kV TEM
GloQube Plus Sistema de descarga incandescente para grades TEM e modificação de superfície	Quorum	N/A	também disponível via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
Grades QuantiFoil	Quantifoil	N/A	R-2/1, malha 300; grade de folha de carbono
Relion	MRC Laboratório de Biologia Molecular	N/A	software de código aberto: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris com Falcon 4 para 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191753	Filtro de energia
Selectris X com Falcon 4 para 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191755	Filtro de energia
Grades UltrAuFoil	Quantifoil	N/A	R-1.2/1.2, 300 mesh; grades de folha de ouro
Vitrobot Mk. IV	Thermo Fisher Scientific	1086439	Sistema de vitrificação automatizado
Papel de filtro Whatman 595	Thermo Fisher Scientific	AA00420S