Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Resumo

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Resumo

Com abundantes pesquisas sobre células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) publicadas ao longo dos anos, as ILC2s são amplamente conhecidas por estarem implicadas na regulação de vários processos patológicos, incluindo imunidade anti-helmíntica, reparo tecidual, termogênese e doenças autoimunes como asma e rinite alérgica (RA). As ILC2s residem permanentemente em tecidos periféricos como pele, intestino, pulmões e cavidade nasal; no entanto, há informações limitadas sobre suas funções exatas na imunidade da mucosa nasal. CD226 é uma molécula costimulatória ativadora, expressa principalmente em células natural killer (NK), células T e monócitos inflamatórios. No entanto, se ILC2s expressam CD226 ou desempenham um papel na patogênese de doenças relacionadas a ILC2s permanece desconhecido. Aqui, estabelecemos um método para isolar e identificar ILC2s da mucosa nasal e detectamos a expressão de CD226 em ILC2s obtidas de camundongos saudáveis e AR. Neste artigo, descrevemos este protocolo para o isolamento e identificação de ILC2s da mucosa nasal de camundongos, o que ajudará a explorar o mecanismo patológico interno de distúrbios imunológicos em doenças da mucosa nasal.

Introdução

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) foram descobertas pela primeira vez nos tecidos da cavidade peritoneal de camundongos e, posteriormente, demonstraram estar presentes no sangue e em outros tecidos periféricos, como pulmões, pele e cavidade nasal ^1,2,3. Como células residentes no tecido, as ILC2 são principalmente mantidas e proliferam localmente e funcionam como os primeiros guardas respondendo a estímulos nocivos exógenos através da produção de numerosas citocinas do tipo 2 e indução de imunidade do tipo 2 ^4,....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Científica da Quarta Universidade Militar de Medicina (nº 20211008).

1. Estabelecimento do modelo de RA murino

1. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas do tipo selvagem (WT) domésticos com idade entre 8-12 semanas sob condições específicas livres de patógenos e fornecem ração e água padrão de laboratório.
2. Emulsionar 50 μg de ovalbumina (OVA) em 0,2 mL de PBS estéril contendo 2 mg de hidróxido de alumínio em uma banc....

Resultados

Um modelo murino induzido por VA foi desenvolvido para explorar o papel da ILC2s na RA. A construção do modelo murino de RA foi baseada em estudos prévios com pequenas modificações 28,29,30,31. Um vídeo de 10 min foi capturado para medir a frequência de espirros e coçar o nariz após o último teste de provocação nasal. Os sintomas alérgicos dos camundongos OVA-induzidos-AR foram apresentados na .......

Discussão

As ILC2 estão intimamente associadas à inflamação tipo 2 e a distúrbios inflamatórios, como demonstrado por um número crescente de estudos. Tanto os modelos em camundongos quanto a observação humana contribuem para uma melhor compreensão de sua função nas vias aéreas superiores. Na fisiopatologia da asma, as ILC2 são ativadas através da linfopoietina estromal tímica, IL-25 e IL-33, que são produzidas principalmente por células epiteliais. Em seguida, espelhando as células Th2, as ILC2 produzem IL-4, IL-5 e IL-13 para agr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hidróxido de alumínio	Meilun biological Technology	21645-51-2
CD11b	eBioscience	11-0112-82	Usado em coquetel de anticorpos
CD11c	BioLegend	117306	Usado em coquetel de anticorpos
CD16 / 32	BioLegend	101302	Clone: 93; Diluição 1:100
CD226	BioLegend	128812	Usado em coquetel de anticorpos
CD3e	BioLegend	100306	Usado em coquetel de anticorpos
CD45	BioLegend	103128	Usado em coquetel de anticorpos
CD45R	eBioscience	11-0452-82	Usado em coquetel de anticorpos
CD90.2	BD Pharmingen	553014	Usado em anticorpos coctail
Collagenase IV	DIYIBio	DY40128
CountBright contas de contagem absoluta	Invitrogen	C36950	contas de contagem absoluta
Dnase	Beyotime	D7076
Fetal Bovine Serum	gibco	10270-106
Corante de Viabilidade Fixável eFluor 520 (FITC)	eBioscience	65-0867-14	FVD
HBSS, cálcio, magnésio	Servicebio	G4204-500
KLRG1	eBioscience	17-5893-81	Usado em coquetel de anticorpos
NaN3	SIGMA	S2002
NovoExpress software	AgilentTechnologies	Versão 1.5.0	análise de citometria de fluxo (FCM)
OVA	SIGMA	9006-59-1
PBS, 1x	Servicebio	G4202-500
PBS, 10x	Servicebio	G4207-500
Percoll	Yeasen	40501ES60	densidade meio gradiente
RPMI 1640 meio de cultura	Corning	10-040-CVRV
Analisador de células espectrais	SONY	SA3800