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Artigo de método

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

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DOI:

10.3791/63536

⸱

1 de fevereiro de 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

CUT&RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&RUN unicelular.

Resumo

Determinar os locais de vinculação de uma proteína na cromatina é essencial para entender sua função e potenciais metas regulatórias. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para determinar a localização da proteína por mais de 30 anos e é definida pelo uso de um anticorpo para retirar a proteína de interesse da cromatina sônica ou enzimática digerida. Mais recentemente, as técnicas de amarração de anticorpos tornaram-se populares para avaliar a localização de proteínas na cromatina devido ao seu aumento da sensibilidade. Cleavage Sob Alvos & Liberação Sob Nuclease (CUT&RUN) é o derivado em todo o genoma do Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utiliza proteína recombinante A amarrada à nuclease microcócica (pA-MNase) para identificar a região constante do IgG do anticorpo visando uma proteína de interesse, permitindo, portanto, o decote específico do DNA flanqueando a proteína de interesse. O CUT&RUN pode ser usado para traçar modificações de histona, fatores de transcrição e outras proteínas de ligação de cromatina, como fatores de remodelação nucleossomo. É importante ressaltar que o CUT&RUN pode ser usado para avaliar a localização de proteínas eucromáticas ou heterocromáticas e modificações de histona. Por essas razões, a CUT&RUN é um método poderoso para determinar os perfis de vinculação de uma ampla gama de proteínas. Recentemente, a CUT&RUN foi otimizada para o perfil do fator de transcrição em baixas populações de células e células únicas e o protocolo otimizado tem sido chamado de cut&RUN de entrada ultra-baixa (uliCUT&RUN). Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o perfil de fator unicelular usando uliCUT&RUN em um formato manual de 96 poços.

Introdução

Muitas proteínas nucleares funcionam interagindo com a cromatina para promover ou prevenir atividades modeldas por DNA. Para determinar a função dessas proteínas que interagem com a cromatina, é importante identificar os locais genômicos em que essas proteínas estão ligadas. Desde o seu desenvolvimento em 1985, a Imunoprecipitação Chromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para identificar onde uma proteína se liga à cromatina 1,2. A técnica tradicional de ChIP tem o seguinte fluxo de trabalho básico: as células são colhidas e cruzadas (geralmente com formaldeído), a cromatina é ensaboada (geralmente com métodos de sônica dura, necessitando de crosslinking), a proteína de interesse é imunoprecipitada usando um anticorpo que visa a proteína (ou proteína marcada) seguido por um anticorpo secundário (acoplado a garose ou contas magnéticas), crosslinking é revertido, proteína e RNA são digeridos para purificar o DNA, e este DNA enriquecido chIP é usado como modelo para análise (usando sondas radiolabeled 1,2, qPCR3, microarrays 5,6, ou sequenciamento4). Com o advento das microarrays e do sequenciamento profundo massivamente paralelo, o Chip ChIP 5,6 e o ChIP-seq4 foram mais recentemente desenvolvidos e permitem a identificação em todo o genoma da localização de proteínas na cromatina. Crosslinking ChIP tem sido uma técnica poderosa e confiável desde o seu advento com grandes avanços na resolução por ChIP-exo7 e ChIP-nexus8. Paralelamente ao desenvolvimento de protocolos chip-seq, nativos (não-crosslinking) para ChIP (N-ChIP) foram estabelecidos, que utilizam digestão nuclease (muitas vezes usando nuclease microcócica ou MNase) para fragmentar a cromatina, em oposição à sonicação realizada nas técnicas tradicionais de ChIP transligação9. No entanto, uma grande desvantagem tanto para as tecnologias de ChIP e N-ChIP de crosslinking tem sido a exigência de números de células elevados devido ao baixo rendimento de DNA após a manipulação experimental. Portanto, nos anos mais recentes, muitos esforços têm sido para otimizar as tecnologias chip para baixa entrada celular. Esses esforços resultaram no desenvolvimento de muitas tecnologias poderosas baseadas em ChIP que variam em seus requisitos de aplicabilidade e insumo 10,11,12,13,14,15,16,17,18. No entanto, faltam tecnologias baseadas em ChIP-seq unicelulares, especialmente para proteínas não histonas.

Em 2004, uma tecnologia alternativa foi desenvolvida para determinar a ocupação proteica em chromatina denominada Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Essas técnicas de locus único utilizam uma fusão de MNase para a proteína de interesse (ChEC) ou para a proteína A (ChIC) para corte direto do DNA adjacente à proteína de interesse. Nos anos mais recentes, tanto o ChEC quanto o ChIC foram otimizados para o perfil de proteína em todo o genoma em cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, respectivamente)20,21. Embora o ChEC-seq seja uma técnica poderosa para determinar a localização de fatores, requer o desenvolvimento de proteínas de fusão de MNase para cada alvo, enquanto o ChIC e sua variação genoma-em todo o genoma, CUT&RUN, dependem de um anticorpo direcionado para a proteína de interesse (como com chip) e proteína recombinante A-MNase, onde a Proteína A pode reconhecer a região constante de IgG do anticorpo. Como alternativa, foi desenvolvida uma proteína de fusão A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) que pode reconhecer uma gama mais ampla de regiões constantes de anticorpos22. A CUT&RUN tornou-se rapidamente uma alternativa popular ao ChIP-seq para determinar a localização de proteínas em todo o genoma da cromatina.

A entrada ultra-baixa CUT&RUN (uliCUT&RUN), uma variação da CUT&RUN que permite o uso de entradas de células baixas e unicelulares, foi descrita em 201923. Aqui, a metodologia para um formato manual de 96 poços de aplicação unicelular é descrita. É importante notar que desde o desenvolvimento do uliCUT&RUN, duas alternativas para o perfil de histona, CUT&Tag e iACT-seq foram desenvolvidas, fornecendo perfil robusto e altamente paralelo das proteínas histonas24,25. Além disso, o scCUT&Tag foi otimizado para traçar múltiplos fatores em uma única célula (multiCUT&Tag) e para aplicação a proteínas não histonas26. Juntas, a CUT&RUN oferece uma alternativa atraente para chip-seq de baixa entrada, onde o uliCUT&RUN pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular que tenha acesso a um classificador de células e equipamentos padrão.

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Protocolo

Declaração ética: Todos os estudos foram aprovados pelo Escritório de Proteção à Pesquisa da Universidade de Pittsburgh.

1. Prepare contas magnéticas

NOTA: Realize antes da triagem celular e segure no gelo até o uso.

  1. Pipeta 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas misturam chorume por reação a um tubo fresco de microfuça de 1,5 mL e adicionam 850 μL de Buffer de Ligação, pipetando suavemente para misturar.
    NOTA: Microesferas paramagnéticas conjugadas pela são contas magnéticas revestidas de lectina que permitem a ligação da membrana lipídica.
  2. Coloque o tubo em um rack magnético e deixe que as contas magnetizem por 1-2 min. Uma vez que o supernatante tenha limpado, remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.
  3. Remova o tubo do rack magnético e lave as contas reutilizando em 1 mL de buffer de ligação.
  4. Repita as etapas 1.2 e 1.3.
  5. Magnetize as contas por 2 minutos e remova o supernatante para descartar.
  6. Remova o tubo do rack magnético e resuspense as contas em 30 μL de Buffer de ligação por reação.
  7. Segure a mistura de contas lavadas no gelo até que as células sejam classificadas.

2. Células de colheita

NOTA: Esta etapa é escrita para células aderidas e otimizada para células-tronco embrionárias murine E14. A colheita e a colheita das células dependem do tipo celular.

  1. Remova as células da incubadora de 37 °C e examine-as sob um microscópio para garantir a qualidade.
  2. Aspire a mídia da placa celular e enxágue com 5 mL de PBS 1x.
  3. Aspirar PBS da placa e colher as células (utilizando métodos tradicionais de colheita celular que diferem por tipo de célula). Obtenha suspensão unicelular, encanar suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica contra o prato de cultura, se necessário.
  4. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire a 200 x g por 5 min.
  5. Aspire fora da mídia para descartar e lavar a pelota celular com 5 mL de PBS + 1% FBS.
  6. Gire as células a 200 x g por 5 min, descarte o supernascedor e resuspenque a pelota celular em 5 mL de PBS + 1% FBS.
  7. Conte as células e transfira 1 mL de 1 x 106 células para um tubo de microfuça de 1,5 mL fresco.
  8. Adicione 5 μL de 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD), inverta bem o tubo para misturar e, em seguida, aplique a amostra no classificador celular para classificar células individuais vivas em poços individuais de uma placa de 96 poços.
    NOTA: O corante 7-AAD é excluído das células vivas e, portanto, pode ser usado na triagem de células vivas.

3. Classificação celular e lise celular

  1. Prepare uma placa de 96 poços compatível com o classificador celular com 100 μL de buffer de extração nuclear (NE) em cada poço antes da classificação celular.
  2. Classifique as células em placas de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.
  3. Gire rapidamente a placa (600 x g para 30 s) para garantir que as células estejam no buffer dentro dos poços.
    NOTA: Vale a pena testar em um experimento preliminar se as células que estão sendo usadas são de forma confiável trazidas para o fundo dos poços.
  4. Segure as amostras no gelo por 15 minutos.
  5. Gire as amostras a 600 x g por 5 min a 4 °C e cuidadosamente pipeta para remover o supernaspetivo (deixando para trás 5 μL).
  6. Resuspenque cada amostra em 55 μL de buffer NE e adicione 30 μL das microesferas paramagnéticas pré-lavadas conjugadas (a partir do passo 1,7; em Buffer de Ligação) a cada reação.
  7. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.

4. Amostras pré-bloco para evitar a digestão precoce por MNase

  1. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe as contas se amarrarem por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.
  2. Adicione 100 μL de Tampão de Bloqueio às contas ligadas ao núcleo e misture com tubulação suave.
  3. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

5. Adição de anticorpo primário

  1. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
  2. Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 100 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.
  3. Coloque a placa de volta no rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar e, em seguida, remova e descarte o supernatante.
  4. Resuspenda as contas em 25 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.
  5. Faça uma mistura principal de mestre de anticorpos: 25 μL de Wash Buffer + 0,5 μL de anticorpo por reação.
  6. Enquanto suavemente vórtice as contas ligadas aos núcleos, adicione 25 μL da mistura principal de anticorpos mestre a cada amostra que está sendo tratada com um anticorpo visando a proteína de interesse (tipicamente 1:100 diluição final). Adicione 25 μL de Wash Buffer sem anticorpos, se realizar um controle.
  7. Incubar por 1h à temperatura ambiente.
  8. Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços, permita que o supernatante se limpe por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
  9. Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando por pipetação.

6. Adição de pA-MNase ou pA/G-MNase

NOTA: A proteína A tem uma alta afinidade com moléculas de IgG de determinadas espécies, como coelhos, mas não é adequada para IgGs de outras espécies, como ratos ou ratos. Alternativamente, a Proteína A/G-MNase pode ser usada. Este híbrido liga IgGs de coelho, rato e rato, evitando a necessidade de anticorpos secundários quando anticorpos primários de rato ou rato são usados.

  1. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e depois remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
  2. Remova a placa do rack magnético e resuspenque cada amostra em 25 μL de Wash Buffer.
  3. Faça um mix mestre pA-MNase (25 μL de Wash Buffer + quantidade otimizada de pA-MNase por reação).
  4. Enquanto suavemente vórtice, adicione 25 μL da mistura mestre pA-MNase a cada amostra, incluindo as amostras de controle.
    NOTA: A concentração de pA-MNase varia após a preparação, se caseira, e deve ser testada antes de ser usada em cada purificação independente. Para pA/G-MNase, devem ser utilizados 2,5 μL do estoque de 20x.
  5. Incubar as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente.
  6. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
  7. Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando-se por tubulação suave.

7. Digestão de DNA direcionada

  1. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.
  2. Remova as amostras do rack magnético e resuspenja as contas em 50 μL de Wash Buffer por tubulação suave.
  3. Equilibre as amostras para 0 °C em uma mistura de gelo/água por 5 minutos.
  4. Remova as amostras do banho de gelo/água de 0 °C e adicione 1 μL de 100 mM CaCl2 usando uma pipeta multicanal. Misture bem (3-5 vezes) com tubos suaves usando uma pipeta multicanal de maior volume e, em seguida, devolva as amostras para 0 °C.
    NOTA: Misturar bem aqui é essencial. CaCl2 é adicionado para ativar a digestão MNase do DNA flanqueando a proteína de interesse.
  5. Inicie um temporizador de 10 minutos assim que a placa voltar ao banho de gelo/água.
  6. Pare a reação pipetando 50 μL de buffer 2XRSTOP+ em cada poço, na mesma ordem que o CaCl2 foi adicionado.
    NOTA: Faça o buffer 2XRSTOP+ antes que a digestão de 10 minutos acabe para evitar a digestão excessiva.

8. Fracionamento da amostra

  1. Incubar as amostras por 20 min a 37 °C.
  2. Gire a placa a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.
  3. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e transfira supernantes para uma placa fresca de 96 poços. Descarte as contas.

9. Extração de DNA

  1. Adicione 1 μL de Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e 0,83 μL de 20 mg/mL Proteinase K a cada amostra.
    ATENÇÃO: O pó SDS é prejudicial se inalado. Os usuários devem usar em espaços bem ventilados usando óculos, luvas e um respirador de grau N95, manuseando com cuidado.
  2. Misture as amostras por tubulação suave.
  3. Incubar as amostras por 10 min a 70 °C.
  4. Volte a placa à temperatura ambiente e adicione 46,6 μL de 5 M NaCl e 90 μL de 50% PEG 4000. Misture por pipetação suave.
  5. Adicione 33 μL de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: Certifique-se de levar as contas de poliestireno-magnetita à temperatura ambiente (~30 min) e misturar bem antes de usar.
  6. Coloque a placa em um rack magnético e deixe o supernatante limpar por ~5 minutos, e depois descarte cuidadosamente o sobrenante sem perturbar as contas.
  7. Enxágüe 2x com 150 μL de 80% de etanol sem perturbar as contas.
    ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável e causa irritação na pele, nos olhos e no pulmão. Realize esta etapa com roupas de laboratório adequadas e em um capô ventilado.
  8. Gire a placa brevemente a 1000 x g para 30 s. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova todos os EtOH residuais sem perturbar as contas.
  9. Seque as amostras por ~2-5 min.
    NOTA: Não seque as contas por mais de 5 minutos. Se for diligente em remover o EtOH, 2-3 min de secagem é suficiente.
  10. Resuspenncie as contas com 37,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
  11. Coloque a placa em um rack magnético e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.
  12. Transfira 36,5 μL do supernante para uma placa de 96 poços compatível com termocicl. Descarte as contas.
    NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando amostras a -20 °C ou pode continuar com a construção da biblioteca (etapas 10-15).

10. Reparação final, fosforilação, adenilação

NOTA: Os reagentes são originados como referenciados na Tabela de Materiais. O protocolo abaixo segue um método semelhante ao kit comercial, como o kit NEBNext Ultra DNA II.

  1. Diluir 5 U/μL de polimerase de DNA T4 1:20 em 1x tampão de ligase de DNA T4.
  2. Prepare um mix mestre de reparo final/3'A: 2 μL de 10x tampão de ligase de DNA T4, 2,5 μL de 10 mM dNTPs, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40% PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL de polimerase de DNA T4 diluída, 0,5 μL de polimerase de DNA Taq 5U/μL, com um volume total de 13,5 μl de reação de DNA por.
    NOTA: Certifique-se de levar 40% PEG 4000 à temperatura ambiente antes de pipetar.
  3. Adicione 13,5 μL de reparação final/3'A mistura mestre a 36,5 μL de DNA.
  4. Misture a reação com vórtice rápido e, em seguida, um giro rápido (500 x g para 10 s).
  5. Incubar usando as seguintes condições de reação em um termociclador pré-resfriado com uma tampa aquecida para temperaturas >20 °C. Use as condições de reação: 12 °C para 15 min, 37 °C para 15 min, 72 °C para 20 min, mantenha em 4 °C.

11. Ligadura adaptador

NOTA: Mantenha as amostras no gelo enquanto configura a seguinte reação. Deixe que o tampão ligase chegue à temperatura ambiente antes de pipetar. Diluir o Adaptador (ver Tabela de Materiais) em uma solução de 10 mM Tris-HCl contendo 10 mM NaCl (pH 7.5). Devido ao baixo rendimento, não pré-quantifique o DNA enriquecido pela CUT&RUN. Em vez disso, gerar diluições 25 vezes do adaptador, utilizando uma concentração final do adaptador de trabalho de 0,6 μM.

  1. Faça uma mistura mestre de ligadura: 55 μL de tampão de ligase (2x), 5 μL de liga ligase de DNA T4 e 5 μL de Adaptador diluído, com um volume total de 65 μL por reação.
  2. Adicione 65 μL da mistura de ligadura mestre a 50 μL de DNA a partir da etapa 10.5.
  3. Misture por vórtice rápido, seguido de giro rápido (500 x g para 10 s).
  4. Incubar a 20 °C em um termociclador (sem tampa aquecida) por 15 min.
    NOTA: Proceda imediatamente para a seguinte etapa.

12. Digestão do USUÁRIO

  1. Adicione 3 μL de enzima US a cada amostra, vórtice e giro (500 x g para 10 s).
  2. Incubar em ciclofaixa térmica a 37 °C por 15 min (tampa aquecida a 50 °C).

13. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita após reação de ligadura

NOTA: Permitir que as contas de poliestireno-magnetita se equilibrem à temperatura ambiente (~30 min). Vórtice para homogeneizar a solução de contas antes de usar. Realize as seguintes etapas em temperatura ambiente.

  1. Adicione 39 μL (0,33x) de solução de contas de hidrostimo de poliestireno a cada bem que contenha DNA ligado por adaptador.
  2. Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que o DNA se ligue às contas.
  3. Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços e incubar por 5 minutos até que o sobrenatante esteja limpo.
  4. Mantenha a placa no rack magnético e remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
  5. Enxágüe as contas com 200 μL de 80% EtOH sem perturbar as contas.
  6. Incubar por 30 s em um rack magnético de 96 poços para permitir que a solução seja limpa.
  7. Remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.
  8. Repita as etapas 13.5-13.7 para um total de duas lavagens.
  9. Gire a placa brevemente a 500 x g para 10 s, coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova o EtOH residual sem perturbar as contas.
  10. Mantenha a placa no rack magnético e seque as amostras por 2 minutos.
    NOTA: Não seque demais as contas.
  11. Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 28,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    ATENÇÃO: O ácido clorídrico é muito corrosivo. Os usuários devem lidar com isso com cuidado em um capuz de fumaça química usando óculos, luvas e um jaleco.
  12. Resuspend completamente as contas por pipetação, tomando cuidado para não produzir bolhas.
  13. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
  14. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe a solução limpar por 5 minutos.
  15. Transfira 27,5 μL de supernaspeso para uma nova placa PCR e descarte as contas.

14. Enriquecimento da biblioteca

NOTA: Os primers são diluídos com a mesma solução do adaptador. Para esta construção da biblioteca, use uma concentração final de primer de trabalho de 0,6 μM.

  1. Adicione 5 μL de primer indexado diluído (ver Tabela de Materiais) a cada amostra.
    NOTA: Cada amostra precisa de um índice diferente para ser identificado após o sequenciamento.
  2. Prepare um mix mestre pcr: 10 μL de 5x tampão PCR de alta fidelidade, 1,5 μL de 10 mM dNTPs, 5 μL de primer Universal diluído, 1 μL de 1 U hot start de alta fidelidade polimerase, com um volume total de mix mestre de 17,5 μL por amostra.
  3. Adicione 17,5 μL pf MISTURA PCR a 32,5 μL de DNA purificado adaptado a adaptador (5 μL de primer indexado está incluído neste volume).
  4. Misture a solução por pipetação.
  5. Incubar em um termociclador utilizando as seguintes condições de reação com uma velocidade máxima de 3 °C/s: 98 °C para 45 s, 98 °C para 45 s, 60 °C para 10 s, repita o segundo e terceiro passos 21 vezes, 72 °C para 1 min, mantenha em 4 °C.
    NOTA: As amostras podem ser mantidas a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.

15. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita

  1. Adicione 60 μL (1,2x) de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra.
  2. Resuspenda as contas por pipetação e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
  3. Coloque a placa em um rack magnético por 5 minutos até que a solução esteja clara.
  4. Descarte o supernasce e enxágue as contas com 200 μL de 80% De SI sem perturbar as contas.
  5. Repita a etapa de lavagem para um total de duas lavagens de 80% etoh.
  6. Gire a placa a 500 x g para 10 s, coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.
  7. Pipeta para remover o excesso de EtOH sem perturbar as contas e permitir que as contas sequem ao ar por 2 minutos.
    NOTA: Não seque demais as contas.
  8. Resuspenda as contas em 21 μL de água sem nuclease e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.
  9. Coloque a placa em um rack magnético e deixe a solução limpar por 5 minutos.
  10. Transfira 20 μL do supernatante para uma nova placa.
    NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando a amostra a -20 °C.
  11. Quantifique as concentrações da biblioteca com um fluorômetro (ver Tabela de Materiais), usando um reagente 1x HS.
  12. Se a concentração permitir, execute 30 ng de amostra em gel de 1,5% de agarose com uma escada de baixo peso molecular para visualizar. Alternativamente, visualize em um Analisador de Fragmentos ou instrumento relacionado.
  13. Bibliotecas sequenciadas em uma plataforma de Illumina para obter ~50.000-100.000 leituras exclusivamente mapeadas.

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Resultados

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para perfil de proteína unicelular em cromatina usando um formato manual de 96 poços uliCUT&RUN. Embora os resultados variem com base na proteína que está sendo perfilada (devido à abundância de proteínas e qualidade de anticorpos), tipo celular e outros fatores contribuintes, os resultados antecipados para esta técnica são discutidos aqui. A qualidade celular (aparência celular e por cento das células viáveis) e a classificação unicelular devem ser avaliadas antes ou no mom...

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Discussão

CUT&RUN é um protocolo eficaz para determinar a localização de proteínas na cromatina. Tem muitas vantagens em relação a outros protocolos, incluindo: 1) alta relação sinal-ruído, 2) protocolo rápido e 3) baixa cobertura de leitura de sequenciamento necessária, levando, assim, à redução de custos. O uso de Proteína A- ou Proteína A/G-MNase permite que o CUT&RUN seja aplicado com qualquer anticorpo disponível; portanto, tem o potencial de traçar rapidamente e facilmente muitas proteínas. No entanto, a adaptação a célula ú...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes relacionados a este projeto.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do Laboratório Hainer por lerem e comentarem uma versão anterior deste manuscrito. Este projeto utilizou o NextSeq500 disponível no Núcleo de Sequenciamento de Ciências da Saúde da Universidade de Pittsburgh no UPMC Children's Hospital of Pittsburgh para sequenciamento com agradecimentos especiais ao seu diretor, William MacDonald. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Centro de Computação de Pesquisa da Universidade de Pittsburgh através dos recursos de computador fornecidos. Este trabalho foi apoiado pelo Número de Subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde R35GM133732 (para S.J.H.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microfuga transparentes de 1,5 mLThermoFisher Scientific90410
Rack magnético de tubo de 1,5 mLThermoFisher Scientific12321D
Centrífuga fria compatível com tubo de 1,5 mLEppendorf5404000537
placas de cultura de tecidos estéreis de 10 cmThermoFisher Scientific150464
10X T4 DNA Ligasetampão Novo TubosB0202S
VWR89039-656
1X TE bufferThermoFisher Scientific12090015
200 µ L Tubos de PCREppendorf951010022
2X tampão de ligase rápidaNew England BiolabsM2200Tampão de ligase
5X KAPA Tampão HiFiRoche79588890015X tampão de PCR de alta fidelidade
7-Amino-Actinomicina D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
Rack magnético de 96 poçosThermoFisher Scientific12027 ou 12331D
Placa de 96 poçosVWR82006-636
AMPure XP contasBeckman CoulterA63881contas de poliestireno-magnetita; Devido à potencial variabilidade entre AMPure XP lotes de cordão, é recomendado que seu AMPure solução de bead ser calibrado. Ver fabricante' s instruções
Anticorpo para proteína de interessevaria
ATPThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalina A grânulos Polysciences86057-10Microesferas paramagnéticas conjugadas com
BSA
Cloreto de cálcio (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
Classificador de célulasBD FACSAria II ClassificadorRequer treinamento
Meios específicos para células para cultura de célulasVaria
ClorofórmioThermoFisher ScientificC298-500O clorofórmio é irritante e prejudicial para a pele se ingerido; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção
Computador com processador de 64 bits e acesso a um clusterPara análises computacionais de conjuntos de dados de sequenciamento resultantes
Colunas de rotação de DNAEpoch Life Sciences1920-250
dNTP conjuntoNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
O equipamento de eletroforesevaria
EtanolFisher Scientific22032601100% vol/vol etanol é altamente inflamável; manuseie em um exaustor químico usando luvas, um jaleco, e óculos de proteção
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
GlicerolFisher ScientificBP229-1
GlicogênioVWR97063-256
HEPES Fisher ScientificBP310-500Heterólogo
S. cerevisiae DNA spike-incaseiroPreparado a partir de DNA genômico extraído em gel reticulado, digerido por MNase e agarose, purificado de proteína/RNA e diluído a 10 ng/mL. Recomendamos DNA genômico de levedura, mas outros organismos podem ser usados, se necessário.
Ácido clorídrico  (HCl)A144-212Fisher Scientificé muito corrosivo; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção
Balde de gelovaria
Plataforma de sequenciamento Illumina (por exemplo, NextSeq500)Illumina
com controle de temperatura e atmosferaThermoFisher Scientific51030284
Polimerase de DNA de alta fidelidade KAPA HotStart com tampão de alta fidelidade KAPA 5XRoche7958889001hotstart polimerase de alta fidelidade
Capa de fluxo laminarBakery CompanySG404
Cloreto de manganês (MnCl2)Sigma Aldrich244589
Conjunto de micropipetasRainin30386597
MinifugeBenchmark ScientificC1012
Adaptador NEBNew England BiolabsE6612AVIALAdaptador
NEB Primer universalNew England BiolabsE6611AVIALUniversal Primer
NEBNext Multiplex Oligos para kit IlluminaNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/LPrimers indexados
Anticorpos anticorpo de controlenegativo-ABIN101961
on-lineÁgua livre de nucleaseNew England BiolabsB1500S
PCR termocicladorEppendorf2231000666
Tubos de bloqueio de faseQiagen129046
Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (PCI)ThermoFisher Scientific15593049O fenol é prejudicial se ingerido ou em contato com a pele; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção
Hipoteta de ajuda para solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
DrummondScientific# 4-000-100
Polietilenoglicol (PEG) 4000VWRA16151
Cloreto de Potássio (KCl)Sigma AldrichP3911
Hidróxido de Potássio (KOH)Fisher ScientificP250-1CUIDADO KOH é um irritante para os olhos / pele como um sólido e corrosivo em solução. Manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção
Inibidores de proteaseThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purificado de pK19pA-MNAddgene86973
Proteinase KKit de ensaio
Qubit 1X dsDNA HSTubos de ensaio ThermoFisher ScientificQ33230
QubitThermoFisher ScientificQ32856
Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ33238
Quick Ligase com 2X Quick Ligase bufferNew England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
Acetato de Sódio  (NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Cloreto de Sódio (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Dodecil sulfato de Sódio (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS é venenoso se inalado; manuseie com cuidado em espaços bem ventilados usando luvas, proteção para os olhos e um respirador de grau N95 ao manusear
Hidróxido de Sódio (NaOH)Fisher ScientificS318-1O NaOH é um irritante para os olhos / pele como um sólido e corrosivo em solução. Manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção
EspermidinaSigma AldrichS2626
Microscópio de luz invertida padrãoLeica11526213
Materiais de gel de agarose de laboratório padrãoVaria
Materiais de laboratório padrão, como pipetas sorológicas e pontas de pipetaVaria
T4 DNA LigaseNovo Inglaterra BiolabsM0202S
T4 DNA PolimeraseNew England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Vórtice de mesaFisher Scientific2215414
Taq DNA PolimeraseNew England BiolabsM0273S
ThermomixerEppendorf5384000020Alternativamente, pode usar um banho-maria
Base TrisFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 é perigoso; use um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear
TrypsinFisher ScientificMT25052
Tube rotatorVWR10136084
USER enzimaNew England BiolabsM5505S
cônicos de 15 mL da England Biolabs de células de supercomputaçãoO ácido clorídrico da Incubadora New England Biolabs P8107S

Referências

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