CUT&RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&RUN unicelular.
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Artigo de método
Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease
Neste artigo
Resumo
Resumo
Determinar os locais de vinculação de uma proteína na cromatina é essencial para entender sua função e potenciais metas regulatórias. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para determinar a localização da proteína por mais de 30 anos e é definida pelo uso de um anticorpo para retirar a proteína de interesse da cromatina sônica ou enzimática digerida. Mais recentemente, as técnicas de amarração de anticorpos tornaram-se populares para avaliar a localização de proteínas na cromatina devido ao seu aumento da sensibilidade. Cleavage Sob Alvos & Liberação Sob Nuclease (CUT&RUN) é o derivado em todo o genoma do Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utiliza proteína recombinante A amarrada à nuclease microcócica (pA-MNase) para identificar a região constante do IgG do anticorpo visando uma proteína de interesse, permitindo, portanto, o decote específico do DNA flanqueando a proteína de interesse. O CUT&RUN pode ser usado para traçar modificações de histona, fatores de transcrição e outras proteínas de ligação de cromatina, como fatores de remodelação nucleossomo. É importante ressaltar que o CUT&RUN pode ser usado para avaliar a localização de proteínas eucromáticas ou heterocromáticas e modificações de histona. Por essas razões, a CUT&RUN é um método poderoso para determinar os perfis de vinculação de uma ampla gama de proteínas. Recentemente, a CUT&RUN foi otimizada para o perfil do fator de transcrição em baixas populações de células e células únicas e o protocolo otimizado tem sido chamado de cut&RUN de entrada ultra-baixa (uliCUT&RUN). Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o perfil de fator unicelular usando uliCUT&RUN em um formato manual de 96 poços.
Introdução
Muitas proteínas nucleares funcionam interagindo com a cromatina para promover ou prevenir atividades modeldas por DNA. Para determinar a função dessas proteínas que interagem com a cromatina, é importante identificar os locais genômicos em que essas proteínas estão ligadas. Desde o seu desenvolvimento em 1985, a Imunoprecipitação Chromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para identificar onde uma proteína se liga à cromatina 1,2. A técnica tradicional de ChIP tem o seguinte fluxo de trabalho básico: as células são colhidas e cruzadas (geralmente com formaldeído), a cromatina é ensaboada (geralmente com métodos....
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Protocolo
Declaração ética: Todos os estudos foram aprovados pelo Escritório de Proteção à Pesquisa da Universidade de Pittsburgh.
1. Prepare contas magnéticas
NOTA: Realize antes da triagem celular e segure no gelo até o uso.
- Pipeta 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas misturam chorume por reação a um tubo fresco de microfuça de 1,5 mL e adicionam 850 μL de Buffer de Ligação, pipetando suavemente para misturar.
NOTA: Microesferas paramagnéticas conjugadas pela são contas magnéticas revestidas de lectina que permitem a ligação da membrana lipídica. - Coloque o tubo em um rac....
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Resultados
Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para perfil de proteína unicelular em cromatina usando um formato manual de 96 poços uliCUT&RUN. Embora os resultados variem com base na proteína que está sendo perfilada (devido à abundância de proteínas e qualidade de anticorpos), tipo celular e outros fatores contribuintes, os resultados antecipados para esta técnica são discutidos aqui. A qualidade celular (aparência celular e por cento das células viáveis) e a classificação unicelular devem ser avaliadas antes ou no mom.......
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Discussão
CUT&RUN é um protocolo eficaz para determinar a localização de proteínas na cromatina. Tem muitas vantagens em relação a outros protocolos, incluindo: 1) alta relação sinal-ruído, 2) protocolo rápido e 3) baixa cobertura de leitura de sequenciamento necessária, levando, assim, à redução de custos. O uso de Proteína A- ou Proteína A/G-MNase permite que o CUT&RUN seja aplicado com qualquer anticorpo disponível; portanto, tem o potencial de traçar rapidamente e facilmente muitas proteínas. No entanto, a adaptação a célula ú.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes relacionados a este projeto.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do Laboratório Hainer por lerem e comentarem uma versão anterior deste manuscrito. Este projeto utilizou o NextSeq500 disponível no Núcleo de Sequenciamento de Ciências da Saúde da Universidade de Pittsburgh no UPMC Children's Hospital of Pittsburgh para sequenciamento com agradecimentos especiais ao seu diretor, William MacDonald. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Centro de Computação de Pesquisa da Universidade de Pittsburgh através dos recursos de computador fornecidos. Este trabalho foi apoiado pelo Número de Subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde R35GM133732 (para S.J.H.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microfuga transparentes de 1,5 mL | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| Rack magnético de tubo de 1,5 mL | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| Centrífuga fria compatível com tubo de 1,5 mL | Eppendorf | 5404000537 | |
| placas de cultura de tecidos estéreis de 10 cm | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase | tampão Novo Tubos | B0202S | |
| VWR | 89039-656 | ||
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µ L Tubos de PCR | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X tampão de ligase rápida | New England Biolabs | M2200 | Tampão de ligase |
| 5X KAPA Tampão HiFi | Roche | 7958889001 | 5X tampão de PCR de alta fidelidade |
| 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Rack magnético de 96 poços | ThermoFisher Scientific | 12027 ou 12331D | |
| Placa de 96 poços | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP contas | Beckman Coulter | A63881 | contas de poliestireno-magnetita; Devido à potencial variabilidade entre AMPure XP lotes de cordão, é recomendado que seu AMPure solução de bead ser calibrado. Ver fabricante' s instruções |
| Anticorpo para proteína de interesse | varia | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalina A grânulos Polysciences | 86057-10 | Microesferas paramagnéticas conjugadas com | |
| BSA | |||
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Classificador de células | BD FACSAria II Classificador | Requer treinamento | |
| Meios específicos para células para cultura de células | Varia | ||
| Clorofórmio | ThermoFisher Scientific | C298-500 | O clorofórmio é irritante e prejudicial para a pele se ingerido; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção |
| Computador com processador de 64 bits e acesso a um cluster | Para análises computacionais de conjuntos de dados de sequenciamento resultantes | ||
| Colunas de rotação de DNA | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP conjunto | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| O equipamento de eletroforese | varia | ||
| Etanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol etanol é altamente inflamável; manuseie em um exaustor químico usando luvas, um jaleco, e óculos de proteção |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glicogênio | VWR | 97063-256 | |
| HEPES Fisher Scientific | BP310-500 | Heterólogo | |
| S. cerevisiae DNA spike-in | caseiro | Preparado a partir de DNA genômico extraído em gel reticulado, digerido por MNase e agarose, purificado de proteína/RNA e diluído a 10 ng/mL. Recomendamos DNA genômico de levedura, mas outros organismos podem ser usados, se necessário. | |
| Ácido clorídrico (HCl) | A144-212 | Fisher Scientific | é muito corrosivo; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção |
| Balde de gelo | varia | ||
| Plataforma de sequenciamento Illumina (por exemplo, NextSeq500) | Illumina | ||
| com controle de temperatura e atmosfera | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| Polimerase de DNA de alta fidelidade KAPA HotStart com tampão de alta fidelidade KAPA 5X | Roche | 7958889001 | hotstart polimerase de alta fidelidade |
| Capa de fluxo laminar | Bakery Company | SG404 | |
| Cloreto de manganês (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Conjunto de micropipetas | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Adaptador NEB | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptador |
| NEB Primer universal | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos para kit Illumina | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Primers indexados |
| Anticorpos anticorpo de controle | negativo-ABIN101961 | ||
| on-lineÁgua livre de nuclease | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR termociclador | Eppendorf | 2231000666 | |
| Tubos de bloqueio de fase | Qiagen | 129046 | |
| Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | O fenol é prejudicial se ingerido ou em contato com a pele; manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção |
| Hipoteta de ajuda para solução salina tamponada com fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Drummond | Scientific | # 4-000-100 | |
| Polietilenoglicol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Cloreto de Potássio (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Hidróxido de Potássio (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CUIDADO KOH é um irritante para os olhos / pele como um sólido e corrosivo em solução. Manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção |
| Inibidores de protease | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purificado de pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | Kit de ensaio | ||
| Qubit 1X dsDNA HS | Tubos de ensaio ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase com 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Acetato de Sódio (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Cloreto de Sódio (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Dodecil sulfato de Sódio (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS é venenoso se inalado; manuseie com cuidado em espaços bem ventilados usando luvas, proteção para os olhos e um respirador de grau N95 ao manusear |
| Hidróxido de Sódio (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | O NaOH é um irritante para os olhos / pele como um sólido e corrosivo em solução. Manuseie um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de proteção |
| Espermidina | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Microscópio de luz invertida padrão | Leica | 11526213 | |
| Materiais de gel de agarose de laboratório padrão | Varia | ||
| Materiais de laboratório padrão, como pipetas sorológicas e pontas de pipeta | Varia | ||
| T4 DNA Ligase | Novo Inglaterra Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polimerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Vórtice de mesa | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polimerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternativamente, pode usar um banho-maria |
| Base Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 é perigoso; use um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzima | New England Biolabs | M5505S |
Referências
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A.
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Reimpressões e permissões
