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Artigo de método

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

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DOI:

10.3791/63543

⸱

4 de novembro de 2022

 ,  ,  , 
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

Neste artigo

Aviso de errata

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Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Resumo

A camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) fica imediatamente atrás dos fotorreceptores e abriga um complexo sistema metabólico que desempenha vários papéis críticos na manutenção da função dos fotorreceptores. Assim, a estrutura e função RPE são essenciais para sustentar a visão normal. Este manuscrito apresenta um protocolo estabelecido para o isolamento celular RPE do mouse primário. O isolamento rpe é uma ótima ferramenta para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia RPE nos diferentes modelos de camundongos de distúrbios oculares. Além disso, o isolamento do RPE pode ajudar na comparação de células RPE do camundongo primário isoladas de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, bem como testar drogas que podem acelerar o desenvolvimento da terapia para distúrbios visuais. O manuscrito apresenta um protocolo de isolamento RPE passo a passo; todo o procedimento, desde a enucleação até a semeadura, leva aproximadamente 4 horas. A mídia não deve ser alterada por 5-7 dias após a semeadura, para permitir o crescimento das células isoladas sem perturbação. Esse processo é seguido pela caracterização da morfologia, pigmentação e marcadores específicos nas células por meio da imunofluorescência. As células podem ser passagemdas no máximo três ou quatro vezes.

Introdução

As células de epitélio pigmentado da retina (RPE) estão localizadas entre o coroide e a retina neural, formando uma monocamada simples de células cuboidais que fica atrás das células fotorreceptoras (PR)1. O RPE desempenha um papel fundamental na manutenção de um ambiente saudável para as células de RP, principalmente pela redução do acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e consequente dano oxidativo1. As células RPE supervisionam muitas funções, como a conversão e armazenamento de retinóides, a absorção de luz dispersa, transporte de fluidos e íons, e fagocitose da membrana do segmento externo 2,3 do galpão PR. Alterações no RPE (morfologia/função) podem prejudicar sua função levando à retinopatia e esta é uma característica comum compartilhada por muitos distúrbios oculares4. Muitas doenças oculares estão associadas a alterações na morfologia e função das células RPE, incluindo algumas doenças genéticas como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber e albinismo 4,5,6, bem como distúrbios oculares relacionados à idade, como retinopatia diabética (DR) e degeneração macular relacionada à idade (AMD)7,8 . As células humanas são as mais desejáveis, portanto seria ideal estudar distúrbios de RPE em células RPE humanas primárias para a formação de monocamadas RPE. No entanto, questões éticas e a limitada disponibilidade de doadores humanos devido ao fato de que a maioria desses transtornos levam à morbidade9, mas não necessariamente a mortalidade10, impedindo assim o isolamento das células RPE humanas primárias. Isso torna a cultivo de células RPE de doadores de animais não humanos uma alternativa preferida. Os roedores, particularmente os camundongos, são considerados um grande modelo para estudar diferentes doenças oculares, uma vez que a tecnologia transgênica é mais amplamente estabelecida nestas espécies11. Embora o uso de células RPE primárias cultivadas ofereça muitas vantagens, tem sido difícil manter células em crescimento por muitas passagens, ou armazenar e reutilizar as células. A principal limitação deste protocolo é a idade dos camundongos; camundongos que são usados para o isolamento de RPE devem ser de uma idade muito jovem (18-21 dias de idade é ideal), pois tem sido difícil cultivar células RPE de camundongos adultos 11,12,13. As células RPE podem ser isoladas dos olhos do rato em qualquer idade, porém até quatro passagens celulares só foram bem sucedidas com camundongos jovens (18-21 dias de idade). O isolamento rpe das retinas do camundongo, utilizando tanto camundongos C57BL6 quanto camundongos transgênicos com exclusão dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs) nas células RPE, foi realizado para estudar o efeito da homocisteína de aminoácido elevado no desenvolvimento e progressão da AMD14. Além disso, células primárias de RPE isoladas ajudaram a propor um alvo terapêutico para AMM pela inibição dos NMDARs nas células RPE14. Existem alguns bloqueadores de NMDAR que são aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) e são atualmente usados para tratar confusão moderada a grave (demência) relacionada à doença de Alzheimer (DA), como a memantina16, que poderia ser um alvo terapêutico potencial para a AMD14. Além disso, células de RPE de camundongos primários isolados foram utilizadas para a detecção de marcadores inflamatórios e a indução proposta de inflamação como um mecanismo subjacente para características induzidas por homocisteína de AMD e AD usando um rato geneticamente modificado (CBS), que apresenta um alto nível de homocisteína16,17.

Este protocolo foi usado para isolar células RPE de camundongos tipo selvagem C57BL/6 e camundongos transgênicos desenvolvidos em nosso laboratório como uma adaptação simplificada de outros protocolos de isolamento publicados 13,18,19 para alcançar um protocolo facilmente aplicável e confiável. Não há preferência sexual neste protocolo. Enquanto as idades dos camundongos são fundamentais para o processo de isolamento, camundongos jovens, idosos (18-21 dias) e camundongos mais velhos em qualquer idade (até 12 meses) foram usados para o isolamento de RPE. No entanto, notamos que as células RPE isoladas dos camundongos jovens viviam mais tempo, e até quatro passagens podiam ser realizadas. As células RPE isoladas de camundongos mais velhos poderiam ser passagemdas uma ou duas vezes, então parariam de crescer a uma taxa normal e mudariam sua forma para serem mais alongadas (células semelhantes a fibroblastos). Também foi observada perda de pigmentação e diminuição da adesão à placa de cultura tecidual seguida de descolamento.

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Protocolo

Os animais foram utilizados de acordo com as diretrizes do protocolo animal IACUC da Universidade de Oakland número 21063 e as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.

1. Preparação da solução

  1. Prepare a mídia completa de cultura celular RPE complementando a Mistura de Médio/Nutrientes De Águia Modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) com 25% de Soro Bovino Fetal (FBS), penicilina/estreptomicina de 1,5% e 0,02% gentamicina.
  2. Prepare a enzima A suplementando 741 μL da Solução de Sal Balanceado da Hank (HBSS) com 127 μL de solução de estoque de Colagenase e 132 μL de solução de estoque Hyaluronidase. Isso faz um volume final de 1 mL, que pode tratar quatro olhos.
    1. Prepare a solução de estoque de Collagenase dissolvendo 1 mg de Collagenase de Clostridium histolyticum em 41 mL de HBSS (19,5 unidades /mL).
    2. Prepare a solução de estoque hyaluronidase dissolvendo 1 mg de Hyaluronidase de testículos bovinos em 18,4 mL de HBSS (38 unidades/mL).
  3. Prepare a enzima B adicionando duas partes de 0,25% Trypsin-EDTA a três partes do HBSS. Observe que o volume total depende do número de olhos dissecados; 1 mL de enzima B pode ser usado para tratar quatro olhos.

2. Enucleação

  1. Eutanize eticamente o camundongo usando inalação de dióxido de carbono (CO2) de acordo com as normasIACUC 21.
    1. Brevemente, coloque o animal na câmara de CO2 para introduzir 100% de CO2 com uma taxa de preenchimento de 30%-70% do volume da câmara por minuto com CO2 para alcançar a inconsciência dentro de 2 a 3 minutos, com sofrimento mínimo para os camundongos.
    2. Confirme a morte (falta de respiração e cor dos olhos desbotados), em seguida, mova o rato da gaiola para uma área cirúrgica esterilizada limpa (esfregada com álcool) equipada com equipamento cirúrgico esterilizado.
  2. Coloque o mouse em um subpad estéril.
  3. Enuclear os olhos pressionando pinças estilo 5/45 na área orbital para induzir proptose, seguido por mover a pinça para o posterior do olho. Extrair os olhos, com o nervo óptico intacto, puxando os olhos suavemente da cavidade orbital.
  4. Usando fórceps, submergir os olhos em um tubo de microcentrifuuge de 2 mL contendo 1mL de 5% povidone-iodo. Incubar os olhos à temperatura ambiente por 2-3 minutos.
  5. Retire os olhos da solução povidone-iodo e coloque-os em uma placa de Petri. Usando uma pipeta de transferência estéril, lave os olhos com HBSS até que a cor laranja do povidone-iodo se vá. Isso leva cerca de duas ou três lavagens.
  6. Coloque os olhos em uma nova placa de Petri de 60 mm e submerse-os em mídia de cultura celular RPE completa preparada na etapa 1.1.

3. Dissecção

  1. Sob um microscópio cirúrgico, use pinças estilo M5S e tesouras Vannas para remover o tecido conjuntivo e músculos extraoculares.
    NOTA: A dissecção é feita sob uma capa de tecido em um ambiente completamente estéril. No entanto, para fins de vídeo, o microscópio de dissecação foi colocado fora do capô para obter uma demonstração/filmagem de maior qualidade. Colocar um pequeno pedaço de papel de tecido sem fiapos sob o olho melhora a estabilidade durante a dissecção. Os olhos podem então ser mantidos temporariamente (não por mais de 1 hora) na mídia de cultura celular RPE fria. No entanto, é preferível prosseguir diretamente para o próximo passo imediatamente após a limpeza dos olhos.
  2. Transfira os olhos para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo 1 mL de solução Enzimás uma para cada quatro olhos. Em seguida, incubar os olhos em uma incubadora a 37 °C por 40 min.
  3. Remova os olhos da incubadora e do tubo de microcentrifuuagem. Em seguida, transfira-os para um novo tubo de microcentrifuuge contendo 1 mL de solução Enzimálica B para cada quatro olhos. Incubar o tubo em uma incubadora a 37 °C por 50 min.
  4. Coloque os olhos em um novo prato de cultura de suspensão de 60 mm contendo 10 mL de mídia completa de crescimento celular RPE. Em seguida, incubar os olhos a 4 °C por 30 min.
  5. Coloque o prato sob um microscópio cirúrgico e comece a dissecar.
  6. Remova a parte anterior do olho (córnea, íris e lente) da parte posterior da extremidade ocular (retina posterior).
    1. Segure o olho com fórceps estilo M5S e faça uma incisão na seção ora serrata (a parte mais anterior da retina onde o azul claro termina) com uma lâmina #11 ou a agulha de uma seringa.
    2. Segure a parte interna da incisão com um par de fórceps, e segure a córnea com outro par de fórceps. Comece a puxar lentamente ou rasgar a córnea da retina. Certifique-se de rasgar em pequenos incrementos e mover para baixo a lágrima enquanto remove a córnea, para garantir que o RPE permaneça praticamente intacto e resulte em uma lágrima mais limpa.
      NOTA: Uma vez que a córnea esteja completamente separada, a íris e a lente podem ser vistas.
    3. Separe a córnea e a íris.
  7. Separe a lente da opaia com a suave compressão da metade posterior do olho.
  8. Para remover a retina neural da camada RPE, segure a camada externa da toce com um par de pinças e posicione o braço de um segundo par de pinças entre o RPE e as camadas neurais. A partir daí, puxe suavemente ou retire a retina neural da camada RPE. Descarte a retina neural.
    NOTA: No vídeo, a retina neural e a lente são removidas juntas. No entanto, para iniciantes, será mais fácil remover cada um separadamente. O que resta é o RPE, coroide e esclera.
  9. Descarte a córnea, íris, lente e retina neural. Mova a tosa restante para uma nova área no prato livre de detritos.
  10. Para separar o RPE do choroide e da esclera, raspe suavemente o interior da pácono com pinças estilo 5/45 para garantir a separação das células RPE. As células RPE aparecem nubladas quando suspensas na mídia completa de crescimento celular RPE.
  11. Aspire as células usando uma pipeta de transferência estéril de 3,2 mL e transfira para um novo tubo de centrífuga de 15 mL contendo mídia completa de crescimento celular RPE.

4. Centrifugação

  1. Coloque o tubo de centrífugas de 15 mL contendo células RPE primárias dentro de uma centrífuga e centrifugar as células a 300 x g por 10 minutos à temperatura ambiente.
  2. Aspire o supernatante e resuspense a pelota com 10 mL de mídia completa de crescimento RPE. A mídia completa de crescimento de RPE é mais específica para o crescimento de RPE do que outras células contaminantes, como células Müller ou células endoteliais choroidais. As células Müller requerem alta mídia de glicose, enquanto as células endoteliais choroidais requerem fatores específicos de crescimento. Ao mudar a mídia e passar a cultura, apenas as células RPE continuarão a crescer.

5. Cultura celular

  1. Emplaque as células RPE primárias resuspendadas em uma placa de Petri estéril de 100 mm e transfira-as para uma incubadora (depois de verificar a pureza por células de coloração com marcadores celulares RPE/Müller específicos, conforme indicado na Figura 1E-N). Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.
    NOTA: Os marcadores utilizados são mencionados na Tabela de Materiais. Essa etapa é realizada após a criação da cultura.
  2. Incubar as células por cerca de 5 dias para crescer. Durante esse tempo, não mude a mídia, perturbe as células ou mova a placa de cultura celular (este é um passo crítico no protocolo; após o isolamento, as células devem ser incubadas e não serem perturbadas por 5 dias).
    NOTA: O número de células depende do número de olhos usados para o isolamento. Um maior número de olhos isolados produzirá um maior número de células. O isolamento rpe de dois olhos renderá ~ 440.000-880.000 células, ou 5%-10% da placa de Petri de 100 mm, que pode conter 8,8 milhões de células.

6. Passaging

  1. Aspire a mídia e lave com 2 mL de PBS. Em seguida, aspirar para fora o PBS.
  2. Adicione 4 mL de 0,25% Trypsin-EDTA (1x), ou o suficiente para cobrir a base do prato. Incubar por 5-10 min em temperatura ambiente.
  3. Adicione 8 mL de mídia RPE pré-aquecida ou o dobro do volume de quanta trippsina foi usada na etapa 6.2. Em seguida, colete as células e coloque-as em um tubo de centrífuga de 15 mL.
  4. Centrífuga a 300 x g por 7 min a temperatura ambiente. Aspire o supernatante e resuspenda a pelota em 10 mL de mídia completa de cultura celular RPE. Emplaque toda a suspensão em uma placa de Petri estéril de 100 mm.
    NOTA: As células podem ser passagemdas até quatro ou cinco vezes18. No entanto, os resultados mais consistentes do experimento são encontrados após duas ou três passagens. Após duas ou quatro passagens, as células mudaram sua forma (como mostrado na Figura 1D) para ser mais alongada, acumulada no meio da placa, parou de crescer e se desprendeu.
  5. Utilize protocolos de imunofluorescência, conforme os métodos publicados anteriormente 8,14,15,16, para manchar e validar a especificidade do RPE.

7. Imunofluorescência

NOTA: A imunofluorescência foi realizada de acordo com os métodos publicados anteriormente 8,14,15,16,17,18 para manchar e validar a especificidade do RPE. A coloração das células RPE primárias foi tipicamente feita nas passagens P1 e P2. Aqui, uma breve visão geral do protocolo imunofluorescente é apresentada.

  1. Seme as células em um slide de câmara de cultura celular (30.000 células por poço para o slide de câmara de 8 poços).
  2. Cultuam as células em mídia completa de cultura celular RPE a 37 °C e 5% de CO2 para 24-48 h.
  3. Quando as células estiverem 80%-90% confluentes, aspire a mídia e lave o slide da câmara com 1x PBS.
  4. Corrija o slide com 4% de paraformaldeído por 10-15 min.
  5. Aspire o paraformaldeído de 4% e depois bloqueie com solução de bloqueio (ver Tabela de Materiais).
  6. Aspire a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário, RPE65, e incubar por três horas a 37 °C (com uma concentração de anticorpos variando de 1:200-1:250 no buffer de bloqueio, a um volume de 150-200 μL/slide). Em seguida, lave três vezes com PBS/TX-100 (5-10 min cada lavagem).
  7. Aspire o anticorpo primário e adicione o anticorpo secundário (com uma concentração de anticorpos 1:1.000 no buffer de bloqueio, a um volume de 150-200 μL/slide). Incubar por uma hora a 37 °C.
  8. Aspire o anticorpo secundário. Lave três vezes com PBS/Trtion X-100 (5-10 min cada lavagem).
  9. Adicione uma gota de meio de montagem DAPI para rotular os núcleos e coloque uma mancha de cobertura sobre o slide. Certifique-se de que não há bolhas sob o deslizamento de tampas.
  10. Em seguida, tire imagens com um microscópio fluorescente, acompanhado de uma câmera de microscópio de alta resolução (HRM) e software de processamento de imagem (ver Tabela de Materiais).

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Resultados

Validação da especificidade, pureza e função/formação de barreiras de células RPE isoladas
As células isoladas foram examinadas sob um microscópio leve para verificar sua viabilidade, morfologia e pigmentação. Imagens de P0 e P1 (Figura 1A,B) e imagens de P0 e P4 foram capturadas (Figura 1C,D) para mostrar as mudanças nas células; forma, tamanho e pigmentação à medida que as passagens avançavam para a quarta passagem (setas pr...

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Discussão

O protocolo atual é um procedimento detalhado relatado, modificado e simplificado para o isolamento de RPE a partir de olhos de rato. O protocolo inclui enucleação, dissecção, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células RPE isoladas dos olhos do rato.

Existem algumas limitações e passos críticos que devem ser cumpridos para o isolamento bem sucedido de RPE, como a idade dos ratos, o número de olhos dissecados, o tamanho da placa ou prato da cultura tecidual, e cuidados após a semead...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse em declarar que são relevantes para o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Olhos (NEI), Instituto Nacional de Olhos (NEI) do Fundo R01 EY029751-04

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Copo : 100mLKIMAX14000
Colagenase de Clostridium histolyticum Sigma-AldrichC7657-25MGPara enzima de trabalho, Pipetas
de Transferência Graduada Descartáveis :3.2mL Estéril13-711-20
DMEM/F12  gibco 11330Meios para cultivar células RPE 
Soro bovino fetal (FBS)gibco26140079Para meios de cultura de células RPE completos
Solução de reagente de gentamicinagibco15750-060Para meios de cultura de células RPE completos
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)Thermo Scientific88284Para enzimas de trabalho (A& B) 
Heracell VISO 160i Incubadora de CO2Thermo Scientific50144906
Hialuronidase de testículos bovinosSigma-AldrichH3506-500MGPara trabalhar a enzima A
KimwipesKimberly-Clark34155
Seringa Luer-Lok com agulha anexada 21 G x 1 1/2 pol., estéril, uso único, 3 mLB-D309577
Micro Tubo de Centrífuga: 2 mLAnticorpo11L819
 Abcam, Cambridge, MA, EUAab78036Para coloração IF 
Caneta Strepgibco15140-122Para meios de cultura de células RPE completos
Pinças de ação positiva, estilo 5/45Dumont72703-DZ
Tesoura Íris Padrão Reta 11,5cmGARANA INDUSTRIES2595
Centrífuga Sorvall St8 ThermoScientific75007200
Stemi 305 MicroscópioZeissn/a
Lâmina Cirúrgica, #11, Aço InoxidávelBard-Parker371211
Suspensão Prato de Cultura 60mm x 15mm EstiloCorning430589
Prato de Cultura de Tecidos: 100x20mm estiloCorning353003
Tubos de Tornado: 15mLTubos de Tornado MidsciC15B
: 50mLMidsciC50R
Tripsina EDTA (1x) 0.25% gibco2186962Para trabalhar a enzima B
Pinças 5MS, 8.2cm, Retas, 0.09x0.05mm PontasPinças Dumont501764
Ação Positiva Estilo 5, Biológico, Dumostar, Acabamento Polido, 110 mm OALMicroscopia Eletrônica Ciências Dumont50-241-57
Underpads, Moderado: 23" X 36"McKesson4033
Tesoura de Mola Vannas - 2.5mm Cutting EdgeFST15000-08
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissn/a
monoclonal anti-RPE65 de camundongo Grainger

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

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This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).

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