Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.
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Artigo de método
Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário
Neste artigo
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Resumo
Resumo
A camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) fica imediatamente atrás dos fotorreceptores e abriga um complexo sistema metabólico que desempenha vários papéis críticos na manutenção da função dos fotorreceptores. Assim, a estrutura e função RPE são essenciais para sustentar a visão normal. Este manuscrito apresenta um protocolo estabelecido para o isolamento celular RPE do mouse primário. O isolamento rpe é uma ótima ferramenta para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia RPE nos diferentes modelos de camundongos de distúrbios oculares. Além disso, o isolamento do RPE pode ajudar na comparação de células RPE do camundongo primário isoladas de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, bem como testar drogas que podem acelerar o desenvolvimento da terapia para distúrbios visuais. O manuscrito apresenta um protocolo de isolamento RPE passo a passo; todo o procedimento, desde a enucleação até a semeadura, leva aproximadamente 4 horas. A mídia não deve ser alterada por 5-7 dias após a semeadura, para permitir o crescimento das células isoladas sem perturbação. Esse processo é seguido pela caracterização da morfologia, pigmentação e marcadores específicos nas células por meio da imunofluorescência. As células podem ser passagemdas no máximo três ou quatro vezes.
Introdução
As células de epitélio pigmentado da retina (RPE) estão localizadas entre o coroide e a retina neural, formando uma monocamada simples de células cuboidais que fica atrás das células fotorreceptoras (PR)1. O RPE desempenha um papel fundamental na manutenção de um ambiente saudável para as células de RP, principalmente pela redução do acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e consequente dano oxidativo1. As células RPE supervisionam muitas funções, como a conversão e armazenamento de retinóides, a absorção de luz dispersa, transporte de fluidos e íons, e fagocitose da membrana do segmento externo
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Protocolo
Os animais foram utilizados de acordo com as diretrizes do protocolo animal IACUC da Universidade de Oakland número 21063 e as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.
1. Preparação da solução
- Prepare a mídia completa de cultura celular RPE complementando a Mistura de Médio/Nutrientes De Águia Modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) com 25% de Soro Bovino Fetal (FBS), penicilina/estreptomicina de 1,5% e 0,02% gentamicina.
- Prepare a enzima A suplementando 741 μL da Solução de Sal Balanceado da Hank (HBSS) com 127 μL de solução de estoque de Colagenase e 132 μL....
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Resultados
Validação da especificidade, pureza e função/formação de barreiras de células RPE isoladas
As células isoladas foram examinadas sob um microscópio leve para verificar sua viabilidade, morfologia e pigmentação. Imagens de P0 e P1 (Figura 1A,B) e imagens de P0 e P4 foram capturadas (Figura 1C,D) para mostrar as mudanças nas células; forma, tamanho e pigmentação à medida que as passagens avançavam para a quarta passagem (setas pr.......
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Discussão
O protocolo atual é um procedimento detalhado relatado, modificado e simplificado para o isolamento de RPE a partir de olhos de rato. O protocolo inclui enucleação, dissecção, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células RPE isoladas dos olhos do rato.
Existem algumas limitações e passos críticos que devem ser cumpridos para o isolamento bem sucedido de RPE, como a idade dos ratos, o número de olhos dissecados, o tamanho da placa ou prato da cultura tecidual, e cuidados após a semead.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse em declarar que são relevantes para o conteúdo deste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Olhos (NEI), Instituto Nacional de Olhos (NEI) do Fundo R01 EY029751-04
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copo : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Colagenase de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | Para enzima de trabalho, Pipetas |
| de Transferência Graduada Descartáveis :3.2mL Estéril | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Meios para cultivar células RPE |
| Soro bovino fetal (FBS) | gibco | 26140079 | Para meios de cultura de células RPE completos |
| Solução de reagente de gentamicina | gibco | 15750-060 | Para meios de cultura de células RPE completos |
| Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | Para enzimas de trabalho (A& B) |
| Heracell VISO 160i Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hialuronidase de testículos bovinos | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | Para trabalhar a enzima A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Seringa Luer-Lok com agulha anexada 21 G x 1 1/2 pol., estéril, uso único, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Tubo de Centrífuga: 2 mL | Anticorpo | 11L819 | |
| Abcam, Cambridge, MA, EUA | ab78036 | Para coloração IF | |
| Caneta Strep | gibco | 15140-122 | Para meios de cultura de células RPE completos |
| Pinças de ação positiva, estilo 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Tesoura Íris Padrão Reta 11,5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Centrífuga Sorvall St8 ThermoScientific | 75007200 | ||
| Stemi 305 Microscópio | Zeiss | n/a | |
| Lâmina Cirúrgica, #11, Aço Inoxidável | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspensão Prato de Cultura 60mm x 15mm Estilo | Corning | 430589 | |
| Prato de Cultura de Tecidos: 100x20mm estilo | Corning | 353003 | |
| Tubos de Tornado: 15mL | Tubos de Tornado Midsci | C15B | |
| : 50mL | Midsci | C50R | |
| Tripsina EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | Para trabalhar a enzima B |
| Pinças 5MS, 8.2cm, Retas, 0.09x0.05mm Pontas | Pinças Dumont | 501764 | |
| Ação Positiva Estilo 5, Biológico, Dumostar, Acabamento Polido, 110 mm OAL | Microscopia Eletrônica Ciências Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderado: 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Tesoura de Mola Vannas - 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Referências
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 80....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
