Method Article

Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman

DOI:

10.3791/63547

⸱

April 21st, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.

Abstract

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Visualizar um vasto escopo de biomarcadores específicos em tecidos desempenha um papel vital na exploração das intrincadas organizações de sistemas biológicos complexos. Assim, tecnologias de imagem altamente multiplexadas têm sido cada vez mais apreciadas. Aqui, descrevemos uma plataforma emergente de imagem vibracional altamente multiplexada de proteínas específicas com sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão através de imagens eletrônicas de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes raman semelhantes ao arco-íris. Este método contorna o limite de canais espectralmente solucionáveis na imunofluorescência convencional e fornece uma abordagem óptica de um tiro para interrogar vários marcadores em tecidos com resolução subcelular. É geralmente compatível com preparações de tecidos padrão, incluindo tecidos fixos paraformaldeído, tecidos congelados e tecidos humanos fixos de parafina (FFPE). Prevemos que esta plataforma fornecerá uma imagem mais abrangente das interações proteicas de espécimes biológicos, particularmente para tecidos intactos espessos. Este protocolo fornece o fluxo de trabalho desde a preparação de anticorpos até a coloração da amostra de tecido, ao conjunto de microscópios SRS, à imagem de tecido epr-SRS.

Introduction

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Sistemas complexos de tecidos são compostos de subpopulações celulares distintas cujos locais espaciais e redes de interação estão profundamente entrelaçados com suas funções e disfunções 1,2. Para revelar a arquitetura tecidual e interrogar sua complexidade, o conhecimento dos locais espaciais das proteínas na resolução unicelular é essencial. Assim, tecnologias altamente multiplexadas de imagem de proteína têm sido cada vez mais apreciadas e podem se tornar uma pedra angular para estudar biologia tecidual 3,4,5. Os ....

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Protocol

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O protocolo foi conduzido de acordo com o protocolo experimental animal (AC-AABD1552) aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia.

1. Preparação de anticorpos conjugados por Raman-corante

  1. Prepare o tampão de conjugação como ~0,1 M NaHCO3 em tampão PBS, pH = 8,3, armazenar a 4 °C.
  2. Prepare a solução de sonda MARS (Material Suplementar) com função N-hidroxisuccinimidy (NHS) como 3 mM em DMSO anidro. A síntese das sondas MARS pode ser referida a relatórios anteriores 13,17,18.

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Results

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A Figura 3 mostra exemplos de imagens de epr-SRS em diferentes amostras, incluindo células fixas (Figura 3A), paraformaldeído (PFA) tecidos de camundongos fixos (Figura 3B) e amostras humanas parafina fixas em formalina (FFPE) (Figura 3C). A resolução espacial da microscopia SRS é limitada à difração, a resolução lateral típica é de ~300 nm, e a resolução axial é de 1-2 μm usando luz quase infravermelha.......

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Discussion

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Aqui, apresentamos o protocolo imuno-eprSRS que é amplamente aplicável aos tipos de tecidos comuns, incluindo tecidos de camundongos recém-preservados, tecidos humanos FFPE e tecidos de camundongos congelados. O imuno-eprSRS foi validado para um painel de epítopos em células e tecidos, conforme listado na Tabela 1. Esta plataforma de um tiro é particularmente adequada para aplicações onde estratégias cíclicas não funcionam bem. Por exemplo, a fluorescência cíclica é exigente para tecidos grossos, pois vá.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ruth A. Singer e Richard K.P. Benninger por fornecer tecidos de pâncreas de rato. A W.M. reconhece o suporte do NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) e exército dos EUA (W911NF-19-1-0214).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldeído,Microscopia Eletrônica15710
&alfa;-tubulinaAbcamab18251Anticorpos primários
&alfa;-tubulinaBioLegend625902Anticorpos
primáriosβ-III-tubulinaBioLegend657402Anticorpos
primáriosβ-III-tubulinaAbcamab41489Anticorpos primários
β-tubulinaAbcamab131205Anticorpos primários
Agarose, baixa temperatura de gelllingSigma AldrichA9414Para incorporação cerebral
Anticorpo anti-a-tubulina produzido em coelho (&alfa;-tubulina)Abcamab52866Anticorpos primários
Anticorpo anti-Calbindina produzido em camundongo (Calbindina)Abcamab82812Anticorpos primários
Anti-receptor GABA B R2  anticorpo produzido em cobaia (receptor GABA B R2)Millipore SigmaAB2255Anticorpos primários
Anti-GFAP produzido em cabra (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598Anticorpos primários
Anti-Glucagon  anticorpo produzido em camundongo (Glucagon)Santa Cruz Biotechnologysc-514592Anticorpos primários
Anticorpo anti-insulina produzido em cobaias (insulina)DAKOIR00261-2Anticorpos primários
Anticorpo anti-MBP produzido em rato (MBP)Abcamab7349Anticorpos primários
Anticorpo anti-NeuN produzido em coelho (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639Anticorpos
primáriosAnticorpo antipeptídico pancreático (PP) produzido em cabra - Polipeptídeo pancreático (PP)Sigma AldrichSAB2500747Anticorpos primários
Anticorpo anti-Pdx1 produzido em coelho (Pdx1)Milipore06-1379Anticorpos primários
Anticorpo anti-somatostatina produzido em rato (Somatostatina)Abcamab30788Anticorpos primários
Anticorpo anti-vimentina produzido em frango ( Vimentin)Abcamab24525Anticorpos primários
Filtro passa-bandaKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm TerminatorMini CircuitosCabo BNC STRM-50
Cabo BNCThorlabs2249-C, BNC Macho / Macho
Espelho dielétrico de banda largaMouses ThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
C57BL/6JCondensadorde Centrífuga
LaboratoryImersão emóleo Olympus, 1.4 N.A.
Citoqueratina 18Abcamab7797Anticorpos primários
Citoqueratina 18Abcamab24561Anticorpos primários
Fonte de alimentação DCTopWard6302DA tensão de polarização é de 64 V
Montagem dicróicaThorlabsKM100CLMontagem cinemática para até 1,3" (33 mm) de altura Óptica retangular, Burro canhoto
anti-Frango IgY (H+L)Jackson ImmunoResearch703-005-155Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Goat IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-005-147Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-cobaia IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch706-005-148Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Mouse IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-005-151Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Rabbit IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch711-005-152Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Rato IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch712-005-153Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Sheep IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch713-005-147Secundário anticorpos para conjugação MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcam ab71916Anticorpos primários
EtanolSigma Aldrich443611
Amplificador de visualização rápidaZurich InstrumentsHF2LIDC - 50 MHz
FFPE Amostra de rimUSBiomaxHuFPT072
FibrilarinaAbcamab5821Anticorpos primários
GiantinAbcamab24586Anticorpos primários
GlucagonSanta Cruz Biotechnologysc-514592Anticorpos primários
H2BAbcamab1790Anticorpos primários
HeLaATCCATCC CCL-2
Filtro passa-banda de alto diâmetro externoChroma TecnologiaET890/220mFiltre o feixe de Stokes e transmita o feixe da bomba
Caneta hidrofóbicaFisher ScientificNC1384846
InsulinaThermoFisher701265Anticorpos
primários Sistema integrado de laser SRSFísica Aplicada & Eletrônica, Inc.picoEMERALDO picoEMERALD fornece um trem de pulso de saída a 1.064 nm com largura de pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz, que serve como feixe de Stokes. O feixe de frequência dobrada a 532 nm é usado para semear de forma síncrona um oscilador paramétrico óptico de picossegundo (OPO) para produzir um trem de pulso de modo bloqueado com largura de pulso de cinco ~ 6 ps (o feixe intermediário do OPO é bloqueado com um filtro interferométrico). O comprimento de onda de saída do OPO é ajustável a partir de 720– 950 nm, que serve como feixe da bomba. A intensidade do feixe de Stokes de 1.064 nm é modulada senoidalmente por um EOM embutido a 8 MHz com uma profundidade de modulação de mais de 90%. O feixe da bomba é espacialmente sobreposto ao feixe de Stokes usando um espelho dicróico dentro do picoEMERALD. A sobreposição temporal entre a bomba e os trens de pulso Stokes é alcançada com um estágio de atraso embutido e otimizada pelo sinal SRS de D2O puro no microscópio.
Microscópio de varredura a laser invertidoOlympusFV1200MPE
Montagem de espelho cinemáticoThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Ajustadores Hexagonais de Perfil Baixo
Lectina de Triticum vulgaris (trigo)Sigma AldrichL0636-5 mg
Divisor de feixe dicróico de longa passagemSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine  divisor de feixe dicróico plano a laser de borda única
MAP2BioLegend801810Anticorpos primários
Software de imagem microscópicaOlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanPara análises de pequeno volume baseadas em absorbância em um leitor de placas.
Soro normal de burroJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-Well Dishes FisherScientific12-566-300
Lente objetivaOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, distância de trabalho =  2  mm
pincel
ThorlabsRS99inclui as unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" e garfo de fixação.
Medidor
Leitor de placasTecanInfinite 200 PROUm leitor de placas multimodo fácil de usar. Capacidades de medição de absorbância em uma faixa espectral de 230 1000 nm.
Reagente antidesbotamento ProLong GoldThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900Anticorpos primários
Sephadex G-25 MédioGE Life Sciences17-0033-01resina de filtração em gel para dessalinização e troca de tampão
Caixa blindada com conectores BNCPomona Electronics2902Caixa de Alumínio Com Tampa, BNC Fêmea/Fêmea
Si fotodiodoThorlabsFDS1010350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Área Ativa
Sinapsina 2ThermoFisherOSS00073GAnticorpos primários
Caminho do tecido Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813Lâmina adesiva para atrair e unir quimicamente seções de tecido fresco ou fixado em formalina firmemente à superfície da lâmina (tiisue lâminas de vidro de ligação)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomeLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069Anticorpos primários
XilenosSigma Aldrich214736
de Grau EM Ciências 000664 Jackson Montagem de periscópio de de pH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al.

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