Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman

Resumo

A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.

Resumo

Visualizar um vasto escopo de biomarcadores específicos em tecidos desempenha um papel vital na exploração das intrincadas organizações de sistemas biológicos complexos. Assim, tecnologias de imagem altamente multiplexadas têm sido cada vez mais apreciadas. Aqui, descrevemos uma plataforma emergente de imagem vibracional altamente multiplexada de proteínas específicas com sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão através de imagens eletrônicas de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes raman semelhantes ao arco-íris. Este método contorna o limite de canais espectralmente solucionáveis na imunofluorescência convencional e fornece uma abordagem óptica de um tiro para interrogar vários marcadores em tecidos com resolução subcelular. É geralmente compatível com preparações de tecidos padrão, incluindo tecidos fixos paraformaldeído, tecidos congelados e tecidos humanos fixos de parafina (FFPE). Prevemos que esta plataforma fornecerá uma imagem mais abrangente das interações proteicas de espécimes biológicos, particularmente para tecidos intactos espessos. Este protocolo fornece o fluxo de trabalho desde a preparação de anticorpos até a coloração da amostra de tecido, ao conjunto de microscópios SRS, à imagem de tecido epr-SRS.

Introdução

Sistemas complexos de tecidos são compostos de subpopulações celulares distintas cujos locais espaciais e redes de interação estão profundamente entrelaçados com suas funções e disfunções ^1,2. Para revelar a arquitetura tecidual e interrogar sua complexidade, o conhecimento dos locais espaciais das proteínas na resolução unicelular é essencial. Assim, tecnologias altamente multiplexadas de imagem de proteína têm sido cada vez mais apreciadas e podem se tornar uma pedra angular para estudar biologia tecidual ^3,4,5. Os métodos atuais de imagem de proteína multiplexada comum podem ser classificados em duas categorias principais. Uma delas é a imagem de imunofluorescência em série que se baseia em múltiplas rodadas de coloração e imagem de tecido, e a outra é a citometria de massa de imagem juntamente com anticorpos marcados por metais pesados 6,7,8,9,10,11,12.

Aqui, uma estratégia alternativa para imagens proteicas baseadas em anticorpos multiplexados é introduzida. Ao contrário da modalidade de imagem de fluorescência predominante, que só pode visualizar 4-5 canais simultaneamente devido à ampla excitação e espectros de emissão (largura total à metade do máximo (FWHM) ~500 ^cm-1), a microscopia raman exibe largura de linha espectral muito mais estreita (FWHM ~10 ^cm-1) e, portanto, fornece multiplexidade escalável. Recentemente, aproveitando o espectro estreito, um novo esquema de microscopia raman chamado pré-ressonância eletrônica estimulada pela microscopia de dispersão de Raman (epr-SRS) foi desenvolvido, fornecendo uma estratégia poderosa para imagens multiplexadas¹³. Ao sondar os modos vibracionais acoplados eletronicamente dos corantes Raman, o epr-SRS consegue um efeito de aprimoramento drástico de 10¹³ vezes nas seções transversais de Raman e supera o gargalo de sensibilidade da microscopia Raman convencional (Figura 1A)13,14,15. Como resultado, o limite de detecção de epr-SRS foi empurrado para sub-μM, o que permite à detecção de Raman de marcadores moleculares interessantes, como proteínas específicas e organelas dentro das células^13,16. Em particular, utilizando anticorpos conjugados por raman, a imagem epr-SRS de proteínas específicas em células e tecidos (chamadas imuno-eprSRS) foi demonstrada com sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão (Figura 1B)^13,17. Ao ajustar o comprimento de onda da bomba em apenas 2 nm, o sinal epr-SRS estará completamente desligado (Figura 1B), que apresenta alto contraste vibracional.

No lado da sonda, um conjunto de sondas Raman semelhantes ao arco-íris chamadas manhattan Raman scattering dyes (MARS) foi desenvolvido para conjugação de anticorpos 13,18,19,20. Esta paleta raman única consiste em novos corantes com laços triplos conjugados π (Material Suplementar), cada um exibindo um pico único e estreito epr-SRS na faixa espectral raman bioortogonal (Figura 1C). Modificando a estrutura do cromoforeiro central e editando isotopicamente ambos os átomos da ligação tripla (Material Suplementar), sondas Raman separadas espectralmente foram desenvolvidas. Aproveitando a multiplexidade escalável, a microscopia epr-SRS juntamente com a paleta de corante MARS oferece uma estratégia óptica para imagens de proteína multiplex de um tiro em células e tecidos.

O Immuno-eprSRS fornece uma estratégia alternativa aos métodos atuais de imagem de proteína multiplex com forças únicas. Em comparação com abordagens de fluorescência com coloração cíclica, imagem e remoção de sinal, esta plataforma baseada em Raman garante coloração e imagem de uma rodada. Portanto, contorna a complexidade prática em procedimentos cíclicos e simplifica em grande parte o protocolo, abrindo assim novos territórios de imagem de proteína multiplexada. Por exemplo, aproveitando um protocolo de limpeza de tecido sob medida raman-dye, o imuno-eprSRS foi estendido para três dimensões para mapeamento de proteínas altamente multiplexadas em tecidos intactos espessos¹⁷. Mais de 10 alvos de proteína foram visualizados ao longo de tecidos cerebrais de camundongos^{de espessura milimétrica 17}. Mais recentemente, acoplamento do imuno-eprSRS com um protocolo otimizado de microscopia de expansão de retenção de biomolécula (ExM)^{protocolo 21}, imagens nanoescala de um tiro de vários alvos também foram demonstradas²². Em comparação com a espectroscopia de massa de imagem ^4,9, a epr-SRS é não destrutiva e tem capacidade de secção intrinsecamente óptica. Além disso, o EPR-SRS é mais eficiente no escaneamento de tecidos. Normalmente, uma região de tecido de 0,25 mm² com um tamanho de pixel de 0,5 μm leva apenas alguns minutos para ser imagem para um único canal epr-SRS. Por exemplo, o tempo total de imagem de quatro canais SRS mais quatro canais de fluorescência na Figura 4 é de cerca de 10 minutos.

Protocolo

O protocolo foi conduzido de acordo com o protocolo experimental animal (AC-AABD1552) aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia.

1. Preparação de anticorpos conjugados por Raman-corante

1. Prepare o tampão de conjugação como ~0,1 M NaHCO₃ em tampão PBS, pH = 8,3, armazenar a 4 °C.
2. Prepare a solução de sonda MARS (Material Suplementar) com função N-hidroxisuccinimidy (NHS) como 3 mM em DMSO anidro. A síntese das sondas MARS pode ser referida a relatórios anteriores 13,17,18.
   NOTA: Para fins de armazenamento, a solução de éster NHS de corante deve ser protegida contra luz e mantida a -20 °C.
3. Dissolva os sólidos de anticorpos no tampão de conjugação a uma concentração de 2 mg/mL. Para anticorpos que são dissolvidos em outros buffers, troque-os no tampão de conjugação para uma concentração de 1-2 mg/mL com filtros centrífugas.
   NOTA: Anticorpos secundários altamente transversais são preferidos para coloração multiplex para minimizar a reatividade entre espécies. Os anticorpos secundários utilizados estão listados na Tabela 1 e Tabela de Materiais.
4. Faça a reação de conjugação.
   1. Para anticorpos secundários, adicione 15 vezes o excesso molar da solução de corante à solução de anticorpos em um frasco de vidro lentamente com agitação. Por exemplo, em solução de anticorpos de 0,5 mL 2 mg/mL, adicione 35 μL 3 mM de solução de corante.
   2. Incubar a mistura de reação à temperatura ambiente (RT) com agitação por 1h. Proteja a reação da luz.
5. Purificação.
   1. Prepare o chorume da resina de filtragem de gel (Tabela de Materiais) no buffer PBS, seguindo as etapas 1.5.2-1.5.4.
   2. Adicione 10 mL de pó de resina de filtragem de gel em 40 mL de tampão PBS dentro de um tubo de 50 mL.
   3. Mantenha a solução em um banho de água de 90 °C por 1h.
   4. Decante o supernatante e re-adicione PBS a 40 mL. Guarde o chorume a 4 °C.
   5. Embale a coluna de exclusão de tamanho (1 cm de diâmetro, colunas de fluxo de gravidade) com a solução de chorume até a altura de 10-15 cm.
   6. Enxágüe e lave a coluna com ~10 mL de tampão PBS para embalar ainda mais a resina.
   7. Encobre a mistura de reação conjugal (~0,5 mL) à coluna. Adicione imediatamente 1 mL de tampão PBS como o tampão de eluição quando toda a mistura de reação estiver carregada. Rechee constantemente o tampão de eluição (PBS) na coluna.
   8. Colete o eluado da solução conjugada olhando para a cor na coluna (corantes MARS têm cores verde-azul claras) ou medindo a absorvância a 280 nm (A280).
6. Concentre a solução coletada em 1-2 mg/mL com um filtro centrífuga.
7. Determine a concentração e o grau médio de rotulagem (DOL, razão corante-proteína) medindo o espectro ultravioleta-visível (UV-Vis) da solução conjugada com um leitor de placas Nano.
   NOTA: O material suplementar fornece propriedades de sísteres NHS de corante MARS para cálculo. O DOL normal para o anticorpo secundário é em torno de 3.

2. Preparação da amostra de tecido

1. Paraformaldeído consertou tecidos cerebrais do rato.
   1. Anestesiar os camundongos (C57BL/6J, Feminino, 25 d pós-natal) com isoflurane. Avalie a anestesia adequada com um teste de beliscão do dedo do dedo do dedo.
   2. Mate os ratos por deslocamento cervical. Perfume os camundongos imediatamente com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS transcardialmente.
   3. Colete o cérebro do rato, seguindo as etapas 2.1.4-2.1.5
   4. Corte para cima do tronco cerebral ao longo da sutura sagital. Descasque as duas metades do crânio para o lado e retire o cérebro com uma pinça.
   5. Fixar o cérebro coletado em 4% de PFA em PBS a 4 °C por 24 h. Em seguida, lave o cérebro no tampão PBS a 4 °C por 24 horas para remover o excesso de PFA.
   6. Coloque uma agarose sólida na água para uma concentração final de 7% (w/v) em um béquer, com uma tampa solta. Mexa a solução com uma haste de vidro. Aqueça o chorume no micro-ondas até que a solução esteja clara.
   7. Deixe a agarose esfriar a 45-55 °C.
   8. Despeje o líquido em uma pequena câmara, depois transfira o cérebro da PBS para a ágarose líquida e oriente-o com uma espátula para incorporar o cérebro. Espere o bloco de agarose de tecido endurecer.
   9. Selar o tecido-agrose em fatias coronais de 40-μm de espessura usando um vibratome.
   10. Transfira o tecido para uma placa de 4 poços para as seguintes manchas. Remova a ágarose com uma pinça. Lave o tecido com 1 mL de PBS, três vezes.
2. Tecidos de pâncreas congelados fixos.
   1. Fixar o pâncreas do mouse em 4% pfa em PBS a 4 °C com balanço por 16-20 h.
   2. Lave a amostra em 1 mL de PBS (4 °C) três vezes para remover o PFA.
   3. Incorpore a amostra (~0,3-0,5 cm de tamanho) em blocos compostos de temperatura de corte ideal (OCT). Coloque 2 gotas de OCT em um criomold plástico. Coloque o tecido na orientação correta e despeje OCT em cima de tecidos até que nenhum dos tecidos permaneça exposto.
   4. Se sectionie a pancreata a fatias de 8-μm de espessura e imobilize-as em uma lâmina de vidro de ligação de tecido, armazene-as em -80 °C.
   5. Antes de colorir, equilibre a amostra para RT. Lave o tecido com PBS para remover blocos OCT.
3. Amostras de FFPE.
   1. Asse o deslizamento do tecido FFPE a 60 °C por 10 minutos.
   2. Desparaffinização e reidratação: Coloque amostras sequencialmente nas seguintes soluções em um tubo de 50 mL em RT por 3 minutos cada vez com leve agitação:
      xileno duas vezes,
      etanol duas vezes,
      95% (vol/vol) etanol em água desionizada duas vezes,
      70% (vol/vol) etanol em água desionizada duas vezes,
      50% (vol/vol) etanol em água desionizada uma vez,
      água deionizada uma vez.
   3. Transfira a amostra para citrato de sódio de 20 mM (pH 8.0) a 100 °C em um frasco de vidro. Certifique-se de que os tecidos estão imersos na solução.
   4. Coloque o frasco em um banho de água de 60 °C por 45 min.
   5. Lave a amostra com água deionizada em RT por 5 minutos.

3. Coloração de imuno-eprSRS de tecido

1. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um limite em torno das seções teciduais na lâmina.
   NOTA: Um frasco de coloração de lâminas é usado para seguir as etapas de incubação do tecido na lâmina. Os tecidos flutuantes (seções cerebrais de camundongos de 40 μm de espessura) estão manchados em placas de poços.
2. Incubar os tecidos com 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 em PBS) por 10 minutos.
3. Incubar os tecidos com tampão de bloqueio (5% de soro de burro, 0,5% Triton X-100 em PBS) por 30 min.
4. Prepare a solução primária de coloração: adicione todos os anticorpos primários a 200-500 μL de tampão de coloração (2% de soro de burro, 0,5% Triton X-100 em PBS) nas concentrações desejadas. Centrifugar a solução de coloração primária a 13.000 x g por 5 min. Use apenas o supernatante se precipitar a forma.
5. Incubar o tecido na solução de anticorpos primários a 4 °C por 1-2 dias.
   NOTA: Para colorar seções de tecido no slide, coloque a amostra em uma caixa de coloração com um lenço umedecido para manter a umidade.
6. Lave os slides três vezes com 0,3-0,5% PBST na RT por 5 min cada. Use 1 mL PBST para tecidos flutuantes. Para os tecidos na lâmina, lave as lâminas em um frasco de coloração de lâminas e certifique-se de que os tecidos estão todos imersos na solução.
7. Incubar o tecido em 200-500 μL de tampão de bloqueio por 30 minutos.
8. Prepare a solução de coloração secundária: adicione todos os anticorpos secundários (e lectinas, se necessário) a 200-500 μL de tampão de coloração com concentrações desejadas (normalmente 10 μg/mL). Centrifugar a solução de coloração secundária a 13.000 x g por 5 min. Use apenas o supernatante se precipitar a forma.
9. Incubar os tecidos em 200-500 μL de solução de anticorpos secundários a 4 °C por 1-2 dias.
10. Lave os slides duas vezes com 0,3-0,5% PBST na RT por 5 min cada.
11. Incubar com 200-500 μL de solução DAPI por 30 min.
12. Lave os slides três vezes com PBS no RT por 5 minutos cada.
13. Para seções de tecido flutuante, transfira-os para lâminas de vidro com uma pipeta de queda de vidro. Espalhe o tecido com uma escova de tecido e limpe o ambiente com lenços umedecidos, se necessário.
14. Monte o tecido em uma gota de reagentes antifade com uma mancha de vidro e fixe-o com esmalte.

4. Montagem de microscópio SRS

NOTA: Um sistema comercial de fluorescência consorciação é usado em imagens de srs-fluorescência em conjunto. Mais descrições podem ser encontradas em um relatório anterior¹⁷. Este protocolo se concentrará no lado de imagem SRS usando excitação de banda estreita.

1. Prepare uma mesa óptica isolada de vibração em uma sala com controle de temperatura.
2. Coloque um sistema de laser duplo sincronizado (bomba e Stokes) na tabela óptica (Figura 2A) com um refrigerador conectado.
   NOTA: O laser fundamental no sistema de laser duplo fornece um trem de pulso de saída a 1064 nm com largura de pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz. O raio Stokes é do laser fundamental. A intensidade do feixe de Stokes foi modulada sinusoidely por um modulador de amplitude eletro-óptica incorporado (EOM) a 8 MHz com uma profundidade de modulação de mais de 90%. A outra parte do laser fundamental é dobrada de frequência para 532 nm, que é ainda mais usada para sincronizar uma semente de picosegundos oscilador óptico (OPO) para produzir um trem de pulso bloqueado no modo com 5-6 ps de largura de pulso (o feixe ocler do OPO é bloqueado com um filtro interferométrico). O comprimento de onda de saída do OPO é t impossibilitado de 720-950 nm, que serve como o feixe da bomba.
3. Monte os espelhos (faixa de comprimento de onda: 750-1100 nm), divisores de feixedicróico (DBS, filtro de passagem longa de 980 nm, retangular) e lente (acrático, revestimento AR para 650-1050 nm) para suas respectivas montagens. Use suportes de espelho muito estável para os espelhos e divisores de feixedicróicos.
4. Meça a altura da saída de laser e os tamanhos dos feixes da bomba e dos feixes de Stokes. Ajuste a altura dos espelhos e lentes para garantir que a luz atinja o centro de todos os elementos ópticos.
5. Coloque o espelho M1 na mesa óptica e faça ~45° à saída do laser (Figura 2B). Use os botões na montagem cinemática para fazer ajustes de ponta e inclinação. Certifique-se de que a luz viaja na mesma altura ao longo do comprimento da mesa e uma linha reta em relação à mesa.
6. Coloque e alinhe os divisores de feixedicróicos (filtros de passagem longa de 980 nm) e espelhos para dividir a bomba e os feixes de Stokes (Figura 2A-B).
7. Coloque e alinhe pares de lentes (L1, L2 e L3, L4) em cada um dos caminhos do feixe para colidir os feixes e expandir os diâmetros do feixe para combinar com a pupila traseira do objetivo (Figura 2A-B).
8. Use espelhos M7 e M8 para alinhar feixes de laser combinados no microscópio (Figura 2C). Alinhe um feixe no microscópio primeiro e use os pares de espelhos no outro feixe para garantir a sobreposição espacial dos dois feixes.
9. Configure a parte de detecção.
   1. Coloque um condensador de óleo revestido de infravermelho (1.4-NA) para coletar a bomba para a frente e os feixes de Stokes depois de passar pelas amostras (Figura 2C).
   2. Monte um fotodiodo Si de grande área em uma caixa blindada com conectores BNC (Figura 2E). Adicione uma fonte de alimentação DC de 64 V ao fotodiodo montado para aumentar seu limiar de saturação e largura de banda de resposta.
   3. Reflita a luz para a frente com um espelho de 2 polegadas. Refoce novamente a luz no fotodiodo após um filtro óptico para bloquear o feixe de Stokes modulador (Figura 2D).
   4. Envie a corrente de saída do fotodiodo para um amplificador de travamento rápido terminado com 50 para demodulação de sinal. Envie um gatilho de 8 MHz para o amplificador de travamento como sinal de referência.
   5. Envie o componente X em fase de fase do amplificador lock-in para a caixa de interface analógica do microscópio.
10. Otimize a sobreposição temporal com o estágio de atraso motorizado embutido medindo o sinal SRS de líquido D₂O puro no microscópio.

5. Aquisição e análise de imagens

1. Execute imagens epr-SRS multicanais com ajuste de comprimento de onda da bomba sequencial.
   1. Definir potência laser para _bomba P = 10-40 mW e P_Stokes = 40-80 mW no painel de controle a laser.
   2. Defina o tempo de moradia dos pixels para 2-4 μs e use vários quadros em média 10-20 quadros no software de microscopia.
      NOTA: Evite um uso combinatório de alta potência laser (_bomba P> 40 mW, P_Stokes> 80 mW) e tamanho de pixel pequeno (<0,2 μm), o que provavelmente causa o "efeito branqueamento" dos corantes Raman devido à excitação multifotol.
   3. Defina as constantes de tempo do amplificador de travamento para metade do tempo de moradia do pixel.
2. Espectral linear desmcomprando.
   NOTA: o epr-SRS segue uma estrita dependência linear de sinal-concentração ao longo de toda a faixa de concentração; assim, o descompramento espectral linear é eficaz para remover quaisquer possíveis conversas cruzadas entre os canais. Para a medição epr-SRS do canal N com sondas N MARS, os sinais medidos (S) podem ser expressos como S = MC, onde C é a concentração da sonda MARS, e M é uma matriz N x N determinada por seções transversais de Raman das sondas MARS.
   1. Meça a matriz M em amostras de imuno-eprSRS de cor única rotuladas com diferentes sondas MARS.
   2. Equação de uso C = M−1· S para determinar a matriz de concentração da sonda MARS com medição de sinal amostral multiplex S.

Resultados

A Figura 3 mostra exemplos de imagens de epr-SRS em diferentes amostras, incluindo células fixas (Figura 3A), paraformaldeído (PFA) tecidos de camundongos fixos (Figura 3B) e amostras humanas parafina fixas em formalina (FFPE) (Figura 3C). A resolução espacial da microscopia SRS é limitada à difração, a resolução lateral típica é de ~300 nm, e a resolução axial é de 1-2 μm usando luz quase infravermelha...

Discussão

Aqui, apresentamos o protocolo imuno-eprSRS que é amplamente aplicável aos tipos de tecidos comuns, incluindo tecidos de camundongos recém-preservados, tecidos humanos FFPE e tecidos de camundongos congelados. O imuno-eprSRS foi validado para um painel de epítopos em células e tecidos, conforme listado na Tabela 1. Esta plataforma de um tiro é particularmente adequada para aplicações onde estratégias cíclicas não funcionam bem. Por exemplo, a fluorescência cíclica é exigente para tecidos grossos, pois vá...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% Paraformaldeído,	Microscopia Eletrônica	15710
&alfa;-tubulina	Abcam	ab18251	Anticorpos primários
&alfa;-tubulina	BioLegend	625902	Anticorpos
primáriosβ-III-tubulina	BioLegend	657402	Anticorpos
primáriosβ-III-tubulina	Abcam	ab41489	Anticorpos primários
β-tubulina	Abcam	ab131205	Anticorpos primários
Agarose, baixa temperatura de gellling	Sigma Aldrich	A9414	Para incorporação cerebral
Anticorpo anti-a-tubulina produzido em coelho (&alfa;-tubulina)	Abcam	ab52866	Anticorpos primários
Anticorpo anti-Calbindina produzido em camundongo (Calbindina)	Abcam	ab82812	Anticorpos primários
Anti-receptor GABA B R2  anticorpo produzido em cobaia (receptor GABA B R2)	Millipore Sigma	AB2255	Anticorpos primários
Anti-GFAP produzido em cabra (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Anticorpos primários
Anti-Glucagon  anticorpo produzido em camundongo (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticorpos primários
Anticorpo anti-insulina produzido em cobaias (insulina)	DAKO	IR00261-2	Anticorpos primários
Anticorpo anti-MBP produzido em rato (MBP)	Abcam	ab7349	Anticorpos primários
Anticorpo anti-NeuN produzido em coelho (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Anticorpos
primáriosAnticorpo antipeptídico pancreático (PP) produzido em cabra - Polipeptídeo pancreático (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Anticorpos primários
Anticorpo anti-Pdx1 produzido em coelho (Pdx1)	Milipore	06-1379	Anticorpos primários
Anticorpo anti-somatostatina produzido em rato (Somatostatina)	Abcam	ab30788	Anticorpos primários
Anticorpo anti-vimentina produzido em frango ( Vimentin)	Abcam	ab24525	Anticorpos primários
Filtro passa-banda	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuitos	Cabo BNC STRM-50
Cabo BNC	Thorlabs	2249-C	, BNC Macho / Macho
Espelho dielétrico de banda larga	Mouses Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J	Condensador	de Centrífuga
Laboratory	Imersão em		óleo Olympus, 1.4 N.A.
Citoqueratina 18	Abcam	ab7797	Anticorpos primários
Citoqueratina 18	Abcam	ab24561	Anticorpos primários
Fonte de alimentação DC	TopWard	6302D	A tensão de polarização é de 64 V
Montagem dicróica	Thorlabs	KM100CL	Montagem cinemática para até 1,3" (33 mm) de altura Óptica retangular, Burro canhoto
anti-Frango IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Goat IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-cobaia IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Rabbit IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Rato IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Anticorpos secundários para conjugação de MARS
Burro anti-Sheep IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secundário anticorpos para conjugação MARS
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam ab71916	Anticorpos primários
Etanol	Sigma Aldrich	443611
Amplificador de visualização rápida	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Amostra de rim	USBiomax	HuFPT072
Fibrilarina	Abcam	ab5821	Anticorpos primários
Giantin	Abcam	ab24586	Anticorpos primários
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticorpos primários
H2B	Abcam	ab1790	Anticorpos primários
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
Filtro passa-banda de alto diâmetro externo	Chroma Tecnologia	ET890/220m	Filtre o feixe de Stokes e transmita o feixe da bomba
Caneta hidrofóbica	Fisher Scientific	NC1384846
Insulina	ThermoFisher	701265	Anticorpos
primários Sistema integrado de laser SRS	Física Aplicada & Eletrônica, Inc.	picoEMERALD	O picoEMERALD fornece um trem de pulso de saída a 1.064 nm com largura de pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz, que serve como feixe de Stokes. O feixe de frequência dobrada a 532 nm é usado para semear de forma síncrona um oscilador paramétrico óptico de picossegundo (OPO) para produzir um trem de pulso de modo bloqueado com largura de pulso de cinco ~ 6 ps (o feixe intermediário do OPO é bloqueado com um filtro interferométrico). O comprimento de onda de saída do OPO é ajustável a partir de 720– 950 nm, que serve como feixe da bomba. A intensidade do feixe de Stokes de 1.064 nm é modulada senoidalmente por um EOM embutido a 8 MHz com uma profundidade de modulação de mais de 90%. O feixe da bomba é espacialmente sobreposto ao feixe de Stokes usando um espelho dicróico dentro do picoEMERALD. A sobreposição temporal entre a bomba e os trens de pulso Stokes é alcançada com um estágio de atraso embutido e otimizada pelo sinal SRS de D2O puro no microscópio.
Microscópio de varredura a laser invertido	Olympus	FV1200MPE
Montagem de espelho cinemático	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Ajustadores Hexagonais de Perfil Baixo
Lectina de Triticum vulgaris (trigo)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Divisor de feixe dicróico de longa passagem	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine  divisor de feixe dicróico plano a laser de borda única
MAP2	BioLegend	801810	Anticorpos primários
Software de imagem microscópica	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		Para análises de pequeno volume baseadas em absorbância em um leitor de placas.
Soro normal de burro	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes Fisher	Scientific	12-566-300
Lente objetiva	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, distância de trabalho =  2  mm
pincel
	Thorlabs	RS99	inclui as unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" e garfo de fixação.
Medidor
Leitor de placas	Tecan	Infinite 200 PRO	Um leitor de placas multimodo fácil de usar. Capacidades de medição de absorbância em uma faixa espectral de 230 1000 nm.
Reagente antidesbotamento ProLong Gold	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Anticorpos primários
Sephadex G-25 Médio	GE Life Sciences	17-0033-01	resina de filtração em gel para dessalinização e troca de tampão
Caixa blindada com conectores BNC	Pomona Electronics	2902	Caixa de Alumínio Com Tampa, BNC Fêmea/Fêmea
Si fotodiodo	Thorlabs	FDS1010	350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Área Ativa
Sinapsina 2	ThermoFisher	OSS00073G	Anticorpos primários
Caminho do tecido Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Lâmina adesiva para atrair e unir quimicamente seções de tecido fresco ou fixado em formalina firmemente à superfície da lâmina (tiisue lâminas de vidro de ligação)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Anticorpos primários
Xilenos	Sigma Aldrich	214736