A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.
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Artigo de método
Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman
Neste artigo
Resumo
Resumo
Visualizar um vasto escopo de biomarcadores específicos em tecidos desempenha um papel vital na exploração das intrincadas organizações de sistemas biológicos complexos. Assim, tecnologias de imagem altamente multiplexadas têm sido cada vez mais apreciadas. Aqui, descrevemos uma plataforma emergente de imagem vibracional altamente multiplexada de proteínas específicas com sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão através de imagens eletrônicas de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes raman semelhantes ao arco-íris. Este método contorna o limite de canais espectralmente solucionáveis na imunofluorescência convencional e fornece uma abordagem óptica de um tiro para interrogar vários marcadores em tecidos com resolução subcelular. É geralmente compatível com preparações de tecidos padrão, incluindo tecidos fixos paraformaldeído, tecidos congelados e tecidos humanos fixos de parafina (FFPE). Prevemos que esta plataforma fornecerá uma imagem mais abrangente das interações proteicas de espécimes biológicos, particularmente para tecidos intactos espessos. Este protocolo fornece o fluxo de trabalho desde a preparação de anticorpos até a coloração da amostra de tecido, ao conjunto de microscópios SRS, à imagem de tecido epr-SRS.
Introdução
Sistemas complexos de tecidos são compostos de subpopulações celulares distintas cujos locais espaciais e redes de interação estão profundamente entrelaçados com suas funções e disfunções 1,2. Para revelar a arquitetura tecidual e interrogar sua complexidade, o conhecimento dos locais espaciais das proteínas na resolução unicelular é essencial. Assim, tecnologias altamente multiplexadas de imagem de proteína têm sido cada vez mais apreciadas e podem se tornar uma pedra angular para estudar biologia tecidual 3,4,5. Os ....
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Protocolo
O protocolo foi conduzido de acordo com o protocolo experimental animal (AC-AABD1552) aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia.
1. Preparação de anticorpos conjugados por Raman-corante
- Prepare o tampão de conjugação como ~0,1 M NaHCO3 em tampão PBS, pH = 8,3, armazenar a 4 °C.
- Prepare a solução de sonda MARS (Material Suplementar) com função N-hidroxisuccinimidy (NHS) como 3 mM em DMSO anidro. A síntese das sondas MARS pode ser referida a relatórios anteriores 13,17,18.
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Resultados
A Figura 3 mostra exemplos de imagens de epr-SRS em diferentes amostras, incluindo células fixas (Figura 3A), paraformaldeído (PFA) tecidos de camundongos fixos (Figura 3B) e amostras humanas parafina fixas em formalina (FFPE) (Figura 3C). A resolução espacial da microscopia SRS é limitada à difração, a resolução lateral típica é de ~300 nm, e a resolução axial é de 1-2 μm usando luz quase infravermelha.......
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Discussão
Aqui, apresentamos o protocolo imuno-eprSRS que é amplamente aplicável aos tipos de tecidos comuns, incluindo tecidos de camundongos recém-preservados, tecidos humanos FFPE e tecidos de camundongos congelados. O imuno-eprSRS foi validado para um painel de epítopos em células e tecidos, conforme listado na Tabela 1. Esta plataforma de um tiro é particularmente adequada para aplicações onde estratégias cíclicas não funcionam bem. Por exemplo, a fluorescência cíclica é exigente para tecidos grossos, pois vá.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ruth A. Singer e Richard K.P. Benninger por fornecer tecidos de pâncreas de rato. A W.M. reconhece o suporte do NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) e exército dos EUA (W911NF-19-1-0214).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 16% Paraformaldeído, | Microscopia Eletrônica | 15710 | |
| &alfa;-tubulina | Abcam | ab18251 | Anticorpos primários |
| &alfa;-tubulina | BioLegend | 625902 | Anticorpos |
| primáriosβ-III-tubulina | BioLegend | 657402 | Anticorpos |
| primáriosβ-III-tubulina | Abcam | ab41489 | Anticorpos primários |
| β-tubulina | Abcam | ab131205 | Anticorpos primários |
| Agarose, baixa temperatura de gellling | Sigma Aldrich | A9414 | Para incorporação cerebral |
| Anticorpo anti-a-tubulina produzido em coelho (&alfa;-tubulina) | Abcam | ab52866 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-Calbindina produzido em camundongo (Calbindina) | Abcam | ab82812 | Anticorpos primários |
| Anti-receptor GABA B R2 anticorpo produzido em cobaia (receptor GABA B R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Anticorpos primários |
| Anti-GFAP produzido em cabra (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Anticorpos primários |
| Anti-Glucagon anticorpo produzido em camundongo (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-insulina produzido em cobaias (insulina) | DAKO | IR00261-2 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-MBP produzido em rato (MBP) | Abcam | ab7349 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-NeuN produzido em coelho (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Anticorpos |
| primáriosAnticorpo antipeptídico pancreático (PP) produzido em cabra - Polipeptídeo pancreático (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-Pdx1 produzido em coelho (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-somatostatina produzido em rato (Somatostatina) | Abcam | ab30788 | Anticorpos primários |
| Anticorpo anti-vimentina produzido em frango ( Vimentin) | Abcam | ab24525 | Anticorpos primários |
| Filtro passa-banda | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuitos | Cabo BNC STRM-50 | |
| Cabo BNC | Thorlabs | 2249-C | , BNC Macho / Macho |
| Espelho dielétrico de banda larga | Mouses Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J | Condensador | de Centrífuga | |
| Laboratory | Imersão em | óleo Olympus, 1.4 N.A. | |
| Citoqueratina 18 | Abcam | ab7797 | Anticorpos primários |
| Citoqueratina 18 | Abcam | ab24561 | Anticorpos primários |
| Fonte de alimentação DC | TopWard | 6302D | A tensão de polarização é de 64 V |
| Montagem dicróica | Thorlabs | KM100CL | Montagem cinemática para até 1,3" (33 mm) de altura Óptica retangular, Burro canhoto |
| anti-Frango IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Anticorpos secundários para conjugação de MARS |
| Burro anti-Goat IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Anticorpos secundários para conjugação de MARS |
| Burro anti-cobaia IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Anticorpos secundários para conjugação de MARS |
| Burro anti-Mouse IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Anticorpos secundários para conjugação de MARS |
| Burro anti-Rabbit IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Anticorpos secundários para conjugação de MARS |
| Burro anti-Rato IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Anticorpos secundários para conjugação de MARS |
| Burro anti-Sheep IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secundário anticorpos para conjugação MARS |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam ab71916 | Anticorpos primários | |
| Etanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Amplificador de visualização rápida | Zurich Instruments | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE Amostra de rim | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrilarina | Abcam | ab5821 | Anticorpos primários |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Anticorpos primários |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Anticorpos primários |
| H2B | Abcam | ab1790 | Anticorpos primários |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| Filtro passa-banda de alto diâmetro externo | Chroma Tecnologia | ET890/220m | Filtre o feixe de Stokes e transmita o feixe da bomba |
| Caneta hidrofóbica | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulina | ThermoFisher | 701265 | Anticorpos |
| primários Sistema integrado de laser SRS | Física Aplicada & Eletrônica, Inc. | picoEMERALD | O picoEMERALD fornece um trem de pulso de saída a 1.064 nm com largura de pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz, que serve como feixe de Stokes. O feixe de frequência dobrada a 532 nm é usado para semear de forma síncrona um oscilador paramétrico óptico de picossegundo (OPO) para produzir um trem de pulso de modo bloqueado com largura de pulso de cinco ~ 6 ps (o feixe intermediário do OPO é bloqueado com um filtro interferométrico). O comprimento de onda de saída do OPO é ajustável a partir de 720– 950 nm, que serve como feixe da bomba. A intensidade do feixe de Stokes de 1.064 nm é modulada senoidalmente por um EOM embutido a 8 MHz com uma profundidade de modulação de mais de 90%. O feixe da bomba é espacialmente sobreposto ao feixe de Stokes usando um espelho dicróico dentro do picoEMERALD. A sobreposição temporal entre a bomba e os trens de pulso Stokes é alcançada com um estágio de atraso embutido e otimizada pelo sinal SRS de D2O puro no microscópio. |
| Microscópio de varredura a laser invertido | Olympus | FV1200MPE | |
| Montagem de espelho cinemático | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Ajustadores Hexagonais de Perfil Baixo |
| Lectina de Triticum vulgaris (trigo) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Divisor de feixe dicróico de longa passagem | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine divisor de feixe dicróico plano a laser de borda única |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Anticorpos primários |
| Software de imagem microscópica | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | Para análises de pequeno volume baseadas em absorbância em um leitor de placas. | |
| Soro normal de burro | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes Fisher | Scientific | 12-566-300 | |
| Lente objetiva | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, distância de trabalho = 2 mm |
| pincel | |||
| Thorlabs | RS99 | inclui as unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" e garfo de fixação. | |
| Medidor | |||
| Leitor de placas | Tecan | Infinite 200 PRO | Um leitor de placas multimodo fácil de usar. Capacidades de medição de absorbância em uma faixa espectral de 230 1000 nm. |
| Reagente antidesbotamento ProLong Gold | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Anticorpos primários |
| Sephadex G-25 Médio | GE Life Sciences | 17-0033-01 | resina de filtração em gel para dessalinização e troca de tampão |
| Caixa blindada com conectores BNC | Pomona Electronics | 2902 | Caixa de Alumínio Com Tampa, BNC Fêmea/Fêmea |
| Si fotodiodo | Thorlabs | FDS1010 | 350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Área Ativa |
| Sinapsina 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Anticorpos primários |
| Caminho do tecido Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Lâmina adesiva para atrair e unir quimicamente seções de tecido fresco ou fixado em formalina firmemente à superfície da lâmina (tiisue lâminas de vidro de ligação) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Anticorpos primários |
| Xilenos | Sigma Aldrich | 214736 |
Referências
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al.
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Reimpressões e permissões
