Artigo de método
* These authors contributed equally
Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.
Abertura dinâmica de poros de fusão e fechamento mediam exocitese e endocitose e determinam sua cinética. Aqui, é demonstrado em detalhes como a microscopia confocal foi usada em combinação com a gravação de grampo de remendo para detectar três modos de fusão em células adrenal adrenal de cultura primária. Os três modos de fusão incluem 1) fusão de perto (também chamada de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) estadia-fusão, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento do perfil de forma Ω gerada por fusão até que se funda completamente na membrana plasmática.
Para detectar esses modos de fusão, a membrana plasmática foi rotulada pela superexpressão mNeonGreen anexada ao domínio PH de fosfolipase C δ (PH-mNG), que se liga ao fosfaticicylinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) no folheto voltado para o citosol da membrana plasmática; vesículas foram carregadas com o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 para detectar a liberação de conteúdo vesicular; e Atto 655 foi incluído na solução de banho para detectar o fechamento de poros de fusão. Estas três sondas fluorescentes foram imagens simultaneamente a ~20-90 ms por quadro em células de cromaffin ao vivo para detectar abertura de poros de fusão, liberação de conteúdo, fechamento de poros de fusão e mudanças de tamanho vesícula. O método de análise é descrito para distinguir três modos de fusão dessas medidas de fluorescência. O método aqui descrito pode, em princípio, aplicar-se a muitas células secretas além das células cromafinas.
A fusão de membranas media muitas funções biológicas, incluindo transmissão sináptica, homeostase de glicemia, resposta imune e entrada viral 1,2,3. A excitose, envolvendo a fusão vesícula na membrana plasmática, libera neurotransmissores e hormônios para alcançar muitas funções importantes, como atividades da rede neuronal. Fusion abre um poro para liberar conteúdo vesicular, após o qual o poro pode fechar para recuperar a vesícula fusível, que é chamada de beijo e fuga 1,4. Tanto a abertura irreversível quanto a rev....
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NOTA: O procedimento de uso animal seguiu as diretrizes do NIH e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIH.
1. Cultura celular cromafina bovina
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Seguindo os procedimentos experimentais mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células cromafinas das glândulas suprarrenais bovinas foram transfectadas com PH-mNG para rotular a membrana plasmática; O A655 foi adicionado à solução de banho para detectar o fechamento dos poros de fusão; e o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 foi carregado em vesículas para detecção de liberação. Em seguida, a imagem de timelapse confocal de plano XY de FFN511, PH-mNG e A65.......
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Um método de imagem microscópica confocal é descrito para detectar a dinâmica da liberação de poros de fusão e transmissor, bem como três modos de fusão, fusão de perto, fusão de estadia e redução de fusão em células adrenalrnafina bovina 4,24. Um método eletrofisiológico para despolarizar a célula e, assim, evocar exo-e endocitose é descrito. O processamento sistemático de imagens confocal fornece informações sobre diferentes modos de comportamentos de poros par.......
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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecemos aos Programas de Pesquisa Intramuros do NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) por apoiarem este trabalho.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sal de magnésio de adenosina 5'-trifosfato | Sigma | A9187-500MG | ATP para preparação de solução interna |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto corante para rotular solução de banho |
| Nucleofector básico para neurônios primários | Lonza | VSPI-1003 | Tampão de transfecção de eletroporação junto com kit |
| Pipeta de vidro capilar boroscilicado | Warner Instrumentos | 64-0795 | Parede padrão com filamento OD=2.0 mm ID=1.16 mm Comprimento=7.5 cm |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A2153-50G | Reagente para digestão de glândulas |
| Cloreto de Cálcio 2 M | Qualidade Biológica | 351-130-721 | Reagente para preparar solução de banho |
| Filtros de Células, 100 µ m | Falcon | 352360 | Material para filtragem de suspensão de células cromafins |
| Solução de hidróxido de césio | Reagente | Sigma 232041 | para preparação de solução interna e tampão de estoque Cs-glutamato / Cs-EGTA |
| Colagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzima para digestão da glândula |
| Lamínula | Neuvitro | GG-14-Laminina | GG-14-Laminina, 14 mm de diâmetro # 1 de espessura 60 peças Laminina lamínulas alemãs revestidas |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagente para preparação de Locke' s solução e solução de banho |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagente para preparação de meio de cultura |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagente para preparação de tampão de estoque Cs-EGTA para solução de banho |
| Electroporação e Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Plasmídeos transfectados em células |
| Soro fetal bovino | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagente para preparar o meio de cultura |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Neurotransmissor falso fluorescente para rotular vesículas |
| Guanosina 5'-trifosfato de sal de sódio hidrato | Sigma | G8877-250MG | GTP para preparar solução interna |
| HEPES | Sigma H3375-500G | Reagente para preparar Locke' Igor | |
| Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software para análise de patch-clamp e apresentação de dados de imagem |
| Software Leica Application Suite X | Leica | LAS X | Software confocal para coleta e análise de dados de imagem |
| Leica TCS SP5 Microscópio confocal de varredura a laser Leica | Leica TCS SP5 | Microscópio confocal para coleta | |
| de dados de imagemÁcido L-glutâmico | Sigma | 49449-100G | Reagente para preparação de tampão de estoque de Cs-glutamato para solução de banho |
| Amplificador de bloqueio | Heka | Lock-in | Software para registro de capacitância |
| Cloreto de magnésio 1 M | Qualidade Biológica | 351-033-721EA | Reagente para preparação de solução interna e solução de banho |
| Hemacitômetro metalizado Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Câmara de contagem |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Pipetas polonesas para melhorar a formação e estabilidade de selos de giga-ohm Unidade de Filtro de |
| Seringa Millex-GP, 0.22 µ m | Millipore | SLGPR33RB | Material para lavagem e digestão de glândulas |
| mNG (mNeonGreen) | Alelo Biotecnologia | ABP-FP-MNEONSB | Modelo para construção PH-mNeonGreen |
| Tela de filtragem de malha de nylon 100 mícrons | EIKO filtrando co | 03-100/32 | Material para suspensão de medula filtrante |
| Braçadeira de remendo EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplificador para dados de patch-clamp coleção |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone para construção PH-mNeonGreen |
| Extrator de pipetas | Sutter Instrument | P-97 | Faça pipetas para gravação de patch-clamp |
| Cloreto de potássio | Sigma | P5404-500G | Reagente para preparação de Locke' s solução e solução de banho |
| Software de pulso | Heka | Software de pulso | para coleta de dados de patch-clamp |
| Câmara de gravação | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | câmara de lamínula, aplique pipeta de patch-clamp em células vivas |
| Cloreto de sódio | Sigma | S7653-1KG | Reagente para preparação de Locke' s solução, solução de banho e solução interna |
| Hidróxido de sódio | Sigma | S5881-500G | Reagente para preparação de Locke' s solução |
| Fosfato de sódio dibásico | Sigma | S0876-500G | Reagente para preparação de Locke' s solução |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma | S8282-500G | Reagente para preparação de Locke' Placa |
| quente de agitação | Barnsted/Thermolyne | tipo 10100 | Aquecedor para revestimento de pipeta com cera |
| Seringa, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material para lavagem e digestão de glândulas |
| Cloreto de tetraetilamônio | Sigma | T2265-100G | TEA para preparação de solução de banho |
| Inibidor de tripsina | Sigma | T9253-5G | Reagente para digestão de glândulas |
| Líquido de imersão tipo F | Leica | 195371-10-9 | Óleo de montagem confocal Leica |
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