O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.
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Artigo de método
Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários
Neste artigo
Resumo
Resumo
As feridas na córneas embrionárias do pintinho apresentam uma capacidade notável de se regenerarem totalmente e rapidamente, enquanto as córneas feridas adultas experimentam uma perda de transparência devido a cicatrizes fibrosas. A integridade tecidual das córneas embrionárias feridas é intrinsecamente restaurada sem formação detectável de cicatrizes. Dada a sua acessibilidade e facilidade de manipulação, o embrião de filhotes é um modelo ideal para estudar o reparo da ferida córnea sem cicatrizes. Este protocolo demonstra os diferentes passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para acessar o olho. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas. Terceiro, feridas lineares de córnea que penetram na camada epitelial externa e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir. Estudos até o momento usando este modelo revelaram que as córneas embrionárias feridas exibem ativação da diferenciação de ceratocitos, passam por remodelação coordenada de proteínas ECM à sua macroestrutura tridimensional nativa e tornam-se adequadamente re-inervadas por nervos sensoriais córneas. No futuro, o impacto potencial de fatores endógenos ou exógenos no processo regenerativo poderia ser analisado na cura de córneas usando técnicas de biologia do desenvolvimento, como enxerto de tecido, eletroporação, infecção retroviral ou implantação de contas. A estratégia atual identifica o filhote embrionário como um paradigma experimental crucial para elucidar os fatores moleculares e celulares que coordenam a cicatrização da ferida córnea.
Introdução
A córnea é o tecido transparente, mais externo do olho que transmite e refrata a luz propícia à acuidade visual. Na córnea adulta, danos ou infecções no estroma córnea leva a uma resposta rápida e robusta de cicatrização de feridas caracterizada pela proliferação de ceratocitos, fibrose, aumento da inflamação que leva à apoptose induzida por citocina, geração de miofibroblasts de reparação e remodelação geral da matriz extracelular (ECM)1,2 . Após a lesão, tal reparação do tecido córnea resulta em tecido cicatrizado opaco que reduz a transparência da córnea e oclui a passagem da luz, distorcendo assim a visão ....
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Protocolo
A variedade de ovos usados neste protocolo foi White Leghorn, e todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Wesleyan de Illinois.
1. Incubação de ovos de pintinhos
- Mantenha os ovos a ~10 °C por até 1 semana depois que eles são colocados para parar o desenvolvimento. Quando estiver pronto para iniciar o desenvolvimento de embriões de filhotes, limpe toda a casca de ovo com lenços sem fiapos (ver Tabela de Materiais) saturados com água de temperatura ambiente para remover sujeira e detritos.
- Certifique-se de que a ca....
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Resultados
Após a dissecação anterior do ACM e cam em E5.5 para expor a região craniana do embrião em desenvolvimento, uma série de lacerações que abrangeram a córnea central E7 foi feita em ovo (Figura 1). Uma ferida ideal para estudar a regeneração da córnea ocorre após três lacerações, cada uma feita no mesmo local da córnea. A primeira laceração atravessa o epitélio córnea, enquanto a segunda e terceira lacerações penetram na membrana do porão subjacente e no estroma anterior, respectivame.......
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Discussão
O filhote é um sistema modelo ideal para estudar o reparo da ferida da córnea fetal e sem cicatrizes. Ao contrário dos mamíferos, o filhote é facilmente acessível durante todo o desenvolvimento usando em estratégias ovo8 ou ex ovo 24. A córnea de pintinho embrionário é muito maior que as córneas de roedores, com quase 50% do volume craniano dedicado ao olho25, tornando-a altamente favorável a manipulações físicas como ferimentos. Al.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes em relação às informações apresentadas neste manuscrito.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Desenvolvimento Artístico e Acadêmico através da Universidade Wesleyan de Illinois para a TS e financiado em parte pelo NIH-R01EY022158 (PL).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha hipodérmica de 18 G | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| Faca de microdissecação angular de 30 graus | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sondas Moleculares | D1306 | |
| Seringa de 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor marcado com anticorpos | secundáriosCloreto | ||
| cálcio di-hidratado (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Bandejas para ovos de galinha | GQF | O246 | |
| Pinça de dissecação, ponta fina, serrilhada | VWR | 82027-408 | |
| Tesoura de dissecação, ponta afiada | VWR | 82027-578 | |
| Íris 1 x 2 Tecido de dentes Fórceps, curvatura completa | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Tesoura de microdissecação | VWR | 470315-228 | |
| Antifibronectina de rato (IgG1) | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | B3/D6 | |
| Antilaminina de rato (IgG1) | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | 3H11 | |
| Β-tubulina β-específica para antineurônios de camundongo (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Antitenascina de camundongo (IgG1) | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | M1-B4 | |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127 | |
| Penicilina/estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Incubadora de ovos Sportsman 1502 | GQF | 1502 | |
| Embalagem de rasgo à mão (largura de 1,88 polegadas) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P.
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Reimpressões e permissões
