Usando uma injeção de rastreador de células para investigar a origem de células formadoras de neointima em um modelo de parede lateral saccular de rato

A hemorragia subaracnóide causada pela ruptura de um aneurisma intracraniano (IA) é uma condição neurocirúrgica devastadora associada à alta morbidade e mortalidade 1,2,3,4. Além do recorte microcirúrgico, que fornece contato direto entre endotélio endotélio endotélio, os dispositivos endovasculares ganharam cada vez mais importância nas últimas décadas para o tratamento de IAs rompidas e descobertas incidentalmente. A resposta de cura em IAs tratadas endovascularmente depende principalmente da formação de neointima e da organização do trombo. Ambos são processos sinérgicos, dependendo da migração celular do vaso adjacente e da parede do aneurisma. ⁵ Até o momento, a origem das células endoteliais na formação neointima de aneurismas tratados endovasculares permanece incerta. Há um debate em curso na literatura sobre a fonte a partir da qual as células formadoras de neointima são recrutadas.

Utilizando-se uma injeção de corante CM-Dil (ver a Tabela de Materiais) na aorta abdominal de ratos, tivemos como objetivo analisar o papel das células endoteliais, originárias da artéria parental, na formação de neointima em dois pontos de tempo diferentes de FU (dia 7 e dia 21) (Figura 1). Uma vantagem do modelo é a incubação direta local de rastreador de células in vivo em uma artéria parental antes da sutura do aneurisma, permitindo a FU em pontos de tempo posteriores. Técnicas de injeção in vivo , como a incubação de rastreadores de células, não foram descritas na literatura. Uma vantagem dessa técnica é a injeção direta, de um ponto, intraoperatória, in vivo , que torna o modelo robusto e reprodutível.

O apoio veterinário foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Local, suíça (BE 60/19). As diretrizes do ARRIVE e os princípios 3R foram rigorosamente seguidos ^6,7. Trinta e um ratos de Lewis, com 12 semanas de idade e pesando 492 ± 8 g, foram incluídos. Abriga todos os ratos a uma temperatura ambiente de 23 °C e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Fornecer acesso gratuito a água e pelotas. Análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste não paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney U. Os valores de probabilidade (p) de ≤ 0,05 e/ou ≤ 0,01 foram considerados significativos.

1. Preparação em fase-geral pré-operatória e aspectos anestesiológicos

1. Randomize ratos em grupos de tratamento de bobina ou stent (Figura 2) através de um sistema de randomização baseado na Web. Agora, realize um exame clínico pré-operatório de todos os animais planejados para cirurgia ao lado de uma sala de cirurgia tranquila e asséptica mantendo uma temperatura ambiente de 23 ± 3 °C. Analise o comportamento dos animais e inspecione as membranas mucosas e o turgor como parte do exame clínico pré-operatório.
2. Regissuor de cada animal.
3. Antes da cirurgia, incubar as bolsas arteriais de ratos doadores em sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% por 10h a 37 °C para obter aneurismas descelularizados⁸. Pegue esses malotes de animais doadores alguns dias antes da cirurgia.
   1. Prepare toda a extensão da aorta abdominal com microscisores e fórceps e aplique ligaduras nãoabsorvíveis de 6-0 em um intervalo de 3-4 mm.
   2. Gerar diretamente aneurismas vitais intraoperatóriamente por uma bolsa de vaso arterial anteriormente ligada da parte torácica de um animal doador⁹. Realize a toracotomia com tesoura e fórceps cirúrgicos no ponto de tempo indicado da FU e ligate a bolsa do vaso no comprimento desejado.
4. Implante diretamente a bolsa no receptor e retire o aneurisma do animal doador para posterior análise macroscópica e processamento histológico.
5. Para indução de anestesia, coloque todos os ratos em uma caixa limpa fornecida com oxigênio (O₂) até a perda de consciência após 5-10 min. Anesthetize ratos com injeção subcutânea (SC) de uma mistura de fentanil 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg e midazolam 2 mg/kg.
   NOTA: Isso garante um plano cirúrgico de pelo menos 45 min.
6. Verifique a profundidade da anestesia pela ausência do reflexo de retirada do pedal.
7. Coloque os ratos em uma posição supina e raspe a parte toracoabdominal com uma máquina de barbear elétrica.
8. Fixar as 4 patas dos ratos com fita em uma tábua, coberta por uma almofada de aquecimento conectada a uma sonda retal autoreguladora. Insira a sonda retal no ânus do rato para manter a temperatura desejada de 37 °C com a ajuda da almofada de aquecimento.
9. Agora, instale um sensor na perna traseira direita conectado a um sistema informatizado para verificar sinais vitais intraoperatóriamente.
10. Cubra o nariz e a boca do rato com uma máscara facial. Se exigir anestesia prolongada, inicie isoflurane (1,0-2,0% titulado para efeito em 100% O₂).
11. Desinfete o campo cirúrgico com povidone-iodo ou desinfetantes alternados e drape o campo cirúrgico de forma estéril.
12. Para cuidados perianestésicos, aplique um lubrificante oftálmico estéril nos olhos e cubra-os com uma máscara de papel alumínio opaca para evitar a secagem e danos causados pela lâmpada cirúrgica.
13. Durante toda a cirurgia, forneça oxigênio continuamente através da máscara facial, monitore a temperatura corporal e forneça calor usando uma almofada de aquecimento, mantendo a normotermia.
14. Monitore outros sinais vitais continuamente (distensão de pulso e respiração, frequência cardíaca e respiração e saturação de oxigênio).

2. Fase operativa - injeção de rastreador de células

NOTA: A abordagem cirúrgica detalhada no aneurisma de parede lateral microcirúrgica de helsinque de helsinque modelo⁹ e técnicas para implantação de bobina e stent são descritas em outros lugares ^8,10,11.

1. Armazene o rastreador de células lipofílicas fluorescentes a ≤ -20 °C o tempo todo, protegido da luz.
2. Realizar a cirurgia preparando a aorta de rato e a veia caval, seguida da separação de ambos, bem como fixação temporária proximal e distal da aorta.
   NOTA: Esta técnica foi descrita anteriormente⁹.
   1. Fixar as partes proximais e distais da aorta com dois clipes de titã temporários.
3. Coloque um microswab com estofamento roxo cada um sob as partes proximais e distal da aorta para melhor visualização da artéria.
4. Agora, proteja o abdômen com gaze molhada.
5. No dia da operação, dissolva 2 μL do rastreador de células por tubulação em 1 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS).
6. Transfira a mistura para uma seringa de 1 mL equipada com uma cânula estéril de 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
   NOTA: Tenha cuidado para evitar a exposição à luz durante a realização das etapas 2.5 e 2.6.
7. Desligue a luz na sala de cirurgia. Ao olhar sob um microscópio, realize a injeção de um ponto na parte ventral média da aorta usando micro fórceps e injete cuidadosamente 1 mL de solução salina heparinizada de 0,9%.
8. Injete cuidadosamente o rastreador de células (Vídeo 1) e desligue imediatamente o microscópio operacional também. Novamente, proteja o abdômen com gaze molhada.
9. Deixe o corante incubar por pelo menos 15 minutos. Após o período de incubação, ligue o microscópio e as luzes da sala de cirurgia.
10. Realize a arteriotomia longitudinal e a sutura do aneurisma, conforme descrito em outros lugares¹¹.
    1. Use microforceps e microscisores para realizar a arteriotomia para que seu comprimento tenha uma média do diâmetro do aneurisma colhido (etapa 1.3). Para garantir o comprimento correto, coloque o aneurisma ao lado da aorta antes de realizar a arteriotomia. Suturar o aneurisma com 8-10 pontos únicos usando uma sutura 10-0 não removível, e remova cuidadosamente os grampos temporários de partida distral sob irrigação contínua com soro fisiológico heparinizado. Feche a ferida de forma em camadas. Note-se, use uma densidade de embalagem de bobina de 1 cm.
       NOTA: A técnica de implantação de bobina ou stent foi descrita em outros lugares ^8,10.

3. Monitoramento de fases pós-operatórias e cuidados analgésicos

1. Ao final da cirurgia, reverta a anestesia com uma mistura de injeção de SC de buprenorfina 0,05 mg/kg, atipamezol 0,75 mg/kg e flumazenil 0,2 mg/kg. Deixe cada animal operado se recuperar em uma gaiola limpa até que esteja totalmente acordado e aquecido, conforme necessário, com uma lâmpada de aquecimento.
2. Durante 3 dias, administre 1 mg/kg de meloxicam (uma injeção ou aplicação oral por dia) e buprenorfina (0,05 mg/kg quatro vezes por dia) SC. Durante a noite, forneça buprenorfina continuamente na água potável com a mesma dose: 6 mL buprenorfina 0,3 mg/mL, 360 mL de água potável, 10 mL de glicose.
3. Na fase pós-operatória imediata, abriga cada animal em uma única gaiola para proteção. Reagrupar os animais depois das 24h.
4. Se algum rato mostrar comportamento angustiado ou agressivo após a injeção de SC, administre buprenorfina na água potável durante o dia.
5. Forneça alimentação macia no chão da gaiola para apoiar a alimentação e a recuperação no pós-operatório.
6. Observe e cuide de todos os animais de acordo com o bem-estar e a folha de escore de dor.
7. Administrar analgesia de salvamento SC (meloxicam 1 mg/kg e 0,05 mg/kg buprenorfina) quando necessário.

No cenário laboratorial foram incluídos 31 animais: 27 ratos foram incluídos na análise estatística final; 4 ratos morreram prematuramente (taxa de mortalidade de 12,9%). Intraoperativamente, a distensão respiratória foi significativamente reduzida (p = 0,03) reduzida em stent- (12,9 μm ± 0,7) em comparação com ratos tratados com bobina (13,5 μm ± 0,6). A angiografia da fluorescência foi realizada para cada rato no final da última FU. A reperfusão foi indicada em todos os 6 animais tratados com bobina, enquanto a reperfusão foi observada em apenas 12,5% dos 8 animais tratados com stent.

Os volumes de aneurisma de linha de base agrupados para o dia 7 e o dia 21 não diferem significativamente (nem para descelularizados (p = 0,9) nem aneurismas vitais (p = 0,1) aneurismas) entre os grupos de tratamento de bobina ou stent (Figura 3). Os volumes de FU agrupados para aneurismas descelularizados apresentaram um crescimento de aneurisma não significativo em enrolados em comparação com os aneurismas stent (p = 0,28), significativamente maior no enrolado vital do que o grupo stent (60,1 mm3 ± 31,1 mm3 vs. 20,5 mm3 ± 20,6 mm3; p = 0,002).

As quantidades de células-rastreadas-positivas na neointima de aneurismas descelularizados não diferem significativamente entre os grupos tratados com stent ou bobina no dia 7 FU (p = 0,8) mas foram significativamente maiores em ratos stents no dia 21 DEFU (Figura 4; p = 0,04). Em ratos suturados de aneurisma vital, não foram observadas diferenças significativas em 7 dias (p = 1,0) ou 21 dias (Figura 5) FU (p = 0,66). Nos aneurismas descelularizados aos 7 dias de FU, significativamente mais células-rastreadas-positivas permaneceram no trombo do stent tratado em comparação com o grupo tratado com bobina (p = 0,01). Essa diferença não foi observada em aneurismas vitais aos 7 dias de FU. Consulte a Tabela 1 para a proporção de células desenvoltura-positivas para descelularizados, bem como aneurismas enrolados e stents vitais para o dia 7 e dia 21 DEFU. A contra-retenção para o fator von Willebrand (F8) foi realizada nas células endoteliais do neointima de cada rato (Figura 6).

A duração média do procedimento cirúrgico foi de 119,1 ± 21,3 min para o grupo coito em comparação com 154,1 ± 30,2 min para o grupo stent (p = 0,001). O número de pontos para suturas de aneurisma também difere significativamente (p = 0,000002) para os grupos de bobina (15,6 ± 2,9 pontos) e stent (11,3 ± 1,1).

Figura 1: Fluxograma da configuração experimental. Um total de 35 animais foram operados e randomizados para grupos de enrolamento ou stent. Dois animais do grupo stent morreram no pós-operatório imediato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fotografias intraoperatórias de aneurismas durante a embolização da bobina e stent. (A) retrata um aneurisma sidewall -aneurisma (#), suturado na aorta de rato abdominal (*). Observe o dispositivo de bobina introduzido no aneurisma antes de realizar o último ponto único para completar a sutura do aneurisma. Note a coloração rosada (seta) no lado esquerdo da arteriotomia, indicando a distribuição correta do rastreador celular. (B) A mesma configuração de A, mostrando o dispositivo stent já in situ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Medições macroscópicas pós-morte em 31 animais. Os volumes de aneurisma (mm3) foram documentados antes da implantação e no seguimento, representados ao longo do eixo y. (A) Linha de base (descelularizada), (B) acompanhamento (descelularizada), (C) linha de base (vital), (D) seguimento (vital). Os dados do dia 7 e dia 21 estão agrupados. ** p < 0,01. Os valores são expressos em medianas com intervalos interquartis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem exemplar de um aneurisma descelularizado tratado com stent no dia 21. À direita, a visão geral da imagem de um antiα-SMA monoclonal, aneurisma esgotado por células (ampliação de 2 vezes) é mostrada; barra de escala = 150 μm. Esquerda, bancada com DAPI; as células vermelhas são células-tracer-positivas (A) na parede do aneurisma, (B) no trombo, (C) células residuais manchadas, mas desbotadas no rastreador de células-positivas na neointima, e (D) no complexo de vasos adjacentes. Barras de escala = 100 μm (A-D). Uma única flecha marca a parede do aneurisma, seta dupla na artéria dos pais. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilôndole; α-SMA = actina muscular α-lisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem exemplar de um aneurisma vital tratado de bobina no dia 21. Lado direito, visão geral da imagem de um antiα-SMA monoclonal, aneurisma rico em células (ampliação de 2 vezes) é mostrado; barra de escala = 150 μm. Lado esquerdo, contrariado com DAPI; as células vermelhas são células-tracer-positivas (A) na parede do aneurisma, (B) no trombo, (C) múltiplas células positivas no neointima, e (D) no complexo de vasos adjacentes. Barras de escala = 100 μm (A-D). Uma única flecha marca a parede do aneurisma, seta dupla na artéria dos pais. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilôndole; α-SMA = actina muscular α-lisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: ampliação de 40 vezes da coloração F8. # retrata a formação do trombo, * o neointima, e § o lado endoluminal abaixo do orifício do aneurisma. Note as camadas endoteliais mostradas como manchas roxas na camada endoluminal do neointima. Barra de escala = 175 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Proporção de células positivas de rastreador de células em neointima, artéria parental, trombo e aneurisma. Os valores são descritos como percentuais para bolsas descelularizadas e vitais para tratamento de bobina e stent para o dia 7 e dia 21. Abreviação: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilôle.

Vídeo 1: Injeção de rastreador de células na parte abdominal da aorta do rato. Esta técnica é realizada usando uma injeção de um ponto na aorta de rato preso. Clique aqui para baixar este vídeo.

Os autores são os únicos responsáveis pelo desenho e conduta do estudo apresentado e não declaram interesses concorrentes.