Summary
Detta protokoll beskriver en iSCAT-baserad bildbehandling och enpartikelspårningsmetod som möjliggör samtidig undersökning av molekylmassan och det diffusiva beteendet hos makromolekyler som interagerar med lipidmembran. Steg-för-steg-instruktioner för provberedning, mass-till-kontrastkonvertering, filmförvärv och efterbehandling tillhandahålls tillsammans med anvisningar för att förhindra potentiella fallgropar.
Abstract
Kortlivade eller övergående interaktioner mellan makromolekyler vid och med lipidmembran, ett gränssnitt där en mängd väsentliga biologiska reaktioner äger rum, är i sig svåra att bedöma med vanliga biofysiska metoder. Införandet av masskänslig partikelspårning (MSPT) utgör ett viktigt steg mot en grundlig kvantitativ karakterisering av sådana processer. Tekniskt sett möjliggjordes detta genom tillkomsten av interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT) -baserad massfotometri (MP). När strategin för borttagning av bakgrund är optimerad för att avslöja den tvådimensionella rörelsen hos membranassocierade partiklar, möjliggör denna teknik realtidsanalys av både diffusion och molekylmassa av omärkta makromolekyler på biologiska membran. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för att utföra och analysera masskänslig partikelspårning av membranassocierade system. Mätningar utförda på en kommersiell massfotometer uppnår tidsupplösning i millisekundregimen och, beroende på MP-systemet, en massdetekteringsgräns ner till 50 kDa. För att visa upp MSPT:s potential för en fördjupad analys av membrankatalyserad makromolekyldynamik i allmänhet presenteras resultat erhållna för exemplifierande proteinsystem såsom den ursprungliga membraninteraktionen annexin V.
Introduction
En gång bara uppfattad som en barriär mot det stora utbudet av omgivande fysiska förhållanden, betraktas biologiska membran numera som funktionella enheter och katalytiska plattformar 1,2. Baserat på deras förmåga att lokalisera, förstärka och rikta signaler som svar på membranassocierade makromolekylreaktioner utgör lipidgränssnitt ett avgörande element för en mängd olika cellulära processer såsom membranhandel och signalkaskader 3,4,5. Membranbindning fungerar som en kärnbildningsplats för montering av stabila komplex och är ofta beroende av en dynamisk jämvikt mellan membranassocierade och cytosoliska former av makromolekyler och är därför av övergående natur 6,7.
Trots deras stora betydelse inom biologin har det hittills varit utmanande att utveckla metoder som kan ge tillgång till de kompositionella, rumsliga och tidsmässiga heterogeniteterna hos membranassocierade makromolekylreaktioner i realtid 7,8. För att lösa de underliggande molekylära processerna är två experimentella aspekter avgörande: tillräcklig tidsupplösning och enpartikelkänslighet. Därför har ensemblemedeltekniker som fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP) men också den mycket känsligare fluorescenskorrelationsspektroskopin (FCS) begränsningar, eftersom de i stor utsträckning frikopplar rumslig information från tidsmässig information9. Ett viktigt steg mot karakteriseringen av individuell molekyldynamik har således varit tillkomsten av enpartikelspårning (SPT) i kombination med högkänslig mikroskopi. I synnerhet har två SPT-metoder visat sig vara effektiva i detta avseende. För det första banade användningen av fluoroforer som etiketter och motsvarande fluorescensdetekteringssystem vägen för nanometerprecision och millisekunds upplösning 10,11,12. För det andra förbättrade spridningsbaserad detektion med hjälp av guldnanopartiklar både lokaliseringsprecision och tidsupplösning till subnanometer- och mikrosekundområdet, respektive 13,14,15,16. Trots de många fördelarna med båda metoderna och deras betydande bidrag när det gäller den mekanistiska förståelsen av membranassocierade system 17,18 har båda teknikerna hittills varit begränsade: de kräver märkning av molekylerna av intresse, vilket potentiellt stör deras ursprungliga beteende och är okänsliga för den molekylära sammansättningen av membranassocierade partiklar 19,20.
Båda dessa begränsningar har nyligen övervunnits genom införandet av en ny interferometrisk spridning (iSCAT)-baserad metod som kallas massfotometri (MP)21,22,23. Denna teknik möjliggör bestämning av massfördelningar i lösningen av biomolekyler enligt deras iSCAT-kontrast vid landning på ett glasgränssnitt. För detektion och karakterisering av mobila molekyler som diffunderar på lipidmembran måste emellertid en mer sofistikerad bildanalysmetod utvecklas. Detta har under tiden implementerats framgångsrikt och gör det möjligt att detektera, spåra och bestämma molekylmassan hos enskilda omärkta biomolekyler som diffunderar på ett lipidgränssnitt 24,25. Kallad dynamisk massfotometri eller masskänslig partikelspårning (MSPT), möjliggör denna teknik nu bedömning av komplexa makromolekylinteraktioner genom att direkt registrera förändringar i molekylmassan hos de spårade enheterna och öppnar därmed nya möjligheter för den mekanistiska analysen av membranassocierad molekyldynamik.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för provberedning, avbildning och den dataanalyspipeline som krävs för MSPT. I synnerhet diskuteras provkrav och potentiella problem som kan uppstå under mätning och analys. Vidare visas den oöverträffade potentialen att analysera membranöveragerande makromolekylsystem genom olika representativa resultat.
Protocol
1. Provberedning
- Generering av multilameller vesiklar (MLV)
- Beräkna mängden kloroformupplösta lipider enligt önskad lipidblandning och erforderlig suspensionsvolym.
OBS: En slutlig vesiklarkoncentration på 4 mg /ml lipider rekommenderas för resuspension (reaktion) buffert. - Pipettera den beräknade volymen lipider i en 1,5 ml glasflaska med hjälp av positiva förskjutningspipetter utrustade med glasspetsar.
- Avdunsta lipidlösningsmedlet under en svag ström av kväve och rotera ständigt injektionsflaskan för att säkerställa lika fördelning av lipiderna på glasväggarna.
- Säkerställ fullständig avdunstning av lösningsmedel genom att placera injektionsflaskan under en stadig ström av kväve i 15 minuter.
- Ta bort kvarvarande spår av kloroform genom vakuumtorkning i en vakuumtorkator i ytterligare en timme.
- Rehydrera lipidblandningen i den önskade resuspensionsbufferten (reaktion) och virvla suspensionen noggrant tills lipidfilmen har lösts upp från injektionsflaskans väggar.
OBS: Reaktionsbufferten bör säkerställa proteinaktivitet och stabilitet. Reaktionsbufferten som används i denna studie innehåller 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 150 mM KCl och 5 mMMgCl2. Observera att alla buffertar som används för att späda ut lipider eller proteiner måste filtreras för att avlägsna störande partikelföroreningar (se steg 5).
- Beräkna mängden kloroformupplösta lipider enligt önskad lipidblandning och erforderlig suspensionsvolym.
- Generering av små unilamellär vesiklar (SUV)
- För på varandra följande frys-töcykler av lipidåterupplivningen (steg 1.1.6), koka 500 ml vatten i en bägare på en kokplatta (mellan 70 ° C och 99 ° C) och förbered en behållare med flytande kväve.
- Chockfrys lipidåterupppensionen i det flytande kvävet. Överför injektionsflaskan till bägaren med varmt vatten tills lösningen är helt tinad. Upprepa denna frys-tina cykel 8-10 gånger eller tills den tidigare grumliga blandningen verkar klar.
VARNING: Använd lämpliga skyddskläder och utrustning som skyddsglasögon, handskar och pincett för att förhindra direkt kontakt med flytande kväve, den frysta lipidflaskan eller det kokande vattnet. - För generering av en monodispers vesiklarfördelning, montera en lipid-extruder och testa dess integritet med reaktionsbuffert för att säkerställa att den inte läcker.
OBS: Om läckage observeras, sätt försiktigt ihop lipid-extrudern igen tills inget buffertspill är uppenbart. - Extrudera lipidsuspensionen för 37 passerar genom ett nukleoporemembran med en porstorlek på 50 nm26. Antalet passager bör vara ojämnt för att säkerställa att den slutliga SUV-blandningen korsade nukleoporemembranet och därmed är fri från lipidaggregat eller multilamellära vesiklar. De extruderade vesiklarna kommer senare att användas för att bilda lipid-dubbelskikt som stöds (se steg 6 och 7).
OBS: SUV kan också bildas genom ultraljudsbehandling av den rehydrerade lipidblandningen. Beredning via extrudering ger emellertid en mer monodispers fördelning av STADSJEEPAR, vilket underlättar vesiklarbrott under stödd lipid-dubbelskiktsbildning. Extruderade vesiklar kan förvaras i kylskåp i högst 3 dagar.
2. Rengöring av mikroskopbilder
- Fördela lika många mikroskopglas (nr #1.5; 0.17 mm tjocklek) med måtten 24 mm x 60 mm och 24 mm x 24 mm i polytetrafluoretylen (PTFE) mikroskophållare.
- Överför PTFE-hållare till bägare som innehåller ultrarent vatten och sonicate dem i 15 min vid rumstemperatur.
OBS: Beroende på bägaren måste vattenvolymen justeras för att helt täcka PTFE-hållaren. - Använd pincett för att ta bort hållarna från bägaren och ersätt vattnet med ultraren isopropanol. Sätt i hållaren i bägaren som innehåller isopropanol och sonat igen i 15 min.
OBS: Beroende på bägaren måste isopropanolvolymen justeras för att helt täcka PTFE-hållaren. - Byt isopropanol med ultrarent vatten och sonicate bägaren som innehåller hållarna i 15 min.
- Ta bort PTFE-hållarna från bägarna och föna mikroskopglasen i hållaren under en stadig ström av kvävgas eller tryckluft.
OBS: Se till att täckglas rengörs korrekt genom att använda handskar, rena bägare och paraffinfilm för att täcka varje bägare. Annars kan restdamm orsaka betydande bakgrundsfluktuationer under MSPT-mätningar.
3. Hydrofilisering av mikroskopbilder
OBS: För att erhålla ett homogent och vätskestött lipid-dubbelskikt är hydrofilisering av glidbanor avgörande och måste utföras strax före flödeskammarens montering.
- Placera PTFE-hållare som endast innehåller 24 mm x 60 mm mikroskopglas i en plasmarengörare med syre som processgas och rengör mikroskopbilderna med plasma (parametrar som används i detta arbete: 30% effekt, 0,3 mbar syretryck i 30 s; se Materialtabell för detaljer om den plasmarengörare som används).
OBS: För att erhålla vätskemembran måste plasmarengöringsparametrar som effekt, syretryck och rengöringstid justeras för varje instrument. För detta ändamål rekommenderas användning av fluorescerande märkta lipider för att säkerställa membranfluiditet, som kan kvantifieras med fluorescensåtervinning efter fotoblekningsexperiment (FRAP)27. Om parametrarna inte är optimerade för respektive inställning kan membrandiffusion försämras på grund av minskad membranfluiditet.
4. Montering av flödeskammare
- Håll följande komponenter redo före flödeskammarens montering: rengjorda mikroskopglas (24 mm x 24 mm), hydrofiliserade mikroskopglas (24 mm x 60 mm), aluminiumfolie, platt kartong, skalpell och dubbelsidig tejp.
- Vik in den platta kartongen med aluminiumfolie.
- Sprid de rengjorda 24 mm x 24 mm mikroskopglidorna på aluminiumfolien med tillräckligt avstånd mellan varandra.
- Fäst dubbelsidiga tejpremsor på glidbanornas övre och nedre kanter.
- Punktskatta varje mikroskop glida med skalpellen, så att den kan tas bort från aluminiumfolien. Som ett resultat bör varje bild ha ränder av dubbelsidig tejp fäst vid bildens övre och nedre kanter (se figur 1).
- Fäst 24 mm x 24 mm glidbanan med de två dubbelsidiga tejpremsorna på den hydrofiliserade 24 mm x 60 mm glidbanan för att bilda en flödesväg mellan de mindre och större mikroskopglidorna.
OBS: För att säkerställa rena flödeskammare, använd ständigt handskar och se till att arbetsbänken är dammfri.
5. Filtrering av reaktionsbuffertar
- Sterilt filtrera alla reaktionsbuffertar genom 0,45 μm cellulosaacetatmembran för att säkerställa minimal bakgrundssignal under MSPT-mätningar.
OBS: Om närvaron av nukleotider, såsom ATP, är avgörande för ett framgångsrikt experiment, var medveten om en potentiell ökning av bakgrundssignalen. Det rekommenderas att endast använda minimala mängder som fortfarande säkerställer proteinaktivitet.
6. Stödd lipid-dubbelskiktsbildning (SLB)
OBS: Det rekommenderas att utföra bildandet av stödda lipid-dubbelskikt på massfotometern för att visuellt säkerställa framgångsrik vesikulärridning och fullständigt avlägsnande av osmälta vesiklar.
- Späd ut nyextruderade stadsjeepar (se steg 1 för mer information) till en slutlig koncentration på 0,4 mg/ml i den erforderliga reaktionsbufferten. Valfritt, för att främja vesitelbrott, tillsätt 2 mM CaCl2 till vesilekupphängningen.
OBS: Divalenta katjoner kan orsaka aggregering av vissa lipider såsom PiP2. För blandningar som innehåller sådana lipider, avstå från att använda CaCl2 för att främja vesiklarbrott eller andra tvåvärda katjoner i resuspensionsbufferten. Om det behövs för experimentet kan tvåvärda katjoner tillsättas efter framgångsrik bildning av det stödda lipid-dubbelskiktet. - Spola 50 μL av vesikleupphängningen i flödeskammaren (steg 4) och inkubera kammaren i 2 min.
OBS: Buffertar, vesiklar eller proteinlösningar kan spolas genom flödeskammaren med en liten bit blötläggningsvävnad. Det är emellertid också möjligt att använda ett mekaniskt pumpsystem. - Avlägsna osmälta vesiklar genom upprepad (minst tre gånger) tvättning av flödeskammaren med 200 μL av reaktionsbufferten varje gång.
OBS: Vesiklar måste tvättas noggrant ur flödeskammaren för att säkerställa en stabil bakgrundssignal under MSPT-mätningar.
7. Generering av kalibreringskurva
OBS: För att omvandla kontrasten hos detekterade partiklar till molekylmassa måste deras signal kalibreras med hjälp av proteiner av kända storlekar. Det rekommenderas att justera standardproteinstorleksregimen för att täcka det intervall av molekylmassor som förväntas för det intressanta systemet.
- Biotinylering av standardproteiner med cysteinrest
- Beräkna lämplig mängd maleimid-biotin för standardproteinet enligt tillverkarens instruktioner.
- Inkubera standardproteinet med den bestämda volymen maleimid-biotin i 1 timme vid rumstemperatur.
- För att avlägsna okonjugerat maleimid-biotin från det konjugerade biotin-proteinkomplexet, utför storleksuteslutningskromatografi på en kolonn som är lämplig för proteinet av intresse.
- Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av en Bradford Assay.
OBS: För att lagra standardproteinet för ytterligare mätningar, frys proteinet i engångsaliter i flytande kväve och förvara det vid -80 ° C.
- Mätning av standardproteiner för kalibreringskurvan
- I en flödeskammare, förbered ett lipid-dubbelskikt som stöds med 0,4 mg/ml extruderade stadsjeepar (se steg 1 och 6 för mer information) innehållande 0,01 mol% (v/v) Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-cap biotinyl).
- Tillsätt 50 μL 2,5 nM tvåvärt streptavidin till dubbelskiktet i flödeskammaren och inkubera i 10 min.
NOTERA: Divalent streptavidin har uttryckts och renats enligt Howarth et al.28. Tetravalent streptavidin kan också användas. Användningen av divalent streptavidin kan emellertid minska den möjliga reaktionen stökiometrier mellan biotinylerade lipider och standardproteiner som konjugeras till en biotindel för att underlätta tilldelningen av arter. - Avlägsna obundet divalent streptavidin med 100 μL reaktionsbuffert.
- Tillsätt 50 μL 100 nM biotinkonjugerat standardprotein till dubbelskiktet i flödeskammaren och inkubera i 2 min.
OBS: Beroende på biotinyleringseffektiviteten och om di- eller tetravalent streptavidin används, kan de optimala koncentrationerna av biotinkonjugerat standardprotein och streptavidin variera. - Utför MSPT-mätning enligt de detaljer som beskrivs i steg 8.
VARNING: Bildförhållandena måste vara identiska för både prov- och kalibreringsstandarder.
8. Avbildning
- SLB-bildning och provberedning
- Som beskrivs mer detaljerat i steg 6, introducera SUV av den önskade lipidblandningen (25 μL) till provflödeskammaren och bilda ett lipid-dubbelskikt som stöds. Tvätta kammaren noggrant (tre gånger) med 100 μL reaktionsbuffert för att avlägsna alla osmälta vesiklar.
- Tillsätt 50 μL av proteinet av intresse till provkammaren.
OBS: Eftersom MSPT är en enpartikelmetod måste proteinkoncentrationen hållas i pM till nM-intervallet för att möjliggöra ostörd partikeldetektering och spårning.
- Videoförvärv
- Ställ in önskade bildförhållanden som storleken på synfältet (FOV), bildhastighet, exponeringstid och förvärvstid i förvärvsprogramvaran.
OBS: Följande inställningar har visat sig fungera för MSPT på en kommersiell massmätare (se Materialtabell): FOV på 128 pixlar x 35 pixlar, en bildhastighet på 1 kHz vilket resulterar i ungefär 200 bilder per sekund efter efterföljande 5-faldig bildruta i genomsnitt och en exponeringstid på 0,95 ms. - Justera fokus automatiskt eller manuellt. Flytta vid behov FOV till ett läge med ett homogent membran med hjälp av sidokontrollen.
- Skapa en projektmapp och börja spela in filmen. När inspelningen är klar anger du ett filnamn i dialogrutan som uppmanas av förvärvsprogramvaran. Filmen sparas sedan automatiskt i projektmappen som en MP-fil för efterföljande analys.
OBS: Registrera minst tre replikat i olika flödeskammare för att säkerställa integriteten hos enskilda membran och reproducerbarhet av resultat. Filmens varaktighet kan ställas in i förväg och beror på typen av experiment. I de flesta fall rekommenderas en förvärvstid mellan 5 min och 7 min.
VARNING: Som standard komprimeras filminspelningar på den kommersiella programvaran för massfotometerförvärv innan de sparas för att minska lagringsutrymmet. Filkomprimering måste dock inaktiveras för att aktivera anpassad dataanalys enligt beskrivningen i det här protokollet. Detaljer om hur du stänger av filkomprimering finns i tillverkarens användarhandbok.
- Ställ in önskade bildförhållanden som storleken på synfältet (FOV), bildhastighet, exponeringstid och förvärvstid i förvärvsprogramvaran.
9. Analys av data
Dataanalyspipelinen åtföljs av två interaktiva Jupyter notebook-filer (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb). Jupyter Notebooks och associerade anpassade Python-moduler som krävs för att utföra MSPT-analysen som beskrivs nedan är tillgängliga på en offentlig lagringsplats: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. För detaljerade instruktioner om analysen nedan hänvisas läsarna till MSPT analysis.ipynb som nås via länken ovan.
- Video bearbetning
- Ta bort dominerande statisk spridning av ljus med den pixelvisa bakgrundsuppskattningsalgoritmen med hjälp av funktionen image_processing.mp_reader .
- Om du vill använda bakgrundsborttagningen väljer du alternativet continuous_median för parameterläget och anger en lämplig längd för det glidande medianfönstret (window_length) i anteckningsbokens avsnitt B.1. Du kan också spara filmerna efter borttagning av bakgrunden som ska användas för partikeldetektering och banlänkning (genom att ställa in parametern save_processed_movies till True).
OBS: Justera fönsterstorleken (window_length) till värden mellan 101 och 2001 beroende på partikeldensiteten på membranet, den förväntade diffusionskoefficienten, förvärvsbildhastigheten och den önskade bearbetningshastigheten.
VARNING: Strategin för borttagning av bakgrund fungerar bra om membranet inte är för tätt packat och om diffusionen av partiklarna är tillräckligt snabb (dvs. varje pixel är för det mesta inte upptagen med en partikel). Annars kommer partiklarnas kontrast att underskattas systematiskt eftersom de inte kan särskiljas ordentligt från bakgrundssignalen. Detta kan kompenseras genom att öka medianfönsterstorleken på bekostnad av beräkningshastigheten. Tänk dock på att inställningen av fönsterstorleken för stor kan påverka utdata negativt på grund av provavdrift. En visuell inspektion av de bearbetade videorna är avgörande.
- Om du vill använda bakgrundsborttagningen väljer du alternativet continuous_median för parameterläget och anger en lämplig längd för det glidande medianfönstret (window_length) i anteckningsbokens avsnitt B.1. Du kan också spara filmerna efter borttagning av bakgrunden som ska användas för partikeldetektering och banlänkning (genom att ställa in parametern save_processed_movies till True).
- Detektera partiklar och deras respektive position i hela filmen med funktionen particle_fitting.particle_fitter (se anteckningsbokens avsnitt B.2).
- Ställ in känsligheten för partikeldetektering med tröskelparametern (tröskverk; se anteckningsbok avsnitt B.1), som används för att markera kandidatpunkter genom bildbinarisering. Effekten av olika tröskelparametrar på punktdetekteringskänsligheten kan undersökas i en separat anteckningsbok (Movie visualization.ipynb). Resultaten av partikeldetektering sparas automatiskt i CSV-filer i en underkatalog till filmfilen.
OBS: Att ställa in tröskelparametern godtyckligt låg (till exempel för filmer tagna med den använda massfotometern, en tröskelparameter under 0,0005) rekommenderas inte eftersom kandidatfläckar kommer att domineras av falskt brus och därmed förlänga bearbetningstiden.
- Ställ in känsligheten för partikeldetektering med tröskelparametern (tröskverk; se anteckningsbok avsnitt B.1), som används för att markera kandidatpunkter genom bildbinarisering. Effekten av olika tröskelparametrar på punktdetekteringskänsligheten kan undersökas i en separat anteckningsbok (Movie visualization.ipynb). Resultaten av partikeldetektering sparas automatiskt i CSV-filer i en underkatalog till filmfilen.
- Ta bort dominerande statisk spridning av ljus med den pixelvisa bakgrundsuppskattningsalgoritmen med hjälp av funktionen image_processing.mp_reader .
- Länka partiklar i på varandra följande ramar till banor med Python-paketet trackpy (v.0.5.0)29.
OBS: Banlänkningen utförs i farten efter punktdetektering. Som ett resultat lagras ytterligare en CSV-fil som innehåller baninformationen i en underkatalog till CSV-filen för partikeldetektering.- Ta bort banor med för få punkter med parametern minimum_trajectory_length (se avsnitt B.1 i anteckningsboken) för att möjliggöra en robust bestämning av diffusionskoefficienter. Detaljerade förklaringar om de andra parametrarna för trackpy-funktioner finns i trackpys dokumentation.
- Analys av banan
- I anteckningsbokens avsnitt C.1 anger du bildfrekvensen (frame_rate) och pixelstorleken i nm (pixel_size), som användes för filmförvärv. Skapa en lista över CSV-filer som innehåller baninformationen som returneras av trackpy (se steg 9.2) med funktionen trajectory_analysis.get_csv_files (notebook-avsnitt C.2).
- Ange dessutom ett utdatafilnamn för HDF5-containern, som används för att lagra anpassningsresultaten på disken (notebook-avsnitt C.3). Analysera alla banor med funktionen trajectory_analysis.fit_trajectories i notebook-avsnitt C.4, som itererar genom listan över CSV-filer. Denna funktion använder hoppavståndsfördelning (JDD)30 och genomsnittlig kvadrerad förskjutning (MSD)31-analys för att uppskatta diffusionskoefficienten för varje bana.
- Omvandla mediankontrasten för varje bana till dess motsvarande massa med hjälp av kontrastmassförhållandet som erhålls från MSPT-kalibreringen (se avsnitt 7). Ange kalibreringslinjens lutning (lutning) och y-avlyssning (förskjutning), som relaterar iSCAT-kontrast till molekylmassa (funktion trajectory_analysis.apply_calibration; se avsnitt C.5 i anteckningsboken). Den här funktionen lägger till en kolumn med banans medianmassa till varje dataram.
- Utvärdera den skenbara partikeldensiteten på membranet med funktionen trajectory_analysis.membrane_density, som returnerar mediandensitetsvärdet i termer av detekterade partiklar och nuvarande banor under varje ram (se notebook-avsnitt C.6) som ytterligare kolumner i dataramen.
OBS: Eftersom en del av partiklarna kommer att gå förlorade under både detektions- och banlänkningsprocessen kan de faktiska partikeldensiteterna vara högre. För tillförlitliga resultat avseende partikeldensiteter såväl som mass histogram, inspektera visuellt representativa filmögonblicksbilder för att verifiera att mätförhållandena är rimliga för spårning av enpartikel (se steg 9.1.1).
10. Datavisualisering
- Illustrera korrelationen mellan massa och diffusionskoefficient med tvådimensionell kärndensitetsuppskattning (KDE), som baseras på Python-paketet fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/).
- Om du vill generera diagrammet anger du HDF5-filen som innehåller MSPT-resultaten (se steg 9.3.2 och notebook-avsnitt D.1) och väljer en enda (notebook-avsnitt D.2) eller en sammanfogad dataram (notebook-avsnitt D.3) som indata för funktionen plotting.generate_2D_KDE (notebook-avsnitt D.4).
OBS: Varje plottad datauppsättning bör helst innehålla mer än 1 000 banor för en tillförlitlig 2D-KDE.
Representative Results
Efter det detaljerade protokollet häri för framställning av lipid-dubbelskikt (SGB) som stöds i flödeskammare (figur 1) kan man tydligt känna igen ett fläckliknande mönster i den ursprungliga vyn av alla visade förhållanden (figur 2). Denna effekt orsakas av glasets ytjämnhet, som i allmänhet dominerar spridningssignalen och leder till visuellt oskiljbara förhållanden (glas, glas med SLB eller glas med SLB och bifogade proteiner). Förekomsten av vesiklar är emellertid tydligt distinkt på grund av vesiklarnas stora spridningstvärsnitt och möjliggör observation av vesiklarbrott och fusion till homogena membran (figur 2B och kompletterande film 1). När man tar bort den statiska spridningssignalen på glasytan med ett förhållandemetriskt tillvägagångssätt som betonar de dynamiska elementen inom synfältet24,25 kan man avslöja omärkta proteiner som diffunderar på membranet (figur 2D) medan en tom SLB (figur 2C) eller glas i sig (figur 2A) visas som en bullrig bild.
Den inneboende bakgrunden till MSPT-mätningar kan uppskattas lokalt genom att dividera varje pixelvärde genom medianen för n föregående och efterföljande pixlar i filmen vid samma bildposition (figur 3). Som ett resultat framträder makromolekyler som isotropa punktspridningsfunktioner (PSF) vars rörelse på membranet kan observeras, spåras och kvantifieras. Faktum är att tillgängligheten av både kontrast och dynamiskt beteende möjliggör den direkta relationen mellan en partikels molekylstorlek och dess respektive diffusiva beteende, allt utan att behöva märka partikeln. För att tolka iSCAT-kontrasten som bestäms under MSPT-experiment är det dock viktigt att utföra en kalibrering som översätter signalamplituden till molekylmassa. Detta kan uppnås genom att fästa biomolekyler med känd massa till en SLB via ett biotin-streptavidin-biotinkomplex (figur 4A). Som en exemplifierande strategi kan man använda biotinylerade varianter av bovint serumalbumin (BSA), protein A (prA), alkaliskt fosfatas (AP) och fibronektin (FN), som binder till streptavidin (STP) som i sig är bundet till biotinhaltiga lipider (Biotinyl Cap PE) i membranet. Som visas i figur 4A återspeglar den alltmer uttalade kontrasten hos dessa exemplifierande makromolekyler den ökande molekylvikten för respektive biotinylerade standarder. Genom att tilldela varje topp i kontrast histogrammen (figur 4B) till motsvarande massa av standardproteinets oligomertillstånd avslöjas ett linjärt förhållande mellan kontrast och massa21,22 och kan därefter användas för analys av okända makromolekylsystem (figur 4C).
Ett bra exempel som visar tillämpligheten och förmågan hos MSPT att analysera molekylvikter och därmed studera oligomertillstånd och oligomeriseringshändelser är övervägandet av biotinylerat aldolas och biotinylerat IgG (Figur 5). Aldolas rapporteras vanligen vara en homotetramer32. Massfördelningen som löses av MSPT har dock fyra distinkta toppar, vilket belyser närvaron av flera populationer (figur 5A). Medan den första mindre toppen motsvarar obebodd streptavidin och kan förväntas på grund av konfigurationen i denna typ av experiment, kan aldolaskomplex med endast två underenheter (2SU) eller sex underenheter (6SU) också detekteras (figur 5B). Intressant nog uppvisar tetra- och hexamera aldolas-streptavidinkomplex en reducerad diffusionskoefficient jämfört med dimeriskt aldolas och streptavidin ensamt, vilket indikerar ett ökat visköst drag, t.ex. via bindningen av en andra biotinylerad lipid till streptavidin. På samma sätt uppvisar biotinylerad IgG tre toppar i massfördelningen, med den första toppen som återigen matchar massan av en enda streptavidin. Massan av den vanligaste toppen motsvarar massan av en lätt och en tung kedja (1SU), dvs hälften av en IgG-antikropp. Den fullständiga antikroppen med två identiska halvor (2SU) detekteras i cirka 11% av fallen. Minskningen av diffusionskoefficienten med ökande komplexa storlekar indikerar interaktioner mellan streptavidin och mer än en biotinylerad lipid eller ytterligare drag orsakad av den bifogade IgG, eller båda.
Förutom den enda analysen av membranberoende oligomertillstånd, ger MSPT också den speciella fördelen att korrelera det diffusa beteendet hos en makromolekyl av intresse med dess oligomertillstånd. Representativa resultat för denna typ av analys visas för annexin V (AnV) respektive koleratoxinsubenhet B (CTxB), som binder till dioleoylfosfatidylserin (DOPS) respektive glykosfingolipider (GM1), införlivade i membranet (figur 6A). Båda kärndensitetsuppskattningarna (KDE) har unimodala fördelningar av massa och diffusion, vilket indikerar en enda riklig art med liknande diffust beteende. Topppositionen för molekylmassa och diffusionskoefficient befanns vara 49,8 ± 2,2 kDa respektive 1,4 ± 0,1 μm2/s för AnV samt 62,7 ± 3,1 kDa respektive 0,4 ± 0,1 μm2/s för CTxB. De uppmätta diffusionskoefficienterna är jämförbara med tidigare rapporterade värden erhållna från höghastighets AFM och FRAP33,34. Den något reducerade massan jämfört med massan av den förväntade makromolekylen (52 kDa för en AnV-trimer, 65 kDa för en CTxB-pentamer) kan indikera närvaron av mindre komplex med färre underenheter i ensemblen. Medan massskillnaden mellan proteinerna är liten och nära den angivna detektionsgränsen för mikroskopet (≈50 kDa), skiljer sig deras diffusionskoefficienter avsevärt. I en ekvimolär blandning, till exempel genom att jämföra diffusionen av blandningen med fördelningen av AnV och CTxB ensam, kan man dra slutsatsen att AnV är rikligare på membranet än CTxB (Figur 6B). Om koncentrationen av CTxB fördubblas jämfört med koncentrationen av AnV, förskjuts emellertid jämvikten mot CTxB som det dominerande proteinet på membranet. Som illustreras för blandningar av AnV och CTxB tillåter MSPT inte bara att diskriminera membranassocierade makromolekyler enligt deras molekylvikt utan möjliggör också diskriminering av olika makromolekylpopulationer beroende på deras diffusiva beteende.
Som med alla mikroskopitekniker är vissa experimentella krav avgörande för att uppnå önskad datakvalitet. Ett viktigt exempel i detta sammanhang är grundligt rengjorda täckglas. I allmänhet anses detta vara en förutsättning för mikroskopirelaterade enmolekylära experiment, men MSPT är särskilt känslig för provföroreningar. Den ökade spridningen från glasytan på orenade täckglas förhindrar kvantitativ iSCAT-mätning. I synnerhet kan även kvarvarande smuts eller dammpartiklar på otillräckligt rengjort glas orsaka anmärkningsvärda bildförvrängningar, igenkännliga som ljusa fläckar i det ursprungliga bildläget (figur 7A). Även om dessa defekter avlägsnas genom bakgrundsuppskattningen på grund av deras statiska natur, kan noggrann bestämning av en partikels kontrast försämras och därmed negativt påverka dess kvantitativa analys. Ett annat vanligt problem som uppstår i MSPT-experiment är de återstående vesiklarna som antingen flyter (omgivna av orange) genom synfältet eller osmälta vesiklar som sitter fast (omgivna i blått) vid en specifik position på membranet och framträder som stora pulserande spridare (Figur 7B). För att minimera deras förekomst och störning av filmförvärv rekommenderas att noggrant tvätta SLB innan proteinet tillsätts och att använda nyberedda blandningar av små unilameller vesiklar (SUV) och tvåvärda katjoner.
En faktor som måste beaktas vid utformningen av masskänsliga partikelspårningsexperiment är densiteten hos makromolekyler associerade med membrangränssnittet. Höga partikeldensiteter på membranet kan faktiskt orsaka problem av två skäl: i) Kopplingen av partikeldetektioner från på varandra följande ramar till banor blir tvetydig och ökar därmed sannolikheten för fel och felbedömda diffusionskoefficienter. ii) Massan av partiklar, som extraheras från amplituden för deras motsvarande PSF-passform, underskattas systematiskt och masstopparna breddas eftersom separationen av den statiska bakgrundssignalen från den dynamiska partikelsignalen blir allt svårare (Figur 7C). För närvarande är visuell bedömning av datakvalitet i processen att förvärva MSPT-videor svår på de tillgängliga kommersiella mikroskopen eftersom den implementerade ratiometriska vyn i förvärvsprogramvaran använder bakgrundsborttagningen som fastställts för massfotometri21 istället för den medianbaserade algoritmen som beskrivs här och i referenser24,25 (Figur 7D ). Den medelbaserade kontinuerliga bakgrundsavlägsnandet som används för att visualisera landningsmolekyler i massfotometri får diffusa partiklar att visas som mörka fronter med ljusa svansar, vilket gör att fläckarna verkar mycket anisotropa och stör PSF-montering under detektionsproceduren. Således är användningen av den implementerade medelbaserade bildbehandlingen i förvärvsprogramvaran olämplig för analys av diffusa biomolekyler på membran.
Figur 1: Processflödesdiagram över de enskilda steg som krävs för att analysera protein-membraninteraktioner med masskänslig partikelspårning (MSPT). För att förbereda prover för MSPT-mätningar måste glasskyddsglas rengöras noggrant och aktiveras med en syreplasma. Efter montering i provflödeskammare förbereds små unilamellära vesiklar (SUV) för stödda lipid-dubbelskiktsbildning (SLB) och alla reaktionsbuffertar filtreras för att minska bakgrundsspridningen. SUV läggs till för att bilda lipid-dubbelskikt i flödeskamrarna. Eventuellt kan tvåvärda katjoner som Ca2+ joner läggas till SUV: erna för att främja vesiklarbrott. Äntligen spolas låga koncentrationer av proteinet av intresse in i reaktionskammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inbyggd och förhållandemetrisk vy av exemplifierande ytor som är relevanta för MSPT-mätningar. Representativa bilder av ytjämnheten hos en glaslocksglidning (A), under bildandet av ett stött lipid-dubbelskikt (B), med ett intakt stött lipid-dubbelskikt (C) och av exemplifierande proteiner rekonstituerade på en SLB (D). Alla fyra exemplen visas i det ursprungliga läget, som kan nås under själva mätningen, och som bearbetade förhållandemetriska bilder efter medianbaserad bakgrundsborttagning. Skalstänger representerar 1 μm. För dataanalys (se medföljande Jupyter notebook; steg 9) användes följande parametrar: medianfönsterstorlek (window_length) = 1001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Steg-för-steg-diagram över de steg som krävs för insamling och analys av MSPT-data. Efter datainsamling för provet av intresse på massfotometern bearbetas filmer för att ta bort den statiska bakgrunden genom en pixelvis glidande medianmetod. Därefter identifieras kandidatpartiklar och monteras med en punktspridningsfunktion (PSF) innan de kopplas till partikelbanor. För att möjliggöra bestämning av diffusionskoefficienten för varje partikel används analys av genomsnittlig kvadrerad förskjutning (MSD) eller hoppavståndsfördelning (JDD). I detta skede kan kontrastvärden omvandlas till molekylmassor enligt kontrast-mass-relationen bestämd genom kalibreringsstrategin. Som ett sista steg kan banor filtreras baserat på deras längd eller membranpartikeldensitet och visualiseras genom tvådimensionell kärndensitetsuppskattning (2D-KDE). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kalibrering av förhållandet mellan massa och kontrast för MSPT-mätningar. (A) Representativa ratiometriska ramar erhållna för exemplifierande streptavidin-standardproteinkomplex som diffunderar på ett lipid-dubbelskikt som stöds innehållande en liten procentandel biotinylerade lipider (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE-förhållande på 70:29,99:0,01 mol%). Som modellmolekylviktsstandarder visas monovalent streptavidin28 (endast STP) eller tvåvärt streptavidin28 i komplex med antingen biotinylerat bovint serumalbumin (BSA), biotinylerat protein A (prA), biotinylerat alkaliskt fosfatas (AP) eller biotinylerat fibronektin (FN). Kandidatpunkter markeras i orange (streckade cirklar) och framgångsrika partikeldetekteringar markeras i rött (fasta cirklar). Skalstängerna representerar 1 μm. (B) Sannolikhetstäthetsfördelningar av kontrastvärden erhållna för de fem modellstandardproteinerna. Alla visade data representerar poolade fördelningar av tre oberoende experiment per villkor: STP endast n = 82 719; BSA n = 9 034; prA n = 22 204; AP n = 69 065 och FN n = 71 759 banor. Jämfört med partikelantal som bestäms för membran med proteiner är antalet partiklar som detekteras på ett tomt dubbelskikt försumbart vid måttliga membrandensiteter (kompletterande figur 1). Kontrasttoppar som beaktas för masskalibrering markeras genom kontinuerliga linjer medan streckade representerar oligomertillstånd som inte beaktas. (C) Kalibreringskurva för kontrast till massa härledd från toppkontraster i panel D och komplexens respektive sekvensmassor. Felstaplar visar standardfelet för de toppplatser som uppskattas av bootstrapping (100 omsamplingar med 1 000 banor vardera). För dataanalys (se Jupyter notebook; steg 9) användes följande parametrar: medianfönsterstorlek (window_length) = 1 001 bildrutor, detektionströskel (tröskverk) = 0,00055, sökområde (dmax) = 4 pixlar, minne (max_frames_to_vanish) = 0 bildrutor, minsta banlängd (minimum_trajectory_length) = 7 bildrutor (endast STP), 9 bildrutor (BSA/FN), 15 bildrutor (prA), 10 bildrutor (AP). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Dechiffrera oligomertillstånd av membranassocierade proteiner. (A) 2D-kärndensitetsuppskattningar av både massa och diffusionskoefficient för tetravalent streptavidin i komplex med biotinylerat aldolas (vänster panel) eller med en biotinmodifierad getanti-kanin IgG-antikropp (höger panel). Rekonstituering av båda komplexen har utförts på ett lipid-dubbelskikt som stöds innehållande DOPC, DOPG och Biotinyl Cap PE i ett förhållande av 70: 29,99: 0,01 mol% respektive. Totalt har 116 787 banor med tre oberoende replikat inkluderats för streptavidin-aldolaskomplexet (partikeldensitet 0,1 μm-2) och 348 405 för streptavidin-IgG-kompositen (partikeldensitet på 0,1 μm-2). Endast partiklar med en spårlängd på minst fem ramar inkluderades. Marginella sannolikhetsfördelningar av både molekylmassa (överst) och diffusionskoefficient (höger) presenteras. Det svarta krysset i båda panelerna markerar KDE:s respektive lokala maxima. (B) Jämförelse av bestämda oligomermassor för komplexet av tetravalent streptavidin med biotinmodifierat aldolas (vänster panel) eller biotinylerat IgG (höger panel) med, beroende på sekvensmassorna, förväntade molekylvikter. Förkortningen SU införs på uppdrag av proteinet i intressets underenhet. Felstaplar visar standardfelet för de toppplatser som uppskattas av bootstrapping (100 omsamplingar med 1 000 banor vardera). För dataanalys (se medföljande Jupyter notebook; steg 9) användes följande parametrar: medianfönsterstorlek (window_length) = 1 001 ramar, detektionströskel (tröskverk) = 0,00055, sökområde (dmax) = 4 pixlar, minne (max_frames_to_vanish) = 0 ramar, minsta banlängd (minimum_trajectory_length) = 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Upplösning av det diffusiva beteendet hos de inhemska membraninteragerande proteinerna annexin V (AnV) och koleratoxinsubenhet B (CTxB). (A) 2D-kärndensitetsuppskattningar av både mass- och diffusionskoefficient för annexin V (vänster panel) och koleratoxinunderenhet B (höger panel). För anV- och CTxB-membranrekonstituering har lipidkompositioner på 80:20 mol% DOPC till DOPS respektive 99,99:0,01 mol% DOPC till GM1 använts. Totalt har 206 819 banor med tre oberoende replikat inkluderats för AnV (partikeldensitet på 0,1 μm-2) och 142 895 banor för CTxB (partikeldensitet på 0,2 μm-2). (B) 2D-kärndensitetsuppskattningar av CTxB- och AnV-blandningar i förhållandet 1:1 (vänster panel) respektive 2:1 (höger panel). Rekonstituering av proteinblandningar utfördes på ett lipid-dubbelskikt som stöds innehållande DOPC-, DOPS- och GM1-lipider i ett förhållande av 80: 19,99: 0,01 mol%. Totalt har 42 696 banor med tre oberoende replikat inkluderats för 1:1-blandningen (partikeldensitet 0,1 μm-2) och 264 561-banorna för förhållandet 2:1 (partikeldensitet på 0,3 μm-2). För både (A) och (B) inkluderades endast partiklar med en spårlängd på minst fem ramar. Marginella sannolikhetsfördelningar av både molekylmassa (överst) och diffusionskoefficient (höger) presenteras. Det vita x:et i varje panel markerar respektive globalt maximum för KDE. För dataanalys (se medföljande Jupyter notebook; steg 9) användes följande parametrar: medianfönsterstorlek (window_length) = 1 001 ramar, detektionströskel (tröskverk) = 0,00055, sökområde (dmax) = 4 pixlar, minne (max_frames_to_vanish) = 0 ramar, minsta banlängd (minimum_trajectory_length) = 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Potentiella komplikationer i samband med MSPT-mätningar eller under dataanalys. (A) Representativa bilder av ytjämnheten som visas i både den ursprungliga och den bearbetade (medianbaserade bakgrundsborttagningen) ratiometriska vyn av en orenad täckglasglid. I båda fallen utgör ljusa fläckar kvarvarande ytföroreningar som hindrar artefaktfria mätningar. (B) Exemplifierande bilder av kvarvarande vesiklar i synfältet efter otillräcklig membrantvätt. Både statiska (markerade i blått) och diffusa (markerade med orange) vesiklar kommer att försämra mätkvaliteten antingen på grund av pulserande och vickande eller på grund av deras riktningsrörelse. (C) Som en enpartikelteknik kräver MSPT låga partikeldensiteter (representativ bild, övre panel) för att möjliggöra korrekt länkning och massbestämning av varje partikel. Vid höga membranpartikeldensiteter (mittpanel) försämras partikelpassningen, vilket påverkar massbestämningen (se nedre panelen). (D) Representativa förhållandemetriska bilder av partiklar som diffunderar på ett membrangränssnitt efter antingen medelbaserad (övre panel) eller medianbaserad bakgrundsborttagning. För diffusa partiklar producerar den medelbaserade strategin för borttagning av bakgrund förvrängda bilder av partikelns PSF, vilket kan ses i de små insatserna mellan den övre och mellersta panelen. Däremot kan oförvrängda partikel-PSF erhållas genom den medianbaserade metoden. Nedre panelen: Jämförelse av linjeprofiler genom mitten av PSF erhållen efter medel- eller medianbaserad bakgrundsborttagning. För alla inbyggda och ratiometriska bilder som visas i den här figuren representerar skalstaplarna 1 μm. För dataanalys (se medföljande Jupyter notebook; steg 9) användes följande parametrar: medianfönsterstorlek (window_length) = 1 001 ramar, detektionströskel (tröskverk) = 0,00055, sökområde (dmax) = 4 pixlar, minne (max_frames_to_vanish) = 0 ramar, minsta banlängd (minimum_trajectory_length) = 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Jämförelse av proteinfria och upptagna membran. Representativa bilder av ett intakt lipid-dubbelskikt före (A) och efter (B) tillsatsen av renat streptavidin (STP). Kandidatplatser som framgångsrikt passade till modellen PSF är omgivna i rött. (C) Kontrastsannolikhetsfördelningar av partiklar som detekteras på ett tomt membran (membranbakgrund, grått) och på ett dubbelskikt med diffusa streptavidinpartiklar (blå). Båda sannolikhetsfördelningarna representerar de sammande data från tre oberoende experiment med identiska filmförvärvs- och analysparametrar. För dataanalys (se medföljande Jupyter notebook; steg 9) användes följande parametrar: medianfönsterstorlek (window_length) = 1 001 ramar, detektionströskel (trösk) = 0,00055, sökområde (dmax) = 4 pixlar, minne (max_frames_to_vanish) = 0 ramar, minsta banlängd (minimum_trajectory_length) = 7 bildrutor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande film 1: Exemplifierande film som visar bristning och fusion av vesiklar till ett homogent membran inspelat med massfotometern. Medianfönsterstorlek för bildbehandling (window_length) = 1 001 bildrutor. Skalstång: 1 μm. Kamerans antal intervall: svart = 16 892; vit = 65 408. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 2: Exemplifierande filmer som visar diffusionen av annexin V (överst) och biotinylerat aldolaskomplex (botten) på ett dubbelskikt som erhållits från MSPT-mätningar. Medianfönsterstorlek för bildbehandling (window_length) = 1 001 bildrutor. Skalstång: 1 μm. Interferometriskt spridningskontrastområde: svart = -0,0075; vit = 0,0075. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Discussion
Det presenterade protokollet utökar massfotometri21, en teknik som analyserar massan av enskilda biomolekyler som adsorberar på glas, till ett ännu mer mångsidigt verktyg som samtidigt kan mäta massan och diffusionen av omärkta membran-interagerande biomolekyler. Denna analysutvidgning uppnås genom implementering av en modifierad strategi för borttagning av bakgrund anpassad till molekylernas laterala rörelse24,25. I allmänhet är bakgrundsborttagningen av yttersta vikt för iSCAT-baserade metoder, eftersom den starka spridningen av glasytans grovhet utgör det huvudsakliga analyshinderet, och den exakta bestämningen av varje pixels lokala bakgrund är avgörande för kvantifiering av partikelmassa och plats. Förutom bildanalysen anpassad till partikelrörelse fullbordar efterföljande partikeldetektering, banlänkning och dataanalys den nya expansionen av MP till masskänslig partikelspårning (MSPT).
I allmänhet är noggrant rengjorda glasskyddsglas och en ren arbetsmiljö kritiska krav för framgångsrik prestanda för MSPT-experiment. På grund av frånvaron av makromolekylmärkning är den förvärvade signalen i sig icke-selektiv. Rena prover, liksom korrekt provhantering, är därför avgörande för att säkerställa att observationer inte kan misstolkas. I synnerhet, när molekyler med låg molekylvikt undersöks, godkänns kontrollmätningar av proteinfria membran för att bedöma bakgrundsbidrag (kompletterande figur 1). Förutom införandet av kontrollmätningar rekommenderas det därför att följa de förberedelsesteg som visas i figur 2 för varje flödeskammare. När de kombineras kommer dessa säkerhetsåtgärder att säkerställa att den detekterade signalen härrör från biomolekylen av intresse och inte till exempel en förorenad flödeskammare, buffert eller membran.
Förutom försiktighetsåtgärderna när det gäller den experimentella designen måste man också vara försiktig under MSPT-bildbehandling. Under videobearbetning bör värdet för tre parametrar väljas noggrant för att säkerställa korrekta resultat: i) längden på medianfönstret för bakgrundsborttagning, ii) tröskeln för partikeldetektering och iii) den maximala sökradien under länktilldelningen. Ett större medianfönster (i) underlättar i allmänhet separationen av diffusa partiklar från den överlagrade kvasikonstanta bakgrunden. Men för för stora fönsterstorlekar kommer provdrift så småningom att märkas och minska noggrannheten i bakgrundsuppskattningen. Optimala inställningar beror starkt på provegenskaper och mätförhållanden. Ändå kan ett värde på 1 001 användas som en robust utgångspunkt. Tröskelparametern (ii) måste justeras beroende på den lägsta molekylmassa som förväntas i provet. Ett värde under 0,0005 rekommenderas inte för mätningar tagna med massfotometern som används i denna studie. För att påskynda analystiderna kan högre värden väljas om ett prov med hög molekylvikt förväntas. Sökradien i banlänkning (iii) anger det maximala radiella avståndet i pixlar där partikelns förskjutna plats kommer att sökas efter i på varandra följande ramar. Den bör anpassas till den snabbaste partikeln i provet, och om det gynnas kan ett adaptivt sökområde (se dokumentation av trackpy) istället användas för att minska beräkningstiden. Speciellt under den inledande fasen av ett projekt rekommenderas att analysera filmerna med olika parametrar för att validera de erhållna resultaten.
Mot bakgrund av MSPT: s enmolekylära natur bör det undvikas att mäta vid höga membranpartikeldensiteter eftersom de kan störa noggrann kontrast och massbestämning. Det har visat sig att densiteter under en partikel per kvadratmikrometer är gynnsamma för MSPT-mätningar24. Ett ytterligare övervägande är de förväntade diffusionskoefficienterna i provet. Även om det är tillämpligt på ett brett spektrum av diffusionskoefficienter har MSPT en lägre gräns för tillgängliga diffusionskoefficienter. Lokal inneslutning till ett område med få pixlar under en betydande del av medianfönsterperioden sammanfogar partikeln med den statiska bakgrunden. För de avbildningsförhållanden som används i detta protokoll rekommenderas inte mätning av diffusionskoefficienter under 0,01 μm2/s. Vid denna diffusionshastighet är till exempel den genomsnittliga kvadratiska förskjutningen av en partikel under medianfönstrets halvstorlek cirka 4 pixlar och därmed av liknande storlek som PSF: s omfattning. Som en konsekvens kommer den statiska bakgrundsuppskattningen sannolikt att innehålla signalbidrag från själva partikeln, vilket resulterar i en till synes minskad kontrast av partikeln tills den så småningom närmar sig ljudnivån. Makromolekyldiffusionskoefficienter mellan 0,05 och 10 μm2/s kan dock tydligt lösas.
För att ytterligare utöka utbudet av MSPT-applikationer kan man föreställa sig en utveckling av den medianbaserade bakgrundsalgoritmen genom eliminering av pixlar som tillfälligt är upptagna med en partikel eller genom korrigering av provavdrift som möjliggör större medianfönsterstorlekar. Båda metoderna skulle lindra problemen med mätningar vid höga partikeldensiteter och långsam diffusion. Förbättringar när det gäller lägre masskänslighet är i horisonten med en ny generation massfotometrar, vilket kan ge tillgång till biomolekyler mindre än 50 kDa. Därför kommer framtida MSPT-experiment att kunna studera enmolekyldynamik och membranrelaterade interaktioner för ett ännu bredare spektrum av membranmimiker som dämpade dubbelskikt och makromolekylära system.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi uppskattar verkligen stödet från Philipp Kukura, Gavin Young och Refeyns programvaruteam och erkänner deras hjälp genom att dela delar av bildanalyskoden. Vi tackar Cryo-EM MPIB Core Facility för att ge tillgång till den kommersiella Refeyn massfotometern. F.S. tar tacksamt emot det stöd och den finansiering som Jürgen Plitzko och Wolfgang Baumeister beviljat. T.H. och P.S. fick finansiering genom Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Project-ID 201269156 - SFB 1032 (A09). N.H. fick stöd av ett DFG-återvändandebidrag HU 2462/3-1. P.S. erkänner stöd genom forskningsnätverket MaxSynBio via det gemensamma finansieringsinitiativet från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) och Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
| biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
| cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
| cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
| Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
| Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
| GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
| Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
| Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
| pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
| pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
| Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
| Refeyn One | Refeyn Ltd. | - | mass photometer |
| sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
| tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
| Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
| Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | - |
References
- Robertson, J. L. The lipid bilayer membrane and its protein constituents. Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).
- Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. Signaling from the Living Plasma Membrane. Cell. 144 (6), 897-909 (2011).
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).
- Whited, A. M., Johs, A. The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).
- Gonzalez, L., Scheller, R. H. Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex. Cell. 96 (6), 755-758 (1999).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. Current methods for detecting cell membrane transient interactions. Frontiers in Chemistry. 8, 603259 (2020).
- Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications. Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601 (2018).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights. Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).
- Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution. Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).
- Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Kukura, P., et al. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
- Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
- Ueno, H., et al. Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution. Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).
- Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).
- Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle. Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).
- Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers. Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).
- Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis. Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLoS ONE. 11 (7), 0158457 (2016).
- Howarth, M., et al. A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).
- Allan, D., et al.
- Weimann, L., et al. A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations. PLoS ONE. 8 (5), 64287 (2013).
- Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914 (2010).
- Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).
- Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9 (1), 4983 (2018).
- Day, C. A., Kenworthy, A. K. Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes. PLOS ONE. 7 (4), 34923 (2012).
