Avaliação de um Biomarcador Confiável em um Modelo de Sepse de Camundongo Induzido por Ligadura Cecal e Punção

Summary

Este protocolo apresenta os detalhes operatórios da ligadura e punção cecal (FLP) em um modelo de sepse em camundongo. O CLP é uma das técnicas mais utilizadas para criar um modelo animal de sepse. Portanto, um protocolo CLP padronizado é necessário para a obtenção de resultados de pesquisa confiáveis.

Abstract

A sepse é uma doença grave com risco de vida e em rápido desenvolvimento que causa milhões de mortes anualmente em todo o mundo. Os pesquisadores fizeram enormes esforços para elucidar a fisiopatologia da sepse usando vários modelos animais; o modelo de sepse induzida por ligadura e punção cecal (FLP) em camundongos é amplamente utilizado em laboratórios. Os três aspectos técnicos que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de FLP são a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha utilizada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. O diagnóstico rápido e específico da sepse é um fator crucial que afeta o desfecho. O padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, esse processo é demorado e às vezes impreciso. A detecção de biomarcadores específicos de sepse é rápida, mas os biomarcadores existentes são insatisfatórios devido a uma meia-vida curta, inespecificidade e sensibilidade insuficiente. Portanto, há uma necessidade urgente de um biomarcador confiável de sepse nos estágios iniciais. Publicações anteriores sugerem que armadilhas extracelulares (TNEs) excessivas de neutrófilos ocorrem na sepse. A histona H3 citrulinada (CitH3), como componente NET, está elevada tanto em animais sépticos quanto em pacientes, e a presença de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse. O presente estudo teve como objetivo descrever um modelo padronizado de sepse induzida por FLP em camundongos e estabelecer um biomarcador sanguíneo confiável de sepse. Nosso trabalho pode contribuir para o diagnóstico precoce e preciso da sepse no futuro.

Introduction

A sepse é definida como disfunção de órgãos com risco de vida causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção¹, e o choque séptico é a principal causa de morte em casos graves de sepse². A sepse e o choque séptico causam milhões de mortes em todo o mundo a cada ano³. A chave para melhorar o desfecho de pacientes com sepse é o início imediato de tratamentos como antibióticos⁴. O método padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, a cultura microbiana é demorada e pode levar a resultados falso-positivos e falso-negativos, o que lim....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Revisão Animal do Hospital Xiangya e da Universidade Central do Sul (No. 202103149).

1. Preparação

1. Selecione camundongos machos C57BL/6J (peso: 20-25 g; idade: 8-12 semanas) e hospede por 3 dias antes de realizar qualquer procedimento.
2. Pese o mouse.
3. Anestesiar o rato com isoflurano a 1,5% por inalação e beliscar os dedos dos pés para verificar a profundidade da anestesia.
4. Fixe o mouse na almofada de aquecimento. Aplique creme depilatório no abdômen e deixe por não mais de 1 minuto a....

Results

Como mostrado na Figura 2A, nenhum CitH3 foi detectado no grupo sham por western blotting. A concentração sérica de CitH3 aumentou significativamente após a FLP, e esse aumento foi bloqueado pela inibição da formação de NET através da administração de YW3-56, um inibidor de DAP¹⁰. A Figura 2B mostra as concentrações séricas de CitH3 determinadas por ELISA. Às 24 h após a FLP, a concentração sérica de CitH3 foi aumentada nos grupo.......

Discussion

A FLP introduz patógenos no abdômen para criar um modelo pré-clínico de sepse. Ao realizar a FLP, é importante utilizar condições estéreis para eliminar a interferência de bactérias exógenas e utilizar dosagens precisas de anestésicos¹⁶. Os três aspectos técnicos da FLP que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de sepse são a porcentagem do ceco ligado, o tamanho da agulha usada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. A ligadura de aproximadamente 75% do .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			21G
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina	R& D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 anticorpo monoclonal	laboratório autodesenvolvido
anti-CitH3 anticorpo policlonal	Abcam	ab5103
anticorpo secundário anti-coelho	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL / 6 camundongos	Escola de Medicina Xiangya, Universidade
Cl-amidina	Sigma Aldrich	SML2250
			depilatório
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurano	Sigma-Aldrich	26675-46-7
cetoprofeno	Sigma Aldrich	PHR1375
suturas de seda (4-0 e 6-0)
instrumentos cirúrgicos e nbsp;
YW3-56	GLPBIO	GC48263