O método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal adulta (LG) está bem estabelecido para a indução da formação organoide LG e diferenciação em células acinar ou ductais.
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Artigo de método
Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A terapia à base de células-tronco (LG) é uma estratégia promissora para doenças lacrimais da glândula. No entanto, a falta de um método de cultura confiável e livre de soro para obter um número suficiente de células-tronco LG (LGSCs) é um obstáculo para novas pesquisas e aplicação. O método de cultura tridimensional (3D), sem soro para LGSCs de mouse adulto é bem estabelecido e mostrado aqui. Os LGSCs poderiam ser continuamente transicionados e induzidos a diferenciar-se para células acinar ou ductais.
Para a cultura primária lgsc, os LGs de camundongos de 6-8 semanas de idade foram digeridos com despase, colagenase I, e trypsin-EDTA. Um total de 1 × 104 células individuais foram semeadas em 80 μL de matriz de células-tronco de glândula gel-lacrimal (LGSCM) em cada poço de uma placa de 24 poços, pré-revestida com 20 μL de matriz de gel-LGSCM matriz. A mistura foi solidificada após a incubação por 20 min a 37 °C, e 600 μL de LGSCM adicionado.
Para a manutenção lgsc, os LGSCs cultivados por 7 dias foram desagregados em células únicas por despase e trippsin-EDTA. As células únicas foram implantadas e cultivadas de acordo com o método utilizado na cultura primária lgsc. Os LGSCs poderiam ser passagens mais de 40 vezes e expressar continuamente marcadores de células-tronco/progenitor Krt14, Krt5, P63 e nestin. Os LGSCs cultivados no LGSCM têm capacidade de auto-renovação e podem se diferenciar em células acinar ou ductais in vitro e in vivo.
Introdução
As células-tronco da glândula lacrimal (LGSCs) mantêm a renovação celular da glândula lacrimal (LG) e são a fonte de células acinar e ductais. Portanto, o transplante LGSC é considerado uma abordagem alternativa para o tratamento de danos inflamatórios graves e doença ocular seca deficiente aquosa (ADDED)1,2,3. Vários métodos de cultura foram aplicados para enriquecer lgscs. Tiwari et al. células LG primárias separadas e cultivadas usando colágeno I e gel de matriz complementados com vários fatores de crescimento; no entanto, as células LG não poderiam ser continuame....
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Protocolo
Todos os experimentos neste protocolo seguiram as diretrizes de cuidados com animais do Comitê Ético sobre Julgamento Animal da Universidade Sun Yat-sen. Todas as operações relacionadas à célula devem ser realizadas na bancada ultracleana na sala de operação da célula. Todas as operações usando xileno devem ser realizadas em capas de fumaça.
1. Cultura primária lgsc
- Isolamento LG
- Obtenha um rato macho BALB/c de 6-8 semanas de idade, e corte a pele atrás da orelha para expor o LG e o tecido conjuntivo ao seu redor. Retire o tecido conjuntivo por dissecção contundente com a ajuda de pinças e remova o LG.
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Resultados
Estabelecer sistema de cultura 3D e sem soro
Neste estudo, lgscm contendo EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSCs de mouse foi desenvolvido, e LGSCs foram isolados com sucesso e cultivados por um método de cultura 3D (Figura 1A). Um sistema de cultura 3D e sem soro de LGSCs de camundongos C57BL/6, ratos NOD/ShiLtJ, ratos BALB/c e camundongos ROSA26mT/mG foi estabelecido usando este método16. Para um rato macho, 1,5-2 × 106 célu.......
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Discussão
Existem métodos bem estabelecidos para o isolamento e cultura in vitro de células-tronco lacrimais para a cultura de células-tronco lacrimais e reparação de lesões LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 células-tronco lacrimal cultivadas e subculturadas com sucesso de ratos e camundongos por métodos de cultura 2D, respectivamente, possibilitando o transplante de células-tronco lacrimais para o tratamento de ADDED. Estudos sobre células-tronco
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31871413) e dois Programas de Ciência e Tecnologia de Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Somos verdadeiramente gratos aos pesquisadores que nos ajudaram durante o estudo e aos funcionários que trabalham no centro animal por seu apoio no cuidado com os animais.
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Materiais
Primer
Sequência
de NanjingSun Yat-sende Nanjing de Nanjing de imagem Thermo Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência BioRad Cortador de tecido congelado Roche de de purificação de água ultra pura Thermo <> Bálsamo neutro de de Oxido-Levedura de Triptona TRANSGEN CD201-01 Célula Quimicamente Competente: AQP5: F:
Sequência
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Animal (Mouse) | |||
| Bal B/C | Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade | ||
| C57 BL/6J | Centro de Animais de Laboratório da Universidade | ||
| NOD/ShiLtJ | Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade | ||
| ROSA26mT/mG | Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade | ||
| Equipamento | |||
| Balança analítica | Sartorius | ||
| Desidratador automático | Thermo | ||
| Câmara de contagem de sangue | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| Incubadora de temperatura constante CO2 | Sistema | ||
| ECL | Gel GE healthcare | ||
| Banho elétrico para banho-maria | Yiheng Technology | ||
| Aparelho de eletroforese | |||
| Lecia | |||
| Centrífuga horizontal | CENCE | ||
| Microscópio de fluorescência invertida | Nikon | ||
| Microscópio invertido | Olympus | ||
| Micrografia de varredura lamelar a laser | Carl Zeiss | ||
| Recipiente de nitrogênio líquido | Thermo | ||
| Baixa temperatura alta centrífuga de velocidade | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Forno de microondas | Panasonic | ||
| Nanodrop espectrofotômetro ultravioleta | Thermo | medir a concentração | |
| RNA Máquina de fatiar parafina | Amplificador Thermo | ||
| PCR | Eppendorf | ||
| Testador de valor de pH | Sartorius | ||
| 4 ° C Refrigerador | Haier | ||
| Oscilador de cultura termostática | ZHICHENG | ||
| Instrumento de incorporação de parafina de tecido | Thermo | ||
| -80° C Refrigerador de temperatura ultrabaixa | Thermo | ||
| -20 C Refrigerador de temperatura ultrabaixa | Sistema | ||
| ELGA | |||
| u>Reagente< / em>< / u | |||
| < forte > Animal Experiment< / forte > | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sódio | Sigma | 57-33-0 | |
| Cultura de Células | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Colagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Soro Bovino Fetal | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Humano FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (gel de matriz) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Inibidor de Tripsina (TI) | Sigma | T6522 | Derivado de Glycine max; pode inibir a tripsina, a quimotripsina e a plasminase em menor grau. Um mg inibirá 1,0-3,0 mg de tripsina. |
| Tripsina | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE coloração & Imunocoloração | |||
| Alexa Fluor 488 burro anti-Mouse IgG Thermo | A-21202 | Diluição usada: IHC) 2 μ g/mL, (IF) 0,2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-Coelho IgG Thermo | A-21206 | Diluição usada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 568 burro anti-Mouse IgG Thermo | A-10037 | Diluição usada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 568 burro anti-Coelho IgG Thermo | A-10042 | Diluição usada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 4 μ g/mL | |
| Anti-AQP5 anticorpo de coelho | Abcam | ab104751 | Diluição usada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0,1 μ g/mL |
| Anti-E-caderina Anticorpo de rato | Abcam | ab11512 | Diluição usada: (IF) 5 μ g/mL |
| Anti-Keratin14 anticorpo de coelho | Abcam | ab181595 | Diluição usada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Anti-Ki67 anticorpo de coelho | Abcam | ab15580 | Diluição usada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 1 μ g/mL |
| Anticorpo de camundongo anti-mCherry | Abcam | ab125096 | Diluição usada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Anti-mCherry anticorpo de coelho | Abcam | ab167453 | Diluição usada: (IF) 2 μ g / mL |
| C6< / sub>H < sub>8< / sub> O7< / sub> | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Ácido Cítrico | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO CW0125 | ||
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Montagem Fluorescente Médio | Dako | S3023 | |
| Formalina | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Anticorpo anti-rato de cabra IgG (HRP) | Abcam | ab6789 | Diluição usada: 2 μ g/mL |
| de anticorpo IgG de cabra anti-coelho (HRP) | Abcam | ab6721 | Diluição usada: 2 μ g / mL |
| Hematoxilina | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (hidrogel de incorporação) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H < sub > 2 < / sub > O < sub > 2 < / sub > | Guangzhou Química | KD10 | |
| 30% Solução de peróxido de hidrogênio | Química de Guangzhou | 7722-84-1 | |
| Metanol | Química de Guangzhou | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| de Shanghai Yiyang | YY-neutro do bálsamo | ||
| Não-imunizado | BOSTER | AR0009 | |
| da parafina | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldeído | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Química | 57-50-1 | |
| Citrato de sódio tribásico di-hidratado | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sacarose | Guangzhou Química | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Composto | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xileno | Guangzhou Química | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Álcool | Guangzhou Química | 64-17-5 | |
| Clorofórmio | Guangzhou Química | 865-49-6 | |
| Brometo de Etídio | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Álcool Isopropílico | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO-Taq | ||
| DNA Polimerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (ácido nucleico mancha) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construção & Transfecção celular | |||
| Agar | OXID-ampicilina | ||
| Sigma | 69-52-3 | ||
| Cloranfenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Kit de extração de plasmídeo livre de endotoxina | Thermo | A36227 | |
| Kanamicina | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmídeo Kit de Transfecção | Thermo | L3000015 | |
| LR Kit de Reação | Thermo | 11791019 | |
| Kit de Extração de Plasmídeos | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Extrato | |||
| OXID- | |||
| Primers e Sequência | Company | ||
| CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC | Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT | Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAC R: GACCTCTCTAGGGTTCCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 vetor sem carga de lentivírus | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
Referências
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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Reimpressões e permissões
