Name: Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda um método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal de camundongos BALB/c. Esta técnica permite a expansão a longo prazo e diferenciação em células acinares e ductais, oferecendo um modelo valioso para regeneração da glândula lacrimal.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31871413) e dois Programas de Ciência e Tecnologia de Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Somos verdadeiramente gratos aos pesquisadores que nos ajudaram durante o estudo e aos funcionários que trabalham no centro animal por seu apoio no cuidado com os animais.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
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<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
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<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
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<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Existem métodos bem estabelecidos para o isolamento e cultura in vitro de células-tronco lacrimais para a cultura de células-tronco lacrimais e reparação de lesões LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 células-tronco lacrimal cultivadas e subculturadas com sucesso de ratos e camundongos por métodos de cultura 2D, respectivamente, possibilitando o transplante de células-tronco lacrimais para o tratamento de ADDED. Estudos sobre células-tronco<sup class="x...

As células-tronco da glândula lacrimal (LGSCs) mantêm a renovação celular da glândula lacrimal (LG) e são a fonte de células acinar e ductais. Portanto, o transplante LGSC é considerado uma abordagem alternativa para o tratamento de danos inflamatórios graves e doença ocular seca deficiente aquosa (ADDED)1,2,3. Vários métodos de cultura foram aplicados para enriquecer lgscs. Tiwari et al. células LG primárias separadas e cultivadas usando colágeno I e gel de matriz complementados com vários fatores de crescimento; no entanto, as células LG não poderiam ser continuamente cultivadas4. Usando cultura bidimensional (2D), as células-tronco derivadas do MOUSE LG foram isoladas por You et al.5 e Ackermann et al. 6, encontrado para expressar os genes marcadores de células-tronco/progenitor, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e poderia ser subcultado. No entanto, não há indicação clara de que essas células possam se diferenciar em células acinar ou ductais, e não há experimento de transplante para verificar o potencial de diferenciação in vivo.
Recentemente, as células c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- foram isoladas dos LGs do mouse por citometria de fluxo, encontradas para expressar marcadores celulares progenitores LG, como Pax6 e Runx1, e diferenciadas em dutos e acini in vitro. Em camundongos com ADICIONADO, a injeção ortotópica com essas células poderia reparar LGs danificados e restaurar a função secretary dos LGs2. No entanto, o número de células-tronco isoladas por este método foi pequeno, e não há condições de cultura adequadas para a expansão dos LGSCs isolados. Em resumo, é necessário estabelecer um sistema de cultura adequado para isolar e cultivar efetivamente LGSCs adultos com expansão estável e contínua para o estudo de LGSCs no tratamento de ADDED.
Organoides derivados de células-tronco ou células-tronco pluripotentes são um grupo de células que são histologicamente semelhantes aos órgãos relacionados e podem manter sua própria renovação. Depois que o organoide do intestino do camundongo foi cultivado com sucesso por Sato et al. em 20097, organoides de outros órgãos foram cultivados em sucessão, com base no sistema cultural de Sato, como vesículabiliar 8, fígado9, pâncreas10, estômago11, mama12, pulmão13, próstata14 e glândula salivar15 . Devido à alta proporção de células-tronco adultas antes da diferenciação celular na cultura organoide, o método de cultura organoide tridimensional (3D) é considerado ideal para o isolamento e cultura das células-tronco adultas da LG.
Um sistema de cultura LGSC de camundongos adultos foi estabelecido no presente estudo pela otimização do método de cultura 3D, livre de soro. É comprovado que os LGSCs cultivados tanto a partir de camundongos normais quanto adicionados apresentaram uma capacidade estável de autoconexão e proliferação. Após o transplante nos LGs do mouse adicionado, os LGSCs colonizaram os LGs prejudicados e melhoraram a produção de lágrimas. Além disso, os LGSCs fluorescentes vermelhos foram isolados de camundongos ROSA26mT/mG e cultivados. Este trabalho fornece uma referência confiável para o enriquecimento LGSC in vitro e autoenxerto LGSC na aplicação clínica para terapia adicional.

<table><tbody><tr><td>Animal (Mouse)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Centro de Animais de Laboratório da Universidade</td><td></td><td></td>Sun Yat-sen</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade</td><td></td><td></td> de Nanjing</tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desidratador automático</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de sangue</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante CO2</td><td>Sistema</td> de imagem Thermo <td></td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Gel GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho elétrico para banho-maria</td><td>Yiheng Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese</td><td></td> Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência BioRad <td></td><td></td></tr> Cortador de <tr><td></td><td></td> tecido congelado Roche <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga horizontal</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrografia de varredura lamelar a laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de nitrogênio líquido</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baixa temperatura alta centrífuga de velocidade</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop espectrofotômetro ultravioleta</td><td>Thermo</td><td>medir a concentração</td><td></td></tr> de <tr><td>RNA Máquina de fatiar parafina</td><td>Amplificador Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Testador de valor de pH</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Refrigerador</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscilador de cultura termostática</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de incorporação de parafina de tecido</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C Refrigerador de temperatura ultrabaixa</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&nbsp; C Refrigerador de temperatura ultrabaixa</td><td>Sistema</td> de purificação de água ultra pura Thermo <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reagente< / u</td>> <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>< forte > Animal Experiment< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sódio</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de Células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (gel de matriz)</td> <td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Derivado de Glycine max; pode inibir a tripsina, a quimotripsina e a plasminase em menor grau. Um mg inibirá 1,0-3,0 mg de tripsina.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE coloração & Imunocoloração</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-Mouse IgG Thermo</td><td></td><td>A-21202</td><td>Diluição usada: IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 0,2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-Coelho IgG Thermo</td><td></td><td>A-21206</td><td>Diluição usada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-Mouse IgG Thermo</td><td></td><td>A-10037</td><td>Diluição usada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-Coelho IgG Thermo</td><td></td><td>A-10042</td><td>Diluição usada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 4 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-AQP5 anticorpo de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Diluição usada: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 0,1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-E-caderina Anticorpo de rato</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Diluição usada: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Keratin14 anticorpo de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Diluição usada: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 anticorpo de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Diluição usada: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo de camundongo anti-mCherry</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Diluição usada: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry anticorpo de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Diluição usada: (IF)&nbsp; 2 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>C6H 8 O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB Kit (20x)</td><td></td> <td>CWBIO CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Montagem Fluorescente Médio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato de cabra IgG (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Diluição usada: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de anticorpo IgG de cabra anti-coelho (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Diluição usada: 2 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (hidrogel de incorporação)</td> <td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H 2 O 2 </td> <td>Guangzhou Química</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Química de Guangzhou</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Química de Guangzhou</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td> Bálsamo neutro de <td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>de Shanghai Yiyang</td><td>YY-neutro do bálsamo</td><td></td></tr><tr><td>Não-imunizado</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>da parafina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Química</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico di-hidratado</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Guangzhou Química</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. Composto</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Guangzhou Química</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Álcool</td><td>Guangzhou Química</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Guangzhou Química</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Isopropílico</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA Polimerase</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (ácido nucleico mancha)</td> <td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Construção & Transfecção celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXID-ampicilina</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de plasmídeo livre de endotoxina</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 Plasmídeo Kit de Transfecção</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR Kit de Reação</td><td>Thermo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Extração de Plasmídeos</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha; Extrato</td><td></td> de Oxido-Levedura <td></td> de Triptona TRANSGEN CD201-01 <td></td>Célula Quimicamente Competente</tr> <tr><td></td><td>OXID-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers e Sequência</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Primer: AQP5 Sequência: F:<td></td></tr><tr><td> CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAC R: GACCTCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 vetor sem carga de lentivírus</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

A terapia à base de células-tronco (LG) é uma estratégia promissora para doenças lacrimais da glândula. No entanto, a falta de um método de cultura confiável e livre de soro para obter um número suficiente de células-tronco LG (LGSCs) é um obstáculo para novas pesquisas e aplicação. O método de cultura tridimensional (3D), sem soro para LGSCs de mouse adulto é bem estabelecido e mostrado aqui. Os LGSCs poderiam ser continuamente transicionados e induzidos a diferenciar-se para células acinar ou ductais.
Para a cultura primária lgsc, os LGs de camundongos de 6-8 semanas de idade foram digeridos com despase, colagenase I, e trypsin-EDTA. Um total de 1 × 104 células individuais foram semeadas em 80 μL de matriz de células-tronco de glândula gel-lacrimal (LGSCM) em cada poço de uma placa de 24 poços, pré-revestida com 20 μL de matriz de gel-LGSCM matriz. A mistura foi solidificada após a incubação por 20 min a 37 °C, e 600 μL de LGSCM adicionado.
Para a manutenção lgsc, os LGSCs cultivados por 7 dias foram desagregados em células únicas por despase e trippsin-EDTA. As células únicas foram implantadas e cultivadas de acordo com o método utilizado na cultura primária lgsc. Os LGSCs poderiam ser passagens mais de 40 vezes e expressar continuamente marcadores de células-tronco/progenitor Krt14, Krt5, P63 e nestin. Os LGSCs cultivados no LGSCM têm capacidade de auto-renovação e podem se diferenciar em células acinar ou ductais in vitro e in vivo.

Estabelecer sistema de cultura 3D e sem soro Neste estudo, lgscm contendo EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSCs de mouse foi desenvolvido, e LGSCs foram isolados com sucesso e cultivados por um método de cultura 3D (Figura 1A). Um sistema de cultura 3D e sem soro de LGSCs de camundongos C57BL/6, ratos NOD/ShiLtJ, ratos BALB/c e camundongos ROSA26mT/mG foi estabelecido usando este método16. Para um rato macho, 1,5-2 × 106 célu...

O método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal adulta (LG) está bem estabelecido para a indução da formação organoide LG e diferenciação em células acinar ou ductais.

Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Este protocolo fornece uma estratégia vantajosa para enriquecer células-tronco da glândula lacrimal para a regeneração e reconstrução da glândula lacrimal. As células-tronco da glândula lacrimal mostram a capacidade de expansão a longo prazo e o potencial de diferenciação. A principal vantagem dessa técnica é que o meio de cultura para células-tronco da glândula lacrimal é livre de soro, o que mostra o enorme valor para o reparo da glândula lacrimal Comece obtendo um rato macho BALB/c de seis a oito semanas de idade e cortando a pele atrás da orelha para expor a glândula lacrimal e o tecido conjuntivo ao seu redor.Retire o tecido conjuntivo por dissecção contundente com a ajuda de pinças e remova a glândula lacrimal. Mergulhe as glândulas lacrimais em um prato de seis centímetros com quatro mililitros de 75% de etanol por 10 segundos e enxágue imediatamente com solução PBS de 10 milimões duas vezes. Corte as glândulas lacrimais em pequenos fragmentos de cerca de um milímetro cúbico.Transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e trate os tecidos com 500 microliters de 25 unidades por mililitro despase e 500 microlitres de 0,1% colagenase I por uma hora a 37 graus Celsius

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Este protocolo descreve uma aproximação para produzir hepatospheres das pilhas de haste pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e um self-assembly da pilha. Este protocolo é reprodutível em um número de linhas de pilha, cost-effective e permite a produção de hepatospheres humanos estáveis para a aplicação biomédica.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

Este protocolo descreve como estabelecer, manter, modificar geneticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente e transplantar organoides da glândula lacrimal derivados de tecido primário de camundongo e humano.

Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando o uso de hidrogel como uma estrutura de cultura de células tridimensional (3D) para cultura de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) e introduzindo fotobiomodulação (PBM) para aumentar a proliferação de ADSCs dentro do ambiente de cultura 3D.

Cultura Celular Tridimensional de Células-Tronco Derivadas do Tecido Adiposo em Hidrogel com Aumento da Fotobiomodulação

Este protocolo descreve um método otimizado para dissociar glândulas lacrimais de camundongos envelhecidos para obter células individuais viáveis para sequenciamento de RNA unicelular. Digestão enzimática sequencial e manuseio suave preservam a integridade celular, resultando em suspensões de alta qualidade adequadas para isolamento específico por tipo celular e análise transcriptômica de alterações associadas ao envelhecimento nas populações de glândulas lacrimais.

Protocolo para Dissociação de Célula Única, Sequenciamento de RNA e Isolamento de Células Mioepiteliais e Fibroblastos das Glândulas Lagrimais e Salivares Envelhecidas

Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Aprenda um método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal de camundongos BALB/c. Esta técnica permite a expansão a longo prazo e diferenciação em células acinares e ductais, oferecendo um modelo valioso para regeneração da glândula lacrimal.

Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

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