O modelo de pino de fratura tibial é um modelo clinicamente relevante de trauma ortopédico que compreende uma fratura tibial aberta unilateral com fixação interna da haste intramedular e lesão simultânea do músculo tibial anterior. A sensibilidade térmica neste modelo pode ser medida usando um paradigma de placa quente de 45 s.
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Artigo de método
O modelo de pino de fratura tibial: um modelo de camundongo clinicamente relevante de lesão ortopédica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O modelo de pino de fratura tibial é um modelo de camundongo de trauma ortopédico e cirurgia que recapitula o complexo dano muscular, ósseo, nervoso e do tecido conjuntivo que se manifesta com esse tipo de lesão em humanos. Este modelo foi desenvolvido porque os modelos anteriores de trauma ortopédico não incluíam lesões simultâneas em vários tipos de tecido (osso, músculo, nervos) e não eram verdadeiramente representativos do trauma ortopédico complexo humano. Os autores, portanto, modificaram modelos anteriores de trauma ortopédico e desenvolveram o modelo de pino de fratura da tíbia. Este modelo de fratura modificado consiste em uma fratura tibial exposta unilateral com fixação interna da haste intramedular (IMN) e lesão simultânea do músculo tibial anterior (TA), resultando em alodinia mecânica que dura até 5 semanas após a lesão. Esta série de protocolos descreve as etapas detalhadas para realizar o modelo de pino de fratura tibial de trauma ortopédico clinicamente relevante, seguido por um ensaio de placa quente modificado para examinar as alterações nociceptivas após lesão ortopédica. Juntos, esses protocolos detalhados e reprodutíveis permitirão que os pesquisadores da dor expandam seu kit de ferramentas para estudar a dor induzida por trauma ortopédico.
Introdução
O trauma ortopédico é responsável por 25% de todas as lesões sofridas por quase 500 milhões de pessoas a cada ano em todo o mundo 1,2,3. O trauma ortopédico pode estar associado a danos complexos nos músculos, ossos, nervos e tecidos conjuntivos, necessitando de hospitalização e cirurgia para garantir uma recuperação adequada 3,4. A dor aguda e crônica após trauma ortopédico pode resultar em encargos físicos, psicológicos e financeiros significativos que afetam a qualidade de vida do paciente 1,4. Além disso, a cirurgia ortopédica para estabilizar e corrigir fraturas também está associada a dor pós-cirúrgica aguda e crônica intensa 5,6,7,8,9.
Os mecanismos subjacentes à dor aguda e crônica relacionada ao trauma precisam ser melhor compreendidos para desenvolver melhores tratamentos. Para conseguir isso, são necessários modelos pré-clínicos confiáveis, reprodutíveis e clinicamente relevantes. Como a maioria dos modelos animais de trauma ortopédico não envolvia lesões simultâneas em vários tipos de tecido (osso, músculo, nervos), eles não eram verdadeiramente representativos do trauma ortopédico complexo humano, por exemplo, trauma após quedas, acidentes com veículos motorizados ou lesões relacionadas à guerra10,11. Portanto, desenvolvemos o modelo de camundongo com pino de fratura tibial para examinar as principais manifestações dessa lesão, incluindo danos ao tecido ósseo e muscular e dor aguda e crônica11. O modelo de pino de fratura tibial consiste em uma fratura tibial exposta unilateral com fixação interna do NMI e lesão muscular TA simultânea. Cortes histológicos do TA mostram lesão no músculo no qual se desenvolve fibrose densa com perda associada de fibras musculares grandes e maduras já 2 semanas após a lesão. Além disso, o calo da fratura é aparente na tomografia microcomputadorizada (microCT) 4 semanas após a lesão e continua a sofrer remodelação11.
Vários ensaios de comportamento reflexivo e não reflexivo podem ser usados para avaliar os componentes sensoriais e afetivos da dor no modelo de pino de fratura da tíbia. Por exemplo, pode-se usar os filamentos de Von Frey para demonstrar hipersensibilidade mecânica neste modelo. De fato, os camundongos desenvolvem hipersensibilidade mecânica de longa duração na pata traseira ipsilateral após a cirurgia do pino de fratura da tíbia11. Outro paradigma comportamental particularmente útil é o ensaio de placa quente, que tradicionalmente mede a latência para a retirada da pata a um estímulo térmico. Embora este ensaio tenha sido usado por décadas12, verdadeiramente um padrão-ouro na pesquisa pré-clínica da dor, medir o comportamento reflexivo por si só tem suas limitações13. Como resultado, desenvolvemos um paradigma de placa quente modificado que pode capturar elementos de respostas reflexivas e não reflexivas no cenário de um estímulo térmico14.
Este ensaio de placa quente modificado determina a latência de resposta inicial como no teste original da placa quente e um período de observação estendido para registrar comportamentos nocifensivos adicionais. Ao categorizar esses comportamentos estendidos em categorias distintas (vacilar, lamber, guardar, pular), a resposta não reflexiva ao estímulo térmico pode ser capturada. O recuo é a remoção rápida da pata e/ou abertura dos dedos, mas o membro é rapidamente devolvido à placa quente. Lamber e morder as patas traseiras e dianteiras são definidos como lamber para análise. Guardar é a elevação contínua do membro além de quando a informação nociceptiva aferente termina. Finalmente, o salto é a remoção de todos os quatro membros da superfície da placa quente. Esses comportamentos podem ser analisados individualmente e agrupados com especial cuidado para ainda observar a latência inicial da resposta.
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Protocolo
Todos os métodos utilizados durante a realização desta pesquisa foram realizados em conformidade e com aprovação do Painel Administrativo de Cuidados com Animais de Laboratório da Universidade de Stanford (APLAC # 33114) de acordo com as diretrizes da American Veterinary Medical Association e da International Association for the Study of Pain. Os camundongos (C57BL / 6J, 9-11 semanas de idade na chegada, 11-12 semanas de idade no início do estudo) foram alojados 2-5 por gaiola e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h em um ambiente com temperatura controlada com acesso ad libitum a comida e água. Os camundongos machos pesavam aproximadamente 25 g no início do estudo. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais usados neste estudo.
1. Medições de comportamento de linha de base
- Como os camundongos aprendem rapidamente no ensaio de placa quente, não registre uma linha de base para camundongos neste ensaio. Em vez disso, compare os ratos com controles não feridos.
2. Anestesia/preparação
- Anestesiar o camundongo com isoflurano inalatório 2%-4%.
- Aperte o dedo do pé com uma pinça e use a perda do reflexo de pinça do dedo do pé para confirmar a profundidade da anestesia.
- Aplique lubrificante ocular generosamente nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- Coloque um pedaço de gaze sob o mouse e use uma tesoura para remover os pelos da perna direita do mouse até a articulação do joelho.
- Limpe o cabelo da área cirúrgica usando a gaze e, em seguida, descarte a gaze.
- Desinfete a área cirúrgica usando um cotonete embebido em solução de iodo.
3. Cirurgia
- Após a limpeza da área cirúrgica e confirmação da profundidade da anestesia, fazer uma incisão cutânea na superfície medial da perna direita, da tíbia distal até a tíbia proximal, parando ao nível da articulação inferior do joelho (Figura 1A).
- Seque a área com um cotonete com atenção especial à tíbia proximal.
- Usando uma broca com uma broca redonda de 0,6 mm, faça um orifício na extremidade proximal da tíbia ao nível da tuberosidade tibial, ~ 2 mm distal à linha articular (Figura 1B).
- Em seguida, insira uma agulha de 27 G através deste orifício/osteotomia no eixo medular do osso para estabelecer um canal e, em seguida, remova a agulha (Figura 1B).
- Em seguida, use uma serra de osso para marcar a tíbia na junção dos terços médio e distal (~ 5-6 mm distal ao local da osteotomia) do aspecto lateral causando trauma no músculo tibial anterior (Figura 1D).
CRÍTICO: Uma abordagem medial da fratura não produzirá lesão muscular. - Clampeie a extremidade proximal da tíbia, segure a extremidade distal da tíbia entre o polegar e o indicador e use contrapressão para completar a fratura óssea (Figura 1C).
- Reinsira a agulha 27 G no espaço intramedular, através da tíbia proximal, e avance-a através do local da fratura até o segmento distal do osso para alinhar a fratura.
NOTA: Um implante cerâmico de tamanho semelhante pode ser inserido em vez de uma agulha de 27 G em aplicações de imagem onde o metal é indesejável. Embora não seja realizado aqui, um possível implante a ser considerado é um parafuso de cerâmica (consulte a Tabela de Materiais). - Em seguida, corte a agulha / implante de plástico nivelado com o córtex tibial usando um alicate de corte.
- Limpe o sangue e confirme se o sangramento parou antes de prosseguir.
- Assim que o sangramento parar, feche a ferida usando uma sutura de seda 5-0 interrompida.
CRÍTICO: Não deixe o animal sozinho em nenhum momento da cirurgia. Observe o animal até que ele seja capaz de se mobilizar de forma independente e devolva-o aos seus companheiros de gaiola somente quando estiver totalmente recuperado.
4. Após a cirurgia
- Após a cirurgia, administrar buprenorfina 0,05 mg kg-1 por injeção subcutânea nos camundongos duas vezes ao dia por dois dias de acordo com os protocolos locais.
- Monitore os camundongos no período pós-anestésico e durante o estudo da seguinte forma: duas vezes ao dia nos primeiros 2 dias e depois diariamente até 3 semanas e semanalmente a partir de então.
- Avalie os camundongos quanto a alterações comportamentais indicativas de estresse ou doença severa, como letargia, pelagem desgrenhada ou perda de peso de >20%. Tome nota de quaisquer questões relacionadas à mobilidade e acesso a alimentos ou água.
NOTA: Os registros cirúrgicos e pós-cuidados devem ser preenchidos após a cirurgia e a cada verificação e mantidos indefinidamente para auditoria do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
5. Teste de placa quente
NOTA: As medições pós-lesão podem começar 7 dias após a cirurgia do pino de fratura da tíbia. Para evitar o efeito do aprendizado neste paradigma, realize o teste uma vez após a cirurgia e compare com controles não lesionados.
- Configuração
- Coloque a placa de aquecimento em uma configuração em que a iluminação esteja acima da cabeça e o cilindro de plástico esteja centralizado na placa.
- Defina a temperatura para 50 °C e coloque uma câmera na frente da placa com cuidado para manter toda a área fechada à vista.
CRÍTICO: Uma câmera industrial colorida padrão de 8 bits, que grava até 76 fps, foi usada neste estudo.
- Análise
- Coloque os ratos dentro da sala de testes por pelo menos 30 minutos para se habituarem.
NOTA: Certifique-se de que a sala de teste não esteja muito quente ou fria para evitar distorcer os resultados. - Coloque o mouse no cilindro e comece a gravar.
- Registre movimentos por 45 s após os pés do mouse fazerem contato pela primeira vez.
- Repita as etapas 5.2.1-5.2.3 com o restante da coorte, mantendo a temperatura para cada tentativa subsequente.
- Meça a latência (em segundos) até a primeira resposta (geralmente vacilante), que é o resultado clássico da placa quente.
NOTA: O protocolo a seguir desenvolvido neste laboratório também pontua tanto reflexivo (vacilar) quanto não reflexivo (lamber, guardar e pular).
- Coloque os ratos dentro da sala de testes por pelo menos 30 minutos para se habituarem.
- Análise
- Marque as sessões de chapa quente usando um programa de exibição que fornece um carimbo de data/hora com milissegundos.
- Considere usar o NCH Prism Software em um Mac OS. Baixe este software gratuitamente online (consulte a Figura 2 e a Tabela de Materiais).
- Uma vez baixado, abra o programa e clique na opção Continuar a usar a versão demo. Em seguida, clique no grande sinal de mais verde para fazer upload das gravações da placa quente.
- Depois de carregado, clique duas vezes em um arquivo individual para abrir em formato de vídeo. Utilize o cursor na parte inferior da janela para arrastar lentamente pela duração do vídeo e começar a pontuar.
CRÍTICO: Independentemente do software usado, certifique-se de assistir aos vídeos na maior janela possível para evitar a perda de resolução de tempo ao arrastar o cursor de carimbo de data/hora pelo vídeo.
- Formate uma planilha da seguinte maneira.
- Para executar corretamente os scripts R fornecidos, escreva os títulos das colunas exatamente como listados abaixo, sem maiúsculas ou espaços e na ordem listada: mouseid, behavior, start, end.
- Insira os dados nas colunas inicial e final no tempo em s com três casas decimais, sem zeros ou dois pontos à esquerda (por exemplo: 2,001)
- Para cada vídeo, grave cada instância de um comportamento de dor (para ms). Observe que apenas os casos de comportamento de dor das duas patas traseiras são registrados. Não registre o comportamento das duas patas dianteiras.
- Registre o recuo/movimento simplesmente como "recuo", incluindo a retirada rápida da pata e/ou abertura dos dedos, mas o membro é rapidamente devolvido à placa quente, desde que não estejam explorando/andando. Conte a abertura dos dedos sem realmente levantar a pata inteira também como vacilar. Não registre o comportamento de vacilar/sacudir por mais de 500 ms. Se registrado como tal, arraste o cursor por esse comportamento o mais lentamente possível, pois é provável que vários vacilos e/ou defesas tenham ocorrido nesse período.
- Procure elevação/proteção prolongada de um membro além de quando a informação nociceptiva aferente termina e registre-a como guarda.
- Registre a lambida / mordida de uma pata traseira como lambida.
- Registre a remoção de todos os quatro membros da placa quente de uma só vez como salto.
NOTA: Se um mouse recuar e, em seguida, com a pata para cima, continuar a atender lambendo / guardando e, em seguida, dividir o comportamento sem qualquer sobreposição de carimbo de data/hora. Crie uma planilha separada para cada grupo experimental.
- Utilize os scripts R fornecidos para começar a analisar os dados.
- Use "Behavior_Raster_v2. R" para gerar um gráfico raster (como mostrado abaixo) para visualizar o comportamento geral.
- Use "Behavior_duration. R" para escrever uma planilha contendo cinco planilhas no diretório de trabalho.
NOTA: A primeira planilha fornece a duração total de todos os comportamentos de dor, a latência para o primeiro comportamento de dor e o número total de comportamentos de dor. Cada folha subsequente fornece essas informações para comportamentos individuais de dor. - Use "Behavior_bins. R" para escrever duas planilhas; um com compartimentos de 500 ms mostrando a duração cumulativa do comportamento em cada ponto de tempo e o outro com a área sob a curva para o perfil de comportamento duracional de cada mouse.
- Finalmente, use "Cumulative_Sums.R" para escrever duas planilhas, mas para soma cumulativa de um comportamento.
- Marque as sessões de chapa quente usando um programa de exibição que fornece um carimbo de data/hora com milissegundos.
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Resultados
O modelo de ortotrauma do pino de fratura da tíbia reproduz os comportamentos ósseos, musculares e dolorosos observados em lesões humanas complexas. Conforme mostrado na Figura 1C, a fratura da tíbia cicatriza com o tempo, formando um calo no local da fratura que ainda é visto 4 semanas após a lesão. Como resultado da abordagem lateral com a serra óssea descrita acima (passo 3.5), o músculo tibial anterior é lesado, tornando-se extensivamente fibrótico, como visto pelo aumento da deposição d...
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Discussão
Etapas críticas dentro do protocolo
É crucial manter condições estéreis durante toda a cirurgia. Além disso, o cuidado adequado com os animais antes, durante e após a cirurgia é fundamental para o sucesso da geração do modelo. Como mencionado anteriormente no protocolo, ao realizar a cirurgia, frature o osso pela lateral para garantir a lesão muscular. Tome cuidado para não fraturar a tíbia muito baixa (abaixo da junção recomendada entre os terços médio e distal da tí...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse relevantes a divulgar.
Agradecimentos
A GM é apoiada por uma bolsa de pós-graduação NDSEG e uma bolsa de pós-graduação honorária Stanford Bio-X. O VLT é apoiado pelo NIH NIGMS #GM137906 e pela Fundação Rita Allen.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 27 G agulhas | Medsitis | 305136 https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299 | |
| 5-0 | sutura esutura | SN5668 | https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/ |
| Cotonetes com álcool | Amazon | B00VS4F91W | https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W |
| Brocas alternativas | Rio Grande | 341602 | https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Conjunto0314mm/341602 |
| Acessório de broca para serra | óssea Amazon | B07DSXR3NY | https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY |
| Buprenorfina | Fidelis Pharmaceuticals | https://ethiqaxr.com/ordering/ | |
| Implante cerâmico (alternativa ao pino) | RISystem | RIS.221.103 | https://risystem.com/platefixation/mousescrew |
| Chux (Absorvente Underpad) | Fisher Scientific | NC0059881 | https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true |
| C57BL / 6J camundongos | The Jackson Laboratory | Jax #00664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| cotonetes | Uline | S-18991 | https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6 |
| alicate | de corteBrocas Amazon | B076XYVS6Y | https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y |
| Chewy | 129044 | https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127 | |
| Brocas | Amazon | B00HVIGSX2 | https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2 |
| Barbeador elétrico | Kent Scientific | CL9990-KIT | https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/ |
| Lubrificante para os olhos | Amazon | B07H2NLCX5 | https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5 |
| Compressas de gaze 2" x 2" | Amazon | B07GHDTB53 | https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53 |
| Almofadas de gaze 4" x 4" | Amazon | B00KJ6YFTC | https://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC |
| Câmera de vídeo de alta definição | The Imaging Source | DFK 22AUC03 | https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB |
| Anestesia inalatória sistema | Kent Scientific | https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/ | |
| Solução de iodo | Amazon | B005FR7XIK | https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK |
| Bastões de cotonete de iodo | Amazon | B001V9QKMG | https://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG |
| Isoflurano | Califórnia pet farmácia | https://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html | |
| NCH Prism Software | https://www.nchsoftware.com/prism/index.html | ||
| cilindro de plástico | Amazon | B08R5KM5B6 | https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6 |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335 | |
| Bisturi | Fisher Scientific | 12-000-162 | https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword= |
| Cabo de bisturi | Amazon | B0056ZX1R8 | https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8 |
| Thermal aparelho de preferência de lugar | BIOSEB | BIO-T2CT | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html |
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Reimpressões e permissões
