Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

Ruchika; Toshifumi Tshukahara; Manish Biyani

doi:10.3791/63591

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Artigo de método

Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

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DOI:

10.3791/63591

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21 de abril de 2022

Ruchika ¹ , Toshifumi Tshukahara¹ , Manish Biyani¹^,²

¹Department of Bioscience and Biotechnology, Japan Advanced Institute of Science and Technology, ²BioSeeds Corporation, JAIST Venture Business Laboratory, Ishikawa Create Labo

Neste artigo

Resumo

A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.

Resumo

A edição de RNA é um processo que leva a alterações de sequência pós-transcricional em RNAs. A detecção e quantificação da edição de RNA dependem principalmente de técnicas de sequenciamento de Sanger e sequenciamento de RNA. No entanto, esses métodos podem ser caros e demorados. Neste protocolo, um sistema portátil de eletroforese de gel de microtemperature (μTGGE) é usado como uma abordagem de não-sequenciamento para a rápida detecção da edição de RNA. O processo é baseado no princípio da eletroforese, que usa altas temperaturas para desnaturar amostras de ácido nucleico enquanto se movem através de um gel de poliacrilamida. Através de uma série de temperaturas, um fragmento de DNA forma um gradiente de DNA totalmente duplo para fios parcialmente separados e, em seguida, para DNA totalmente separado de uma única cadeia. Sites editados por RNA com bases nucleotídeas distintas produzem diferentes perfis de fusão em análises μTGGE. Utilizamos a abordagem baseada em μTGGE para caracterizar as diferenças entre os perfis de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não ditados correspondentes (tipo selvagem). Os Escores de Similaridade do Padrão (PaSSs) foram calculados comparando-se os padrões de banda produzidos pelas RNAs editadas e não diutadas e foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. No geral, a plataforma descrita aqui permite a detecção de mutações de base única em RNAs de forma simples, simples e econômica. Espera-se que esta ferramenta de análise ajude novas descobertas de biologia molecular.

Introdução

Variantes de nucleotídeos únicos (SNVs) em RNA genômica, incluindo variantes A-to-I, C-to-U e U-to-C, podem indicar eventos de edição de RNA. No entanto, a detecção de SNVs no RNA continua sendo uma tarefa tecnicamente desafiadora. Convencionalmente, a razão de RNA editado para RNA não diquedado é determinada por sequenciamento direto, reação em cadeia de polimerase em tempo real (PCR) específica de alelo ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) se aproxima^de 1,2,3,4,5,6.