O protocolo descreve um método passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos usando a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas a partir de células sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação.
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Artigo de método
Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A ubiquitinação é um tipo de modificação pós-translacional que regula não apenas a estabilidade, mas também a localização e a função de uma proteína de substrato. O processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula quase todos os processos biológicos celulares básicos. A purificação de proteínas ubiquitinadas auxilia na investigação do papel da ubiquitinação no controle da função das proteínas do substrato. Aqui, um procedimento passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos é descrito com a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação. A proteína p53 total celular marcada com Flag foi purificada com agarose conjugada com anticorpos anti-Flag em condições não desnaturantes. Alternativamente, a proteína ubiquitinada celular total marcada com His foi purificada usando resina carregada de níquel sob condições de desnaturação. As proteínas p53 ubiquitinadas nos eluídos foram detectadas com sucesso com anticorpos específicos. Usando este procedimento, as formas ubiquitinadas de uma determinada proteína podem ser eficientemente purificadas a partir de células de mamíferos, facilitando estudos sobre os papéis da ubiquitinação na regulação da função da proteína.
Introdução
A ubiquitina é uma proteína conservada evolutivamente de 76 aminoácidos 1,2,3. A ubiquitina liga-se covalentemente aos resíduos de lisina nas proteínas-alvo através de cascatas que envolvem enzimas ativadoras (E1), conjugantes (E2) e ligase (E3). A ubiquitina é ativada pela primeira vez pela enzima E1 e é então transferida para as enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, os ligases de ubiquitina E3 interagem com enzimas E2 carregadas de ubiquitina e proteínas de substrato e mediam a formação de uma ligação isopeptídica entre o terminal C da ubiquitina e um resíduo de lisina n....
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Protocolo
NOTA: As células H1299 foram gentilmente fornecidas pelo Banco de Células-Tronco da Academia Chinesa de Ciências e provaram ser negativas para a contaminação por micoplasma.
1. Cultura celular
- Para a cultura inicial, coloque 1 x 106 células de linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar humano, H1299 em uma placa de Petri de 10 cm com 10-12 mL de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), aditivo de glutamina a 1%, piruvato de sódio a 1% e antibióticos (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Manter as células a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO2
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Resultados
O diagrama esquemático mostra as proteínas p53 (Flag-p53) e His/HA double-tagged ubiquitina (HH-Ub) (Figura 1A). Os procedimentos utilizados para purificar proteínas ubiquitinadas estão resumidos na Figura 1B. A ubiquitina com etiqueta Poly-His pode ser ligada a proteínas-alvo em células de mamíferos. As proteínas ubiquitinadas podem ser purificadas com esferas Flag/M2 em condições não desnaturantes ou por cromatografia imobilizada de afinidade de íons metálicos.......
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Discussão
A ubiquitinação desempenha um papel crítico em quase todos os processos celulares fisiológicos e patológicos2. Nos últimos anos, grandes progressos têm sido feitos na compreensão do papel molecular da ubiquitina nas vias de sinalização e como as mudanças no sistema de ubiquitina levam a diferentes doenças humanas2. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para fornecer informações sobre os papéis exatos da ubiquitinação nesses processos. As misturas de proteínas c.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81972624) para D.L.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoetanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-ligado inteiro Ab (de ovelhas) | GE saúde | NA931 | Antibdoy secundário |
| Amersham ECL Rato IgG, HRP-ligado Ab inteiro (de burro) | GE saúde | NA935 | Antibdoy secundário |
| Anti-Bandeira M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG / M2 grânulos |
| Anticorpo monocolonal anti-GFP | Santa cruz | sc-9996 | Anticorpo primário |
| Anti-HA Alta afinidade | Roche | 11867423001 | Anticorpo primário |
| Anticorpo monocolonal Anti-Mdm2 (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Anticorpo |
| primário Anticorpo monocolonal anti-p53 (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Anticorpo primário |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvente |
| Fetal Bovino | Soro VivaCell | C04001-500 | |
| FBS FLAG Peptídeo | Sigma-Alddich | F3290 | Preparar tampão de eluição |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | suplemento |
| Guanidina-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvente |
| H1299 | Banco de células-tronco, Academia Chinesa de Laboratório | ||
| Software Bio-rad | |||
| Immidazol | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvente |
| Immobilon Western Chemluminescescente HRP Substrato | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 Reagentes | Invitrogen | 11668019 | Reagente de transfecção |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Inibidor de proteassoma |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvente |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvente |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvente |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvente |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | resina niquelada |
| Membrana de Nitrocelulose Blotting | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µ m tamanho dos poros |
| Opti-MEM meio sérico reduzido | Gibco | 31985-070 | Meio de transfecção |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Solução de penicilina-estreptomicina | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiótico |
| Coquetel de inibidores de protease | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Indústrias | Biológicas 01-100-1ACS | médio |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvente |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | suplemento |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvente |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvente |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagente |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | suplemento |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Ureia | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvente |
Referências
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine.
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Reimpressões e permissões
