Summary
Den præsenterede metode tilbyder en innovativ måde at konstruere biomimetiske fiberstrukturer i tredimensionelle (3D) stilladser (f.eks. Hjerteklapfoldere). 3D-printede, ledende geometrier blev brugt til at bestemme form og dimensioner. Fiberorientering og egenskaber var individuelt justerbare for hvert lag. Flere prøver kunne fremstilles i en opsætning.
Abstract
Elektrospinding er blevet en meget anvendt teknik inden for kardiovaskulær vævsteknik, da det giver mulighed for at skabe (mikro-)fibrøse stilladser med justerbare egenskaber. Formålet med denne undersøgelse var at skabe flerlags stilladser, der efterligner de arkitektoniske fiberegenskaber ved menneskelige hjerteklapfoldere ved hjælp af ledende 3D-trykte samlere.
Modeller af aortaklappen cusps blev oprettet ved hjælp af kommerciel computerstøttet design (CAD) software. Ledende polymælkesyre blev brugt til at fremstille 3D-trykte indlægsseddelskabeloner. Disse cusp negativer blev integreret i en specielt designet, roterende elektrospinning dorn. Tre lag polyurethan blev spundet på samleren og efterlignede fiberorienteringen af menneskelige hjerteklapper. Overflade- og fiberstruktur blev vurderet med et scanningselektronmikroskop (SEM). Anvendelsen af fluorescerende farvestof tillod desuden mikroskopisk visualisering af den flerlagede fiberstruktur. Trækprøvning blev udført for at vurdere stilladsernes biomekaniske egenskaber.
3D-print af væsentlige dele til elektrospinning riggen var mulig på kort tid for et lavt budget. Aortaklappens cusps oprettet efter denne protokol var trelags med en fiberdiameter på 4,1 ± 1,6 μm. SEM-billeddannelse afslørede en jævn fordeling af fibre. Fluorescensmikroskopi afslørede individuelle lag med forskelligt justerede fibre, hvor hvert lag præcist nåede den ønskede fiberkonfiguration. De producerede stilladser viste høj trækstyrke, især langs justeringsretningen. Udskrivningsfilerne til de forskellige samlere er tilgængelige som Supplerende fil 1, Supplerende fil 2, Supplerende fil 3, Supplerende fil 4 og Supplerende fil 5.
Med en højt specialiseret opsætnings- og workflowprotokol er det muligt at efterligne væv med komplekse fiberstrukturer over flere lag. Spinding direkte på 3D-trykte samlere skaber betydelig fleksibilitet i fremstillingen af 3D-former til lave produktionsomkostninger.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste dødsårsag i vestlige lande 1. Selv om der forskes grundigt i dette område, vurderes det, at byrden ved degenerativ hjerteklapsygdom vil stige yderligere i løbet af de næste år2. Kirurgisk eller interventionel udskiftning af hjerteklappen er mulig som en terapeutisk mulighed. På dette tidspunkt er mekaniske og bioprotetiske hjerteklapper tilgængelige, begge med individuelle ulemper. Mekaniske ventiler er trombogene og kræver livslang antikoagulation. Selvom biologiske ventiler ikke kræver antikoagulation, viser de mangel på ombygning, en høj forkalkningshastighed og samtidig nedbrydning3.
Vævskonstruerede hjerteklapper kan muligvis løse disse ulemper ved at indføre et mikrofibrøs stillads i kroppen, der tillader in vivo-ombygning. Forskellige metoder, f.eks. elektrospinding (ESP), decellularisering, mikroformning, spray, dip-coat og 3D-bioprint, er tilgængelige. Disse metoder kan vælges til at skabe specifikke egenskaber, være billigere og hurtigere eller bare på grund af mangel på alternativer. Metoder og materialer kan endda kombineres for at skabe mere komplekse strukturer4. For eksempel har ESP været en standardteknik til at skabe stilladser inden for vævsteknik, hvilket muliggør kombination af forskellige materialer og justering af fiberdiametre, fiberorienteringer og porøsiteter4. Desuden giver en række efterbehandlingsteknikker mulighed for optimeret vævsombygning, forbedret hæmokompatibilitet og justerbar bionedbrydning af elektrospundet stilladser 5,6,7.
Basic ESP bruger enten statiske eller roterende samlere, som har en direkte indflydelse på graden af fiberjustering og de opnåede fiberdiametre8. På grund af produktionsbegrænsninger består klassiske ESP roterende samlere af roterende tromler, skiver, ledninger eller metalstænger. Indførelsen af 3D-udskrivning giver mulighed for at skabe mere individualiserede samlergeometrier, der ikke er begrænset af traditionelle fremstillingsteknikker. Denne individualisering er især nyttig til oprettelse af 3D-konstruktioner såsom hjerteklapfoldere.
Den naturlige trelags (fibrosa, spongiosa, ventricularis) arkitektur af humane hjerteklapfoldere er vævets reaktion på de mekaniske kræfter og forskydningsstress, de udsættes for under hjertecyklussen 9,10. Fibrene i lamina fibrosa er orienteret omkreds, mens fibrene i lamina spongiosa er tilfældigt justeret og lamina ventricularis radialt. Et tredobbelt lag med de tilsvarende fiberretninger foreslås således at efterligne egenskaberne af disse ventiler i et vævskonstrueret stillads.
Workflowprotokollen beskriver en innovativ metode til at producere trelags 3D-hjerteklapfoldere ved hjælp af 3D-print og elektrospinding. Derudover præsenteres et kvalitetskontroltrin for at sikre nøjagtig fiberorientering i hvert lag.
Protocol
1. Forberedende arbejde
- 3D-udskrivning
BEMÆRK: Følgende trin kræver download af STL-filerne (Standard Triangle Language), der leveres som supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4 og supplerende fil 5 med dette manuskript. Samlerdele leveres som STL-filer. Forbindelsesflangen leveres som "STandard for the Exchange of Product Model Data" (STEP) -filen for at muliggøre justering af samleren, så den passer til individuelle opsætninger. Desuden er der tilvejebragt en teknisk tegning til de centrale metalstænger til konventionel fremstilling som supplerende fil 6.- Åbn udskæringssoftwaren (se tabellen over materialer), og konfigurer det aktive skrivehoved til ikke-ledende polymælkesyre (PLA) og en 0,4 mm dyse.
BEMÆRK: Udskæringssoftware, filament og dysediameter kan variere afhængigt af den tilgængelige 3D-printer. - Upload STL-filerne Specimen_mount_A (Supplemental File 3) og Speciment_mount_B (Supplemental File 4) til udskæringssoftwaren.
- Drej modellerne, så de trekantede overflader placeres på byggepladen.
- Marker alle dele, højreklik, og vælg Multiplicer valgte modeller. Indtast 1 i prompten Antal kopier, og klik på OK. Placer i alt fire modeller på byggepladen.
- Indstil udsnitstykkelsen til 0,1 mm, vægtykkelsen til 1 mm, udfyldningstætheden til 40 %, og fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Generer support .
- Klik på knappen Udsnit | Gem i Flytbar for at gemme udskrivningsfilen på et USB-drev.
- Læg ikke-ledende PLA i printeren, og start udskriftsfilen.
- Når udskriften er afsluttet, skal du fjerne modellerne fra byggepladen og kontrollere, om der er vridning i de nederste hjørner.
- I udskæringssoftwaren skal du beholde materialeparametrene og erstatte modellerne med Collector_Flange (Supplerende fil 1 og Supplerende fil 5) og Leaflet_Template (Supplerende fil 2).
- Drej flangen, så den flade cirkulære overflade er mod byggepladen. Drej desuden brochureskabelonen, så den firkantede overflade placeres direkte på byggepladen.
- Marker flangen, og multiplicer modellen som i trin 1.1.4. Type 1 for at modtage 1 kopi og 1 original af flangemodellen på byggepladen.
- Markér brochuremodellen, og gang med 8 for at modtage i alt ni foldermodeller ved at følge de trin, der er beskrevet i 1.1.4.
- Indstil udsnitstykkelsen til 0,1 mm, vægtykkelsen til 1 mm, udfyldningstætheden til 80 %, og fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Generer support .
- Klik på knappen Udsnit | Gem i Flytbar for at gemme den nye udskrivningsfil på et USB-drev.
- Læg ledende PLA i printeren, og start udskrivningsprocessen.
- Når udskriften er afsluttet, skal du fjerne modellerne fra byggepladen. Fjern individuelle filamentfibre i bunden af indlægssedlen negativt forsigtigt med en trådskærer, hvis disse er til stede i brochuremodellerne (da der ikke blev brugt nogen støttestrukturer).
- Åbn udskæringssoftwaren (se tabellen over materialer), og konfigurer det aktive skrivehoved til ikke-ledende polymælkesyre (PLA) og en 0,4 mm dyse.
- Spindeopløsning
FORSIGTIG: Tetrahydrofuran (THF) og dimethylformamid (DMF) er skadelige opløsningsmidler, der ikke bør indåndes eller komme i kontakt med huden. Det anbefales kraftigt at bære opløsningsmiddelbestandige handsker og beskyttelsesbriller, mens du håndterer dem. Når du håndterer dem, skal du arbejde under en udstødningshætte, da de er ekstremt flygtige.- Anbring en vægt under udstødningshætten, og anbring en 200 ml skruelågsglasflaske på den. Tare skalaen.
- Hæld 50 ml DMF og 50 ml THF i glasflasken. Bemærk vægten af opløsningsmidlerne.
- Placer en magnetisk stang inde i flasken, læg flasken på en magnetisk omrører, og tænd den.
- Multiplicer den noterede vægt med 0,15 (= 15% w/v), og overfør den tilsvarende mængde polyurethan (PU) langsomt til glasflasken, der indeholder opløsningsmiddelblandingen (DIN 1310).
- Luk flasken og rør i mindst 12 timer ved stuetemperatur for at opnå en homogen opløsning.
2. Opsætning af elektrospinding
- Forsamling
BEMÆRK: Da folderstilladserne, der er skabt med den præsenterede opsamler, er relativt små, anbefales det valgfri brug af en tromledorn med stor diameter (D: 110 mm). Dette gør det muligt at skabe større, flerlags stilladser, hvilket vil være gavnligt for mikroskopisk, biokompatibilitet og biomekanisk vurdering.- Saml samleren ved hjælp af de 3D-printede dele og seks M3 x 15 skruer.
- Brug tre skruer til at fastgøre metalstængerne til en af flangerne.
- Skub en Specimen_mount_B mellem metalstængerne. Sørg for, at mellemrummene til skabeloner peger i den modsatte retning af flangen.
- Fyld de tre åbninger i Specimen_mount_B med skabeloner til hjerteklappens indlægssedler.
- Placer Specimen_mount_A ovenpå, og udfyld mellemrummene med skabeloner.
- Skub en anden Specimen_mount_A ind, og udfyld mellemrummene med skabeloner.
- Fixer skabelonerne ved at sætte den anden Specimen_mount_B ovenpå.
- Sæt den anden flange ovenpå, og brug M3-skruerne til at fastgøre den.
BEMÆRK: Sørg for, at indlægsseddelskabelonerne alle er orienteret i samme retning (lige kant af indlægssedlen parallelt med metalstængerne). - Anbring den samlede indlægsseddelopsamler i elektrospindingsopsætningen, og fastgør flangerne tæt til motoraksen (dvs. M6-skruer og vingemøtrikker) (figur 1).
FORSIGTIG: Da ledende PLA er mere sprød end almindelig PLA, skal du bruge en momentnøgle på 1,4 Nm ved fastgørelse af bolte, der lægger pres på materialet for at undgå at knække. - Placer en nåleholder 30 cm fra samleren.
- Fastgør en 14 gauge (G) nål med en flad spids i nåleholderen og fastgør den i højden af samlerens akse.
- Tilslut et fleksibelt, opløsningsmiddelbestandigt (f.eks. polytetrafluorethylen (PTFE)) rør til nålens Luer-lock-port.
BEMÆRK: DMF og THF opløser mange plastmaterialer. Det er nødvendigt at anvende opløsningsmiddelbestandige materialer, når du arbejder med disse opløsningsmidler, f.eks. metal- og glasværktøj. Når der kræves plastværktøj (dvs. sprøjte eller slange), skal du sørge for at bruge opløsningsmiddelbestandige materialer. - Før røret til sprøjtepumpen til senere tilslutning af den polymerfyldte sprøjte.
- Tilslutning af strømforsyningsenhed (PSU)
FORSIGTIG: Under opsætningen skal du sørge for, at strømforsyningen er afbrudt fra hovedstrømkilden.- Tilslut to afskærmede højspændingskabler til strømforsyningens anode og katode.
- Brug en krokodilleclips til at tilslutte kablet, der er tilsluttet katoden (- stangen) til 14 G-nålen. Kontroller forbindelsen mellem klip og nål. Styr derefter højspændingskablet, så det løber uden for det roterende område for at undgå interferens.
- Tilslut samleren til anoden (+ stangen) ved hjælp af en krokodilleclips og det andet højspændingskabel. Brug en glidering eller en glidekontakt ved hjælp af et strippet kabel til at skabe kontakt ved samlerens flange.
- Fremstilling af sprøjten
BEMÆRK: Dette trin skal udføres umiddelbart før spindeprocessen starter.- Fyld en 20 ml Luer-lock sprøjte med den spindeopløsning, der er fremstillet i trin 1.2.
- Tilslut sprøjten til det opløsningsmiddelbestandige rør, og skub opløsningen manuelt ind i slangesystemet, indtil en dråbe er synlig ved spidsen af nålen.
- Anbring sprøjten i sprøjtepumpen. Når pumpen er tændt, skal du indtaste følgende parametre: diameter: 19.129 mm; volumen: 5 ml; hastighed 3 ml/t.
3. Elektrospindingsproces
- Motor testkørsel
BEMÆRK: Fremstilling af samleren ved hjælp af 3D-udskrivning kan føre til off-center bevægelse af samleren. Derfor anbefales en testkørsel med lavere omdrejningshastigheder, men uden højspænding.- Åbn motorstyringssoftwaren ved at dobbeltklikke på ikonet på computeren.
- Tilslut til motorstyringen ved at klikke på knappen Tilslut .
- Efter tilslutning skal du vælge driftstilstanden Profilhastighed og klikke på fanen Operation i øverste venstre hjørne af skærmen.
- Vælg fanen Profilhastighed under knappen Hurtigt stop indrammet af en rød linje. Indtast følgende indstillinger: Målhastighed: 200 o / min; profil acceleration: 100; profil deceleration: 200; hurtigt stop: 5000.
BEMÆRK: Rotationsretningen skal være opad på nålesiden, som kan justeres ved at ændre tegnet i feltet "målhastighed" fra "+" til "-". - Start testkørslen, og kontroller samleren for ubalance. Hvis samleren kører problemfrit, skal du fortsætte med protokollen. Ellers skal motoren stoppes, og solfangeren justeres som beskrevet i trin 2.1.9.
- Stop motoren ved at klikke på knappen Tænd aktiveret , og skift målhastighed til 2.000 omdr./min.
- Fremstillingsprocessen
BEMÆRK: Elektrospinding er en proces med stor afhængighed af miljøparametre. Optimale elektrospinningsresultater blev opnået mellem 15-20% relativ luftfugtighed ved en temperatur mellem 21 og 24 °C.- Første lag
BEMÆRK: I opsætningsfasen kan der være dannet en tørret dråbe PU ved spidsen af nålen. Fjern dråben ved hjælp af et langt, ikke-ledende værktøj, hvis det er nødvendigt.- I motorstyringssoftwaren skal du klikke på knappen Aktivér betjening for at tænde motoren.
- Tænd for højspændingsstrømforsyningen, og juster spændingen for både anode og katode: minuspol (nål): 18 kV; plus stang (samler): 1,5 kV.
- Start sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 3 ml/t.
- Indstil en timer til 20 min.
- Overhold nålespidsen til dannelse af en skrædderkegle. Afhængigt af keglens form ved nålespidsen justeres spændingen ved katoden i trin på ±100 V, indtil der er etableret en stabil skrædderkegle.
BEMÆRK: Hvis faldet hænger, er spændingen for lav. Ustabil strømning kan dog indikere, at spændingen er indstillet for højt. - Vent i 20 minutter på, at cusp-skabelonerne er dækket tilstrækkeligt med fibre.
- Sluk for sprøjtepumpen.
- Sluk for PSU'en ved at dreje på afbryderen.
- Stop motoren ved at klikke på knappen Tænd aktiveret i motorstyringssoftwaren.
FORSIGTIG: For at forhindre skader fra bevægelige dele i systemet skal du vente, indtil samleren er stoppet helt, for at åbne testkammeret.
- Andet lag
- I motorstyringssoftwaren skal du ændre indgangsfeltet Målhastighed til 10 o / min.
- Gentag trin 3.2.1.1-3.2.1.9.
- Tredje lag
BEMÆRK: Før stilladserne er helt tørre, er de ekstremt følsomme over for mekanisk belastning. Vær meget forsigtig, når du udfører trin 3.2.3.2-3.2.3.6. Undgå at røre stilladserne/fibrene under disse trin, da stilladset kan blive gjort ubrugeligt.- Åbn forsigtigt skruerne, der forbinder kollektorflangerne med motoraksen, og fjern indlægsseddelopsamleren (figur 2B) fra elektrospindingsanordningen.
- Brug en skalpel til at skære de elektrospundede fibre langs den ydre kontur af hver indlægsseddelskabelon (figur 2C).
- Fjern flangen på den ene side af samleren.
- Træk de 3D-printede indsatser ud, og adskil indlægsseddelskabelonerne fra de ikke-ledende trekantede holdere.
- Drej alle brochureskabeloner med 90°, og saml samleren igen.
- Indsæt opsamleren i elektrospinningsopsætningen, og fastgør den tæt.
- Igen skal du kontrollere, om der er ubalance, før du fortsætter spindeprocessen.
- I motorstyringssoftwaren skal du ændre indgangsfeltet Målhastighed til 2.000 o / min.
- Gentag trin 3.2.1.1-3.2.1.9.
BEMÆRK: Når elektrospindingsprocessen er afsluttet, anbefales det stærkt at skylle slangen og nålen med ren DMF for at forhindre tilstopning af slangen.
- Fluorescerende farvede stilladser (valgfrit)
BEMÆRK: Fluorescerende farvestoffer bruges til at gøre fibrene synlige under et konventionelt fluorescensmikroskop. Dette er kun nødvendigt, mens du implementerer metoden og til kvalitetskontrol, efter at nye indstillinger er blevet anvendt. Brug af fluorescerende farvestoffer anbefales ikke ved fremstilling af stilladser ved hjælp af etablerede indstillinger.- Den spindeopløsning, der er fremstillet i trin 1.2, opdeles i tre lige store portioner i separate flasker.
- Ved hjælp af en skala måles 1 mg fluorescerende farvestof for hvert gram (0,1 vægt%) polymeropløsning. Gentag for alle tre fluorescerende farvestoffer (dvs. Fluorescein, Texas Red, 4',6-diamidino-2-phenylindol [DAPI]).
- Tilsæt farvestoffet til spindeopløsningen, luk flaskelåget og rør i 2-3 timer eller indtil homogenisering.
BEMÆRK: For at forhindre, at de fluorescerende farvestoffer falmer, skal du beskytte spindeopløsningen mod lys så meget som muligt, dvs. ved at placere et uigennemsigtigt dæksel over den magnetiske omrører. Processen for fluorescerende farvede stilladser ligner meget den standardproces, der er beskrevet i trin 3.2.1-3.2.3. - I trin 3.2.1 udskiftes standardsprøjten med en sprøjte fyldt med spindeopløsningen indeholdende det første fluorescerende farvestof.
- I trin 3.2.2 skal du udskifte den aktuelt anvendte slange og nål med nye eller rensede. Anbring derefter en sprøjte med spindeopløsningen indeholdende det andet fluorescerende farvestof i sprøjtepumpen.
- I trin 3.2.3 skal du igen udskifte slangen og nålen med nye eller rensede og udskifte sprøjten med en, der er fyldt med spindeopløsning indeholdende det tredje fluorescerende farvestof.
BEMÆRK: For at undgå forsinkelse under fremstillingsprocessen er det en fordel at bruge tre sæt slanger og nåle. Alternativt kan røret og nålen skylles grundigt med THF og DMF mellem produktionen af lag, indtil der ikke er nogen spindeopløsning indeholdende fluorescerende farvestof tilbage i systemet.
- Første lag
4. Efterbehandling og prøveanskaffelse
- Efterbehandling af stilladser
- Fjern samleren fra elektrospindingsanordningen.
- Brug en skalpel til at skære hver skabelon fri i bunden som beskrevet i trin 3.2.3.2.
- Åbn samleren, som beskrevet ovenfor, og læg skabelonerne, bunden ned, på en bakke.
- Anbring bakken i et tørreskab natten over ved 40 °C.
- Når prøverne er tørret helt, skal du bruge en skalpel til forsigtigt at skære langs kanterne af indlægsseddelskabelonen for at fjerne overskydende fibre.
- Skræl derefter forsigtigt brochurestilladset på skabelonen og læg det på en bakke til videre behandling.
Representative Results
Denne protokol er rettet mod udviklingen af et tredobbelt lags indlægsseddelstillads bestemt til brug i kardiovaskulær vævsteknik af hjerteklapper. Det efterligner kollagenkonfigurationen af de tre lag i den oprindelige menneskelige hjerteventil. Hvert lag består af fibre med en samlet diameter på 4,1 ± 1,6 μm (figur 1).
Figur 1: Fiberegenskaber. Analyse af fibre: Samlet fiberantal; Diameter i μm: middelværdi, tilstand, standardafvigelse, minimal diameter, maksimal diameter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Indlægsseddelskabelonerne er designet til at passe til en Ø 24 mm aortaklapprotese (figur 2C). Efter tørring bevarede indlægssedlen stilladserne deres form af en 3D-hjerteklap (figur 3A).
Figur 2: Elektrospindingsopsætning. (A) Samlet 3D-printet opsamler i den roterende opsætning; B) CAD-gengivelse af den 3D-printbare samler C) CAD-gengivelse af hjerteklappens indlægsseddel negativt vist i B trekant angiver zoomet ind del. Forkortelse: CAD = computerstøttet design. Klik her for at se en større version af denne figur.
SEM-billeddannelse blev brugt til at vurdere de justerede og ikke-justerede lag (TEMP F3512-21). Fotografier blev taget ved 100x, 500x og 2.000x forstørrelse på tre forskellige steder på et stillads. Justerede fiberstilladser vises med en glat overflade og streng orientering i omkredsretningen (figur 3B). Visuel analyse af 2.000x billedet med hensyn til fiberorienteringen bekræfter den primære justering af fibrene (figur 3C). Ujusterede fiberstilladser viser en tilsvarende glat overflade sammenlignet med de justerede fibre. Fiberorientering er uordnet med mange fremtrædende skæringspunkter mellem fibre (figur 3D). Efterfølgende visuel analyse bekræfter uligning af fibre uden synlig primær orientering (figur 3E).
Figur 3: Elektrospundet folder og SEM-billeddannelse. (A) Elektrospundet flerlags folder og 3D-trykt foldersamler; (B) SEM-billede af ikke-justerede fibre (forstørrelse 1.000x); (C) Fiberorienteringsanalyse af ujusterede fibre; (D) SEM-billede af justerede fibre (forstørrelse 1.000x); (E) Fiberorienteringsanalyse af justerede fibre. Vægtstænger = 10 mm (A), 100 μm (B, D). Forkortelse: SEM = scanning elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Billeddannelse af fluorescerende farvede flerlags stilladser afslørede tre individuelle lag med forskellige fiberorienteringer (figur 4D). Bundlaget (figur 4A; blå) viser justerede fibre i vandret retning med meget lidt skæringspunkt mellem fibrene. Mellemlaget (figur 4B; grøn) viser ujusterede fibre uden primær fiberorientering. Det øverste lag (figur 4C; rød) viser justerede fibre i vinkelret retning. Visuel analyse af de øverste og nederste lag afslører en gennemsnitlig vinkel mellem de to lag på 89°, hvilket er i overensstemmelse med kollektorens 90° rotation under spindeprocessen (figur 4E).
Figur 4: Fluorescensmikroskopi af flerlags stillads. (A) Fluorescensbillede af det første lag med primær orientering fra nederst til venstre til øverst til højre; (B) Fluorescensbillede af det andet lag med ujusteret fiberorientering; C) Fluorescensbillede af det tredje lag med primær orientering fra nederst til højre til øverst til venstre D) Fluorescensbillede af alle tre lag kombineret i ét stillads (E) Fiberorienteringsanalyse for alle tre lag (lag 1: blå; Lag 2: grøn; Lag 3: rødt); forstørrelse = 400x (A-D); skalastænger = 100 μm (A-D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tykkelsesmåling blev udført på 21 prøver (figur 5A) (TEMP F3510-21). Alle prøver blev oprettet ved anvendelse af de samme parametre. Temperatur og fugtighed kan variere mellem 20,3 °C og 26,1 °C og henholdsvis 35 % og 55 % fugtighed. Resultaterne viste en relativt lineær stigning i tykkelsen på ~ 2,65 μm pr. Minut.
Et andet eksperiment viste konsistensen af resultaterne efter 60 minutters spinding under matchende parametre (figur 5B). Fugtighed og temperatur kan variere mellem henholdsvis 35 % og 50 % fugtighed og 20,3 °C til 26,1 °C. Resultaterne var stilladser mellem 126 og 181 μm i tykkelse. Den gennemsnitlige tykkelse var 151,11 ± 13,17 μm. Stigningen i tykkelse var ~ 2,52 μm pr. Minut i gennemsnit.
Figur 5: Tykkelsesmåling. (A) Tykkelse af stilladser pr. spundet tid; n = 21; Korrelationskoefficient (r) = 0,653; p** = 0,00132; B) Prøvernes tykkelse efter 60 minutter n = 13; rød linje: middelværdi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Træktest for justerede og ikke-justerede fiberstilladser blev udført i to retninger langs omkredsretningen og vinkelret på den. Hver fugemasse bestod af 15 prøver. Prøver blev taget ud af flystilladser i henhold til DIN 53504:2017-03. Tykkelsen blev målt på tre forskellige steder på hver prøve og brugt til at beregne de maksimale kraftværdier pr. Kvadrat mm.
Tykkelsesværdierne lå mellem 0,03 og 0,2 mm. Sammenligningen af den ultimative trækstyrke afslørede en signifikant forskel (p < 0,001) mellem orienteringer for de justerede fiberstilladser (figur 6A). Stilladserne nåede en maksimal styrke på 12,26 ± 2,59 N/mm2 langs omkredsen. Trækstyrken blev reduceret til 3,86 ± 1,08 N/mm2 i vinkelret retning.
Ujusterede fiberstilladser viser ingen forskel i den ultimative trækstyrke for de forskellige retninger (F1: 7,19 ± 1,75 N/mm2, F2: 7,54 ± 1,59 N/mm2; p = 0,60). Den sammenlignende analyse af forlængelsen ved brud for de justerede fiberstilladser afslørede signifikante forskelle (p < 0,001) i distensibilitet mellem retningerne (figur 6B). Udvidelsesmulighederne nåede 187,01 ± 39,37% i omkredsretningen sammenlignet med 107,16 ± 30,04% i vinkelret retning.
I modsætning hertil afslørede forlængelsen ved pause for de ikke-justerede fibermåtter ensartet strækbarhed i begge retninger (F1: 269,74 ± 24,78 % ; F2: 285,01 ± 25,58 %; p = 0,69). Repræsentative spændingsbelastningskurver viser enorme forskelle i materialets opførsel afhængigt af den retning, hvori trækkraften påføres. Ujusterede fibermåtter viste lineær elastisk adfærd, mens justerede fibermåtter viste ikke-linearitet i aksial retning.
Figur 6: Trækprøvning af justerede og ikke-justerede fibre. (A) Ultimativ trækstyrke for justerede og ikke-justerede fibermåtter i omkredsede og aksiale retninger; n = 15; B) Forlængelse ved brud for justerede og ikke-justerede fibermåtter i omkreds og aksial retning n = 15; C) Repræsentative spændings- og belastningskurver for justerede og ikke-justerede stilladser, trukket i henholdsvis aksiale og omkredsede retninger. (***p < 0.001). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Målepunkter for fremstilling | |||||||||
| Navn | Materiale | Beløb | Samlet tid | Samlet vægt [g] | Omkostninger [€ pr. kg] | Samlede omkostninger | |||
| 1 | Specimen_Mount_A | Regelmæssig PLA | 2 | 18:19 | 159 | 51,33 € | 8,16 € | ||
| 2 | Specimen_Mount_B | Regelmæssig PLA | 2 | 19:42 | 161 | 51,33 € | 8,26 € | ||
| 3 | Samler flange | Ledende PLA | 2 | 10:40 | 95 | 99,98 € | 9,50 € | ||
| 4 | Leaflet_Inlet | Ledende PLA | 9 | 05:32 | 31 | 99,98 € | 3,10 € | ||
| Total | 29,02 € | ||||||||
Tabel 1: Produktionsmålinger. Tabel, der angiver mængde, produktionstid, nødvendig mængde materiale og omkostninger til 3D-printede dele. Forkortelse: PLA = polymælkesyre.
Supplerende fil 1: Tilpasningsdygtig kollektorflange. Trinfil til tilpasning og udskrivning af kollektorflange. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Skabelon til folder. STL-fil til udskrivning af folderskabelon. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Prøvemontering A. STL-fil til udskrivning af prøvemontering A. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Prøvemontering B. STL-fil til udskrivning af prøvemontering B. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Samlerflange. STL-fil til udskrivning af samlerflange. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Tilslutning af metalstang. Teknisk tegning til konstruktion af forbindelsesmetalstænger. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den beskrevne protokol præsenterer to innovationer inden for (kardiovaskulær) vævsteknik: billig fremstilling af helt 3D-trykte fantomer til elektrospinding og brugen af en alsidig samler til at producere tilpasningsdygtige, flerlags hjerteklapfoldere.
For nylig er 3D-print blevet et værdifuldt værktøj til produktion af laboratorieudstyr, f.eks. bioreaktorer eller produktions- og testopsætninger11,12. Derfor var det muligt at fremstille elektrospinningsopsætningen, der blev præsenteret i denne undersøgelse, på kort tid og til et overkommeligt budget (tabel 1). Dette er i tråd med tidligere resultater for billig produktion af elektrospinningsopsætninger ved hjælp af 3D-print13.
Desuden er det efter forfatternes bedste overbevisning første gang, at et ledende 3D-printmateriale blev brugt til at skabe en elektrospinningsopsamler til hjerteklapfoldere. Indtil videre er 3D-printede samlere enten fremstillet ved metallasersintring14 eller ved hjælp af ikke-ledende polymerprint og efterfølgende efterbehandling med en ledende belægning15. I modsætning til denne nye tilgang er disse procedurer i en betydelig ulempe, da de er dyrere, tager meget længere tid eller kræver mere manuelt arbejde.
Elektrospinding afhænger af en lang række variabler, der påvirker morfologien af de skabte fibre. Selvom forskellige kommercielle elektrospinningsopsætninger er tilgængelige på markedet, bruger mange forskningsgrupper meget individualiserede opsætninger til at matche deres specifikke behov16. Under hensyntagen til dette skal de beskrevne værdier i denne protokol (spænding, afstand og rotationshastighed) muligvis tilpasses til individuelle opsætninger og bør ses som et udgangspunkt snarere end faste værdier. Desuden er det kendt, at miljøparametre kan have en betydelig indflydelse på elektrospindingsresultaterne17,18. Derfor anbefales det stærkt at kontrollere mindst temperatur og fugtighed i elektrospindingsriggen. Optimale elektrospinningsresultater blev opnået mellem 15-20% relativ luftfugtighed ved en temperatur mellem 21 og 24 °C. For at følge denne protokol er følgende udstyr afgørende: en motor, der er i stand til at accelerere en kollektor, der vejer ca. 300 g til en omdrejningshastighed på 2.000 o / min, en sprøjtepumpe, der er velegnet til små volumenstrømningshastigheder på 1-3 ml / t, og en topolet strømforsyningsenhed, der er i stand til ±20 kV jævnstrøm (DC).
I tråd med tidligere undersøgelser var det muligt at visualisere den fibrøse struktur af de elektrospundede stilladser ved fluorescensmikroskopi19. Det var muligt med succes at demonstrere stilladsets flerlagsstruktur, herunder de forskellige fiberorienteringer. Især når man arbejder med flere lag eller flere materialer, bør indførelsen af fluorescerende farvestoffer betragtes som en standardprocedure for streng kvalitetskontrol. Det kan forbedre den visuelle vurdering af resultater efter ændringer i parametrene eller arbejdsgangsprotokollen. Det kan ikke anbefales at anvende farvestof i stilladser, der skal anvendes til in vivo - eller in vitro-vurdering . Dette er vigtigt for at undgå interferens med etablerede analysemetoder.
Efterligning af naturlig hjerteklapmorfologi er af stor betydning for at producere en vævskonstrueret replikat, der skal bruges som en hjerteklapprotese (figur 4B). Det har vist sig, at den specifikke ventilgeometri har stor indflydelse på in vivo-ombygning 20. I denne sammenhæng er 3D-print af brochuregeometrien til elektrospinding en fordel, da iterationer er nemme og hurtige at implementere. Selv produktion af personlige ventilgeometrier er tænkelig, og efterfølgende udvikling af individuelle og personaliserede 3D-modeller af hjerteklapabnormiteter, for eksempel til undervisningsformål, er mulig.
Yderligere forbedring af vævskonstruerede hjerteklapegenskaber er i centrum for den nuværende forskningsindsats, da flere forskergrupper har arbejdet på at udvikle flerlags stilladser med definerede fiberorienteringer. Masoumi et al. fremstillede kompositstilladser fra et støbt polyglycerolbakatlag og elektrospundet polycaprolacton (PCL) fibermåtter21. Således kunne et tredobbelt lag skabes ud af to orienterede elektrospundet lag adskilt af et ark mikrofabrikeret polyglycerolbacate. Men i modsætning til stilladserne ved hånden var de hverken i en 3D-form eller efterlignede tilstrækkeligt mellemlaget (spongiosa). En anden tilgang til fremstilling af en bioinspireret vævskonstrueret hjerteklap blev forfulgt af Jana et al.22,23. De producerede med succes tredobbelte stilladser med orienterede fibre ved hjælp af aluminiumssamlere til PCL-baseret elektrospinding. Igen præsenterede disse stilladser også morfologiske ufuldkommenheder, da de kun har et 2D-udseende, og det endelige stillads er gennemtrængt af eger.
Selvom protokollen giver detaljerede oplysninger om, hvordan 3D, tredobbelte hjerteklapfoldere produceres, er der flere flere trin, der er nødvendige for at skabe en egentlig hjerteklapprotese. En stent med en diameter på 24 mm anbefales til de her beskrevne foldere. Som supplement til den anvendte stent kan brochurerne forsynes med yderligere støttestrukturer til syning. For at give maksimal fleksibilitet er de brochurer, der er vist her, ikke individualiseret til et specifikt stentdesign. Dette kan gøres ved blot at ændre skabelonen ved hjælp af CAD-software.
Selvom den anvendes til hjerteklapvævsteknik, vil den præsenterede metode være let anvendelig til elektrospinningopsætninger i ortopædi24, urologi25, otolaryngologi26 og andre. Produktionen af sofistikerede og /eller individualiserede 3D-konstruktioner er mulig ved implementering af andre 3D-trykte samlere. Selvom samlerens materiale har ændret sig, forbliver princippet om elektrospinding intakt27. Derfor er brugen af forskellige polymerer teoretisk mulig, selvom justering af elektrospindingsparametrene kan være nødvendig.
Samlet set beskriver den præsenterede protokol en nem og omkostningseffektiv måde at fremstille flerlags hjerteklapfoldere på. Anvendelsen af 3D-udskrivning giver mulighed for hurtig tilpasning og ændringer af samleren og indsatserne. Dette muliggør produktion af patientspecifikke proteser uden en kompliceret fremstillingsproces af for eksempel metalsamlere. Flere prøver kan oprettes i en kørsel under identiske betingelser. Derfor kan materialedestruktive tests udføres på prøverne med den fordel, at der er (næsten) identiske dem tilbage til at opbygge den faktiske ventil. Inkluderingen af udskrivningsfilerne som supplerende filer i denne undersøgelse er beregnet til at understøtte udviklingen af flerlags hjerteklapstilladser. Denne nye elektrospindingsteknik har også et stort potentiale for andre områder af regenerativ medicin, da modificerede samlere og andre 3D-printede, roterende skabeloner er nemme at implementere.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), projektnummer MA 2186/14-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma - Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
References
- Van Camp, G.
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, Pt A 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -Z., Li, H. -P., Yang, J. -H., Wan, J., Yu, D. -G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
