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Artigo de método

Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida

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DOI:

10.3791/63605

⸱

1 de março de 2022

 ,  , 
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Neste artigo

Resumo

Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

Resumo

Como a superfície transparente do olho, a córnea é fundamental para uma visão clara. Devido à sua localização, este tecido é propenso a insultos ambientais. De fato, as lesões oculares mais encontradas clinicamente são aquelas para a córnea. Embora a cura de feridas na córnea tenha sido extensivamente estudada em pequenos mamíferos (ou seja, ratos, ratos e coelhos), estudos de fisiologia da córnea negligenciaram outras espécies, incluindo zebrafish, apesar do zebrafish ser um modelo clássico de pesquisa.

Este relatório descreve um método de realização de uma abrasão córnea em zebrafish. A ferida é realizada in vivo em peixes anestesiados usando uma rebarba ocular. Este método permite uma ferida epitelial reprodutível, deixando o resto do olho intacto. Após a abrasão, o fechamento da ferida é monitorado ao longo de 3 h, após o qual a ferida é reeptelializada. Usando microscopia eletrônica de varredura, seguida de processamento de imagem, a forma das células epiteliais e as saliências apical podem ser investigadas para estudar as várias etapas durante o fechamento da ferida epitelial da córnea.

As características do modelo de zebrafish permitem o estudo da fisiologia do tecido epitelial e do comportamento coletivo das células epiteliais quando o tecido é desafiado. Além disso, o uso de um modelo privado da influência do filme lacrimal pode produzir novas respostas sobre a resposta córnea ao estresse. Por fim, este modelo também permite a delineação dos eventos celulares e moleculares envolvidos em qualquer tecido epitelial submetido a uma ferida física. Este método pode ser aplicado à avaliação da eficácia da droga em testes pré-clínicos.

Introdução

Como a maioria da epitélio está em contato com o ambiente externo, elas são propensas a lesões físicas, tornando-as adequadas para o estudo dos processos de cicatrização de feridas. Entre os tecidos bem estudados, a córnea é um modelo extremamente útil na investigação dos aspectos celulares e moleculares da cicatrização de feridas. Como uma superfície externa transparente, fornece proteção física ao olho e é o primeiro elemento a focar a luz na retina. Embora a estrutura e a composição celular da retina diferem entre as espécies1, esses elementos da córnea são geralmente semelhantes em todos os olhos do tipo câmera, independentemente das espécies.

A córnea é composta por três camadas principais2. A primeira e mais externa camada é o epitélio, que é constantemente renovado para garantir sua transparência. A segunda camada é o estroma, que contém células dispersas, chamadas queratócitos, dentro de uma espessa camada de fibras de colágeno estritamente organizadas. A terceira e mais interna camada é o endotélio, que permite a difusão de nutrientes e líquidos da câmara anterior para as camadas externas. As células epiteliais e estromal interagem através de fatores de crescimento e citocinas3. Esta interação é destacada pela rápida apoptose e posterior proliferação de ceratocitos após lesão epitelial 4,5. No caso de uma ferida mais profunda, como uma punção, os ceratocitos participam ativamente do processo de cura6.

Estando em contato com o ambiente externo, lesões físicas da córnea são comuns. Muitos deles são causados por pequenos objetos estranhos7, como areia ou poeira. O reflexo da esfregação dos olhos pode levar a extensas escoriações epiteliais e remodelação corneal8. De acordo com o tamanho e a profundidade da ferida, essas lesões físicas são dolorosas e levam vários dias para curar9. As características ideais de cicatrização da ferida de um modelo facilitam a compreensão dos aspectos celulares e moleculares do fechamento da ferida. Além disso, tais modelos também se mostraram úteis para testar novas moléculas com potencial para acelerar a cura da córnea, como demonstrado anteriormente10,11.

O protocolo descrito aqui visa usar o zebrafish como um modelo relevante para estudar lesões físicas na córnea. Este modelo é altamente conveniente para estudos de triagem farmacológica, pois permite que as moléculas sejam adicionadas diretamente à água do tanque e, portanto, entre em contato com uma córnea curativa. Os detalhes aqui fornecidos ajudarão os cientistas a realizar seus estudos sobre o modelo de zebrafish. A lesão in vivo é realizada com uma rebarba ocular embotada. O impacto nas células epiteliais adjacentes ou à distância dela pode ser analisado removendo especificamente o epitélio córnea central. Nos últimos anos, inúmeros relatos focaram nesse método na córnea de roedores 12,13,14,15,16,17; no entanto, até o momento, apenas um único relatório aplicou este método ao zebrafish18.

Devido à sua simplicidade, a ferida física é útil para delinear o papel das células epiteliais no fechamento da ferida. Outro modelo bem estabelecido de lesão corneia é a queima química, especialmente a queimadura deálcali 19,20,21. No entanto, tal abordagem danifica indiretamente toda a superfície ocular, incluindo a córnea periférica e o estroma córnea19. De fato, queimaduras alcalinas potencialmente induzem úlceras corneais, perfurações, opificação epitelial e neovascularização rápida22, e o resultado incontrolável de queimaduras alcalinas desqualificadas que se aproximam de estudos gerais de cicatrização de feridas. Inúmeros outros métodos também são usados para investigar a cicatrização de feridas córneas de acordo com o foco particular do estudo em questão (por exemplo, debridamento epitelial completo23, a combinação de lesão química e mecânica para ferida de espessura parcial24, ablação a laser excimer para feridas que se estendem ao estroma25). O uso de uma rebarba ocular restringe o ponto focal à resposta epitelial à ferida e fornece uma ferida altamente reprodutível.

Como em cada método de infligência de feridas, o uso de uma rebarba ocular tem vantagens e desvantagens. A principal desvantagem é que a resposta sendo principalmente epitelial, não reflete perfeitamente as abrasões vistas no cenário clínico. No entanto, este método tem inúmeras vantagens, incluindo a facilidade com que pode ser configurado e realizado, sua precisão, sua reprodutibilidade e o fato de não ser invasivo, tornando-o um método bem tolerado pelos animais.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo conselho nacional de experimentos com animais.

1. Preparativos

  1. Prepare a solução de estoque tricaine utilizada para anestesia26 antecipadamente (solução de estoque de 0,4% utilizada neste protocolo). Use luvas e mantenha os materiais em um capô de fumaça sempre que possível.
    1. Para 50 mL de uma solução de 0,4%, pesar 200 mg de pó tricaine em um tubo de 50 mL. Dissolva o pó em aproximadamente 45 mL de água duplamente destilada.
    2. Ajuste o pH da solução de caldo tricaine para 7 com 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 mL). Adicione a solução Tris ao estoque de tricaine em alíquotas, misture bem o estoque após cada alíquota e verifique o pH após cada adição de Tris.
  2. Antes do experimento, prepare uma solução de 0,02% de trabalho de tricaine.
    1. Descongele 2 mL de solução de estoque de 0,4% e adicione a 40 mL de água do sistema (concentração final 0,02%). Coloque a solução em um recipiente pequeno.
  3. Antes do experimento, prepare a água de recuperação contendo analgésico. Use luvas e mantenha os materiais na capa da fumaça sempre que possível.
    1. Para um litro de água de recuperação, pese 2,5 mg de pó de cloridrato de lidocaína e dissolva-o em água fresca do sistema. Verifique o pH e ajuste para 7, se necessário.
  4. Antes do experimento, prepare a solução de fixação (2,5% glutaraldeído em 0,1 M de fosfato de sódio (Na-PO4) solução em pH 7.4). Use luvas e mantenha os materiais em um capô de fumaça.
    1. Para 10 mL da solução de fixação, pipeta 5 mL de 0,2 M Na-PO4 em um tubo. Adicione 0,5 mL de 50% de glutaraldeído, e adicione água duplamente destilada para obter o volume final de 10 mL. Proteja a solução contra a luz e mantenha-a no gelo ou na geladeira antes de usar.
      NOTA: Se as amostras forem coletadas por várias horas após o ferimento, prepare a solução de fixação pouco antes de ser usada.
  5. Prepare o equipamento para ferimentos (Figura 1).
    1. Encha os tanques de recuperação ou recipientes menores com água do sistema.
    2. Tenha a rebarba oftálmica pronta. Verifique se a ponta da rebarba está limpa. Se necessário, remova detritos celulares com um cotonete úmido.
    3. Faça uma incisão ao lado de uma esponja macia, e umedeça a esponja com água do sistema. Coloque a esponja na base/estágio de um microscópio dissecando. Certifique-se de espaço de trabalho suficiente para usar a rebarba e iluminação suficiente dos lados e/ou acima para ver a superfície do olho corretamente.

2. Anestesia

  1. Transfira um peixe do tanque para a solução tricaine de 0,02% com uma rede o mais suavemente possível.
  2. Monitore a anestesia, verificando se há falta de resposta ao estímulo mecânico leve.
    NOTA: Para anestesia consistente, uma exposição de 2 min à tricaine é usada antes da abrasão com peixes AB adultos do tipo selvagem. Com peixes de outra formação genética, uma duração diferente pode ser necessária.

3. Abrasão

  1. Coloque suavemente o peixe anestesiado com uma colher na incisão na esponja, cabeça salientes da superfície da esponja.
  2. Ligue a rebarba e concentre a visão do microscópio na superfície dos olhos.
  3. Aproxime-se cuidadosamente da superfície dos olhos com a ponta da rebarba. Ao tocar na superfície dos olhos, comece a mover a ponta da rebarba na superfície dos olhos com movimento circular. Evite movimentos bruscos, pois pode levar ao olho inclinado na tomada e a ponta da rebarba escorregar.
  4. Quando a abrasão estiver feita, coloque cuidadosamente o peixe na água do sistema contendo o analgésico para recuperação.
  5. Limpe a rebarba logo após o uso com um cotonete úmido.

4. Coleta de amostras

  1. No ponto de tempo desejado, pegue o peixe com uma rede e coloque-o em solução 0,02% tricaine. Mantenha o animal na solução até que o movimento opercular cesse completamente, e o peixe não reaja ao toque.
  2. Coloque o peixe em uma placa de Petri com uma colher, e segure-o com pinças. Decapite o peixe com uma tesoura dissecando. Evite fazer arranhões na superfície dos olhos ao manusear a amostra.
  3. Coloque o tecido em um tubo de amostra contendo 0,1 M Na-PO4.
    1. Enxágüe o tecido substituindo o Na-PO4 de 0,1 M por tampão limpo para que não haja sangue na solução.

5. Processamento de amostras para microscopia eletrônica

  1. Fixar o tecido em 2,5% glutaraldeído/0,1 M Na-PO4 (pH 7.4) por ~24 h a +4 °C. Mantenha a amostra em um suporte de amostra rotativo/tremendo para garantir a fixação adequada.
  2. Remova a solução de fixação e enxágue a amostra várias vezes com 0,1 M Na-PO4.
  3. Disseca a amostra neste momento.
    1. Coloque a amostra em uma gota de 0,1 M Na-PO4 em uma placa de dissecação. Se ambos os olhos do mesmo peixe devem ser imageados, corte a amostra da cabeça em dois com uma tesoura de dissecação fina.
    2. Alternativamente, colete os olhos apenas colocando cuidadosamente as pontas de pinças finas na soquete ocular a partir do lado do olho, tomando cuidado extra para não arranhar a superfície dos olhos. Então, puxe o olho para fora da tomada.
    3. Transfira a amostra dissecada para um tubo contendo 0,1 M Na-PO4. Certifique-se de que não há tecido extra no tubo de amostra, pois ele pode aderir ao topo do olho durante o processamento da amostra.
  4. Armazene a amostra em 0,1 M Na-PO4 (máxima de uma semana) a +4 °C.
  5. Processe as amostras para imagens de microscopia eletrônica.
    1. Pós-fixar as amostras em 2% de tetroxida de ósmio em 0,1 M Na-PO4 tampão por 1 h à temperatura ambiente (RT).
    2. Lave as amostras 3 vezes por 5 minutos cada lavagem em 0,1 M Na-PO4 no RT.
    3. Desidratar as amostras sucessivamente em 30%, 50% e 70% de etanol por 1h em cada solução na RT.
    4. Mergulhe as amostras em 96% de etanol por 2-3 h na RT.
    5. Em seguida, incubar as amostras duas vezes em 100% etanol, primeiro para 1h e depois em 100% fresco de etanol durante a noite a +4 °C.
    6. Sujeito as amostras a 30 ciclos em um secador de ponto crítico automatizado.
  6. Incorporar e platinar as amostras.
    1. Coloque uma guia adesiva em uma montagem. Se a amostra estiver marcada em cima da montagem, deixe um pedaço de papel de cobertura de guia na guia e escreva o ID da amostra no papel.
    2. Coloque a montagem com a guia na base de um microscópio dissecando.
    3. Coloque suavemente a amostra de tecido no suporte com pinças finas, córnea voltada para cima.
    4. Cubra o espécime com platina usando o dispositivo apropriado. Após o revestimento, armazene as amostras à temperatura ambiente até a imagem.

6. Imagem (Figura 2)

  1. Opere os dispositivos conforme aconselhado no manual do usuário e por especialistas em imagem.
  2. Adquira imagens da ampliação desejada e utilize imagens de 2.000-2.500x para análise.
  3. Ajuste o brilho e o contraste para que não haja áreas superexpostas na imagem, e as bordas celulares e microcréditos são vistos da forma mais clara possível.
    NOTA: A posição e o ângulo do tecido afetam as configurações de brilho e contraste. Eles podem precisar ser ajustados de amostra para amostra e entre diferentes regiões do tecido.

7. Medir a forma, o tamanho e o padrão de microridge

  1. Abra a imagem TIFF em Fiji ImageJ 1.5327. Defina a escala usando a barra de escala da imagem: crie uma linha igual em tamanho à barra de escala com a ferramenta Linha . Selecione Analisar | Defina escala e digite a distância conhecida. Abra o gerente do ROI do Analyze | Menu de ferramentas .
  2. Para obter tamanho e arredondamento da célula, selecione Analisar | Definir medidas | Descritores de forma. Use a ferramenta Lupa para ver as células sob ampliação. Selecione células com a ferramenta Polígono e adicione cada seleção ao gerenciador de ROI. Finalmente, meça as células selecionadas e salve a medição.
  3. Análise de microridge (Figura 3 e Figura 4)
    1. Certifique-se de que a imagem está em formato de 8 bits a partir da imagem | Digite o menu.
    2. Selecione uma célula com a ferramenta Polígono e limpe o plano de fundo do Editar | Claro lá fora.
    3. Suavize a imagem uma a três vezes selecionando o Process | Liso e ajuste o brilho e o contraste da imagem | Ajuste | Brilho/Contraste para que as microcréditos se destaquem da forma mais clara possível.
    4. Convolve a imagem do Process | Filtros | Convolve, transforme-se em binário do Processo | | binário Faça binário e esqueleia a imagem em preto e branco selecionando processe | | binário Esqueleto.
    5. Use a função Desmundo o esqueleto na | Menu esqueleto para medir os parâmetros de microarmes e salvar os valores.
      NOTA: No SEM, as imagens individuais podem diferir em brilho e contraste. Assim, as etapas da análise podem precisar de ajustes de imagem para imagem.

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Resultados

Este estudo descreve um método usando uma rebarba oftálmica em experimentos de cura de feridas de córnea de zebrafish. O método é modificado a partir de estudos anteriores em camundongos, onde a rebarba foi demonstrada para remover as camadas de células epiteliais eficientemente13. Os desafios no woundamento corneal de zebrafish incluem o tamanho relativamente pequeno do olho, e no caso de experimentos demorados, a necessidade de manter um fluxo constante de água através das brânquias (como descri...

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Discussão

Lesões físicas da córnea são a causa mais comum de visitas de pacientes oftalmológicos ao hospital. Por isso, é importante estabelecer modelos relevantes para o estudo de diferentes aspectos da fisiopatologia da córnea. Até agora, o rato é o modelo mais usado para o estudo da cicatrização de feridas córneas. No entanto, adicionar colírios nos olhos murinos feridos para validar o impacto de drogas específicas na cicatrização de feridas córneas pode ser difícil. A este respeito, o modelo de zebrafish é particularmente útil...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Pertti Panula pelo acesso à unidade de Zebrafish e Henri Koivula pela orientação e ajuda nos experimentos com zebrafish. Esta pesquisa foi apoiada pela Academia da Finlândia, pela Fundação Jane e Aatos Erkko, pela Fundação Cultural Finlandesa e pelo Programa ATIP-Avenir. A imagem foi realizada na unidade de Microscopia eletrônica e na Unidade de Microscopia Leve, Instituto de Biotecnologia, com apoio da HiLIFE e Biocenter Finlândia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1M Na-PO4 (tampão fosfato de sódio), pH 7,4internamenteA solução é preparada a partir de tampão fosfato de sódio 1M (1M Na2 HPO4 ajustado para pH 7,4 com 1M NaH2 PO4 ).
0,2M Na-PO4 (tampão fosfato de sódio), pH 7,4internamenteA solução é preparada a partir de tampão fosfato de sódio 1M (1M Na2 HPO4 ajustado para pH 7,4 com 1M NaH2 PO4 ).
Pontas de rebarbas de 0,5 mmAlger Equipment CompanyBU-5S
1M Tris, pH 8,8
Agar ScientificG3347N
Rebarba Algerbrush, instrumento completoAlger Equipment CompanyBR2-5
Trocas de algodãoHeinz Herenz Hamburgo1030128
Placade dissecaçãoferramentas de
Fine Science Tools
água bidestiladaEppedorf internos
, 2mlqualquer fornecedor
Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoatoSigmaA5040Cuidado: causa irritação.
Glutaraldeído, solução aquosa a 50%, grau ISigmaG7651Cuidado: tóxico.
Cloridrato de lidocaínaSigmaL5647Cuidado: tóxico.
montaAgar ScientificG301P
Thermo Scientific101VR20
tiras indicadoras de pHMacherey-Nagel92110
Colheres de plásticoqualquer fornecedor
Tubos de plástico, 15 mlGreiner Bio-One188271
Tubos de plástico, 50 mlGreiner Bio-One227261
Microscópio eletrônico de varreduraFEIQuanta 250 FEG
Esponja maciaqualquer fornecedor
Revestidor de pulverização catódicaQuorum TechnologiesGQ150TS
EstereomicroscópioLeica
abas adesivas internas dissecação internas tubos a placa de Petri

Referências

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Reimpressões e permissões

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