Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida

Resumo

Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

Resumo

Como a superfície transparente do olho, a córnea é fundamental para uma visão clara. Devido à sua localização, este tecido é propenso a insultos ambientais. De fato, as lesões oculares mais encontradas clinicamente são aquelas para a córnea. Embora a cura de feridas na córnea tenha sido extensivamente estudada em pequenos mamíferos (ou seja, ratos, ratos e coelhos), estudos de fisiologia da córnea negligenciaram outras espécies, incluindo zebrafish, apesar do zebrafish ser um modelo clássico de pesquisa.

Este relatório descreve um método de realização de uma abrasão córnea em zebrafish. A ferida é realizada in vivo em peixes anestesiados usando uma rebarba ocular. Este método permite uma ferida epitelial reprodutível, deixando o resto do olho intacto. Após a abrasão, o fechamento da ferida é monitorado ao longo de 3 h, após o qual a ferida é reeptelializada. Usando microscopia eletrônica de varredura, seguida de processamento de imagem, a forma das células epiteliais e as saliências apical podem ser investigadas para estudar as várias etapas durante o fechamento da ferida epitelial da córnea.

As características do modelo de zebrafish permitem o estudo da fisiologia do tecido epitelial e do comportamento coletivo das células epiteliais quando o tecido é desafiado. Além disso, o uso de um modelo privado da influência do filme lacrimal pode produzir novas respostas sobre a resposta córnea ao estresse. Por fim, este modelo também permite a delineação dos eventos celulares e moleculares envolvidos em qualquer tecido epitelial submetido a uma ferida física. Este método pode ser aplicado à avaliação da eficácia da droga em testes pré-clínicos.

Introdução

Como a maioria da epitélio está em contato com o ambiente externo, elas são propensas a lesões físicas, tornando-as adequadas para o estudo dos processos de cicatrização de feridas. Entre os tecidos bem estudados, a córnea é um modelo extremamente útil na investigação dos aspectos celulares e moleculares da cicatrização de feridas. Como uma superfície externa transparente, fornece proteção física ao olho e é o primeiro elemento a focar a luz na retina. Embora a estrutura e a composição celular da retina diferem entre as espécies¹, esses elementos da córnea são geralmente semelhantes em todos os olhos do tipo câmera, independentemente das espéci....

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo conselho nacional de experimentos com animais.

1. Preparativos

1. Prepare a solução de estoque tricaine utilizada para anestesia²⁶ antecipadamente (solução de estoque de 0,4% utilizada neste protocolo). Use luvas e mantenha os materiais em um capô de fumaça sempre que possível.
   1. Para 50 mL de uma solução de 0,4%, pesar 200 mg de pó tricaine em um tubo de 50 mL. Dissolva o pó em aproximadamente 45 mL de água duplamente destilada.
   2. Ajuste o pH da solução de caldo tricaine para 7 com 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 mL). Adicione a solução Tris a....

Resultados

Este estudo descreve um método usando uma rebarba oftálmica em experimentos de cura de feridas de córnea de zebrafish. O método é modificado a partir de estudos anteriores em camundongos, onde a rebarba foi demonstrada para remover as camadas de células epiteliais eficientemente¹³. Os desafios no woundamento corneal de zebrafish incluem o tamanho relativamente pequeno do olho, e no caso de experimentos demorados, a necessidade de manter um fluxo constante de água através das brânquias (como descri.......

Discussão

Lesões físicas da córnea são a causa mais comum de visitas de pacientes oftalmológicos ao hospital. Por isso, é importante estabelecer modelos relevantes para o estudo de diferentes aspectos da fisiopatologia da córnea. Até agora, o rato é o modelo mais usado para o estudo da cicatrização de feridas córneas. No entanto, adicionar colírios nos olhos murinos feridos para validar o impacto de drogas específicas na cicatrização de feridas córneas pode ser difícil. A este respeito, o modelo de zebrafish é particularmente útil.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,1M Na-PO4 (tampão fosfato de sódio), pH 7,4	internamente		A solução é preparada a partir de tampão fosfato de sódio 1M (1M Na2 HPO4 ajustado para pH 7,4 com 1M NaH2 PO4 ).
0,2M Na-PO4 (tampão fosfato de sódio), pH 7,4	internamente		A solução é preparada a partir de tampão fosfato de sódio 1M (1M Na2 HPO4 ajustado para pH 7,4 com 1M NaH2 PO4 ).
Pontas de rebarbas de 0,5 mm	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8,8
	Agar Scientific	G3347N
Rebarba Algerbrush, instrumento completo	Alger Equipment Company	BR2-5
Trocas de algodão	Heinz Herenz Hamburgo	1030128
Placa	de dissecaçãoferramentas de
	Fine Science Tools
água bidestilada	Eppedorf internos
, 2ml	qualquer fornecedor
Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato	Sigma	A5040	Cuidado: causa irritação.
Glutaraldeído, solução aquosa a 50%, grau I	Sigma	G7651	Cuidado: tóxico.
Cloridrato de lidocaína	Sigma	L5647	Cuidado: tóxico.
monta	Agar Scientific	G301P
	Thermo Scientific	101VR20
tiras indicadoras de pH	Macherey-Nagel	92110
Colheres de plástico	qualquer fornecedor
Tubos de plástico, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Tubos de plástico, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Microscópio eletrônico de varredura	FEI	Quanta 250 FEG
Esponja macia	qualquer fornecedor
Revestidor de pulverização catódica	Quorum Technologies	GQ150TS
Estereomicroscópio	Leica

abas adesivas internas dissecação internas tubos a placa de Petri