Artigo de método

Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

DOI:

10.3791/63614

⸱

13 de maio de 2022

 ,  , 
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas ligadas à membrana lipídica de tamanho nanométrico que são liberadas de todas as células, estão presentes em todos os biofluidos e contêm proteínas, ácidos nucleicos e lipídios que refletem a célula-mãe da qual são derivadas. A separação adequada de EVs de outros componentes em uma amostra permite a caracterização de sua carga associada e fornece informações sobre seu potencial como comunicadores intercelulares e biomarcadores não invasivos para inúmeras doenças. No presente estudo, os EVs derivados de oligodendrócitos foram isolados de meios de cultura celular usando uma combinação de técnicas de ponta, incluindo ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para separar os EVs de outras proteínas extracelulares e complexos proteicos. Usando colunas SEC comercialmente disponíveis, os EVs foram separados de proteínas extracelulares liberadas de células de oligodendroglioma humano sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE). Os marcadores canônicos de EV CD9, CD63 e CD81 foram observados nas frações 1-4, mas não nas frações 5-8. GM130, uma proteína do aparelho de Golgi, e a calexina, uma proteína integral do RE, foram utilizadas como marcadores negativos de EV, e não foram observadas em nenhuma fração. Além disso, ao agrupar e concentrar as frações 1-4 como fração EV e as frações 5-8 como fração proteica, observou-se expressão de CD63, CD81 e CD9 na fração EV. A expressão de GM130 ou calexina não foi observada em nenhum dos tipos de fração. As frações agrupadas das condições de estresse de controle e ER foram visualizadas com microscopia eletrônica de transmissão e vesículas foram observadas nas frações EV, mas não nas frações proteicas. Partículas no EV e frações proteicas de ambas as condições também foram quantificadas com análise de rastreamento de nanopartículas. Juntos, esses dados demonstram que a SEC é um método eficaz para separar EVs de meios de cultura de células condicionadas.

Introdução

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A explosão de interesse no estudo de vesículas extracelulares (EVs) tem sido acompanhada por grandes avanços nas tecnologias e técnicas usadas para separar e estudar essas partículas heterogêneas de tamanho nano. No tempo desde sua descoberta, há quase quatrodécadas1,2, descobriu-se que essas pequenas estruturas membranosas contêm lipídios, ácidos nucleicos e proteínas bioativos e desempenham papéis importantes na comunicação intercelular 3,4. Os EVs são liberados de todos os tipos de células e, portanto, estão presentes em todos os fluidos biológicos, incluindo plasma sanguíneo e soro, saliva e urina. Os EVs dentro desses fluidos são uma grande promessa de servir como biomarcadores não invasivos para várias doenças, incluindo doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas, cânceres e distúrbios autoimunes 5,6,7. Além disso, estudos mecanicistas in vitro podem ser realizados por meio de técnicas de cultura celular, separando EVs liberados no meio de cultura 3,8,9.

Para entender o papel dos EVs na fisiopatologia da doença, a separação adequada do fluido em que eles são encontrados é primordial. O padrão-ouro para a separação de EV tem sido a ultracentrifugação diferencial (dUC)10, no entanto, técnicas mais sofisticadas surgiram para alcançar uma melhor separação de EVs de outros componentes extracelulares. Algumas dessas técnicas incluem gradientes de densidade, fração de fluxo assimétrico de campo-fluxo (A4F), citometria de fluxo, imunocaptura, precipitação de polietilenoglicol e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)11,12,13. Cada técnica tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens; no entanto, a SEC, em particular, demonstrou separar os EVs de fluidos biológicos e sobrenadantes de cultura celular de forma bastante eficaz 8,14,15. A SEC também tem o bônus adicional de ser relativamente direta e fácil de usar.

SEC é um método que separa componentes de um fluido com base no tamanho. Com esta técnica, uma coluna de resina (feita internamente ou comprada comercialmente) é usada para fracionar uma amostra. Pequenas partículas na amostra ficam presas entre as contas dentro da resina, enquanto partículas maiores são capazes de passar pela resina mais livremente e, assim, eluir no início do processo. Como os EVs são maiores em tamanho do que muitas proteínas extracelulares e agregados proteicos, os EVs passam pela coluna mais rapidamente e eluem em frações mais precoces do que as proteínas extracelulares14.

Neste artigo de métodos, o uso de SEC para a separação de EVs de meios de cultura celular (CCM) de oligodendrócitos humanos sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE) é descrito. Usando este protocolo, mostra-se que os EVs separados com esta técnica são encontrados dentro de frações específicas que podem ser agrupadas e concentradas para caracterização a jusante, e que os EVs separados são derivados de células e não de uma fonte exógena, como o soro fetal bovino (FBS) usado para complementar o CCM. A presença dos marcadores canônicos de EV, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nas frações EV, e sua ausência nas frações proteicas é demonstrada com western blotting. Usando microscopia eletrônica de transmissão (MET), os EVs são visualizados e exibem a morfologia esperada e são observados apenas na fração EV. As partículas também são contadas nas frações EV e proteína das condições de tensão de controle e ER, e um grande número de partículas dentro da faixa de tamanho esperada de 50-200 nm de diâmetro é observado nas amostras de EV. Juntos, esses dados apoiam a noção de que a SEC é um método eficiente e eficaz para separar os VEs dos meios de cultura celular.

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Protocolo

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1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: Fazer reagentes de cultura celular no exaustor de cultura celular para manter a esterilidade.

  1. Preparação de reagentes de cultura celular
    1. Preparar DMEM de glicose alta normal adicionando 50 mL de FBS e 5 mL de penicilina-estreptococo (Pen-Strep) em 500 mL de DMEM de alta glicose e armazenar a 4 °C. Use este meio para cultivar e expandir células.
    2. Preparar DMEM de glicose elevada depletada por exossomo adicionando 50 mL de FBS empobrecido por exossomo e 5 mL de Pen-Strep em 500 mL de DMEM de glicose alta e armazenar a 4 °C. Use este meio para tratamentos celulares antes do isolamento do EV.
    3. Prepare tunicamicina adicionando 10 mg de tunicamicina a 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Fazer alíquotas de 50 μL em tubos de 0,2 mL e armazenar a -20 °C.
  2. Preparação de reagentes de separação EV
    1. Preparar 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) adicionando 9,89 g de pó PBS a 1 L de água desionizada (DI) em um cilindro graduado de 1 L. Agitar a solução numa placa de agitação até que o PBS se dissolva.
    2. Use a autoclave para esterilizar o vidro antes de adicionar PBS. Coloque os utensílios de vidro em uma lixeira, feche a porta e esterilize por 30 minutos a 121 °C.
    3. Dentro de um gabinete de fluxo laminar, conecte um vácuo ao filtro de 0,22 μm e coloque o filtro em cima da garrafa autoclavada. Despeje lentamente o PBS no filtro e colete o PBS filtrado no frasco autoclavado.
    4. Preparar hidróxido de sódio 0,5 M adicionando 9,99 g de hidróxido de sódio a 500 mL de 1x PBS em um cilindro graduado de 500 mL. Agitar a solução numa placa de agitação até que o hidróxido de sódio se dissolva no PBS e, em seguida, filtrar utilizando um filtro de 0,22 μm para um frasco autoclavado de 500 ml.
    5. Preparar azida de sódio a 0,05% adicionando 0,25 g de azida de sódio a 500 mL de 1x PBS em um cilindro graduado de 500 mL. Agitar a solução numa placa de agitação até que a azida de sódio se dissolva no PBS e, em seguida, filtrar utilizando um filtro de 0,22 μm para um frasco autoclavado de 500 ml.
  3. Preparação de reagentes de isolamento, quantificação e identificação de proteínas
    1. Prepare 100 mL de tampão de lise RIPA combinando 1 mL de 1 M Tris (pH 7,4), 1 mL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS), 1 g de desoxicolato, 1 mL de NP-40 e 0,89 g de cloreto de sódio (NaCl). Levar o volume para 100 ml com H2O destilado e conservar a 4 °C. Para fazer RIPA mais fosfatase e solução inibidora de protease, adicionar 10 μL de fosfatase e inibidor de protease para cada 1 mL de tampão RIPA em um tubo de 15 mL e armazenar a solução a 4 °C.
    2. Imediatamente antes do uso, prepare o reagente de trabalho do ensaio de BCA adicionando 10 mL de reagente A e 200 μL de reagente B fornecido pelo kit de ensaio de BCA em um tubo de 15 mL. Imediatamente antes do uso, prepare o reagente de trabalho do ensaio microBCA adicionando 25 partes do reagente A, 24 partes do reagente B e 1 parte do reagente C em um tubo de 15 mL.
    3. Prepare 10x tampão de eletroforese em gel adicionando 30,3 g de base Tris, 144 g de glicina e 10 g de SDS em 1 L de água DI. Armazene o buffer em funcionamento a 4 °C. Prepare 1x tampão de transferência adicionando 3,03 g de base Tris, 14,4 g de glicina e 200 mL de metanol e ajuste o volume para 1 L com água DI. Conservar a memória tampão de transferência a 4 °C.
    4. Prepare a solução salina tamponada Tris com Tween-20 (TBS-Tween) adicionando 2,4 g de base Tris, 8 g de NaCl e 1 mL de Tween-20 em 1 L de água DI. Conservar a TBS-Tween a 4 °C.
    5. Preparar a solução bloqueadora a 5% adicionando 5 g de leite em pó desnatado a 100 ml de TBS-Tween. Conservar a memória tampão de bloqueio a 4 °C.
    6. Imediatamente antes do uso, preparar o substrato quimioluminescente adicionando 4 mL de solução de peróxido e 4 mL de solução de luminol/potenciador em um tubo de 15 mL e inverter suavemente para misturar.

2. Cultivo e tratamento de células

  1. Semeia dois frascos de cultura de células T175 com 2,3 x 106 células de oligodendroglioma humano (HOG) cada. Trazer o volume final de DMEM normal de glicose alta para 25 mL e incubar a 37 °C com 5% de CO2 em uma incubadora de cultura celular por 48 h.
  2. No final das 48 h, o exossomo quente esgotou a alta glicose DMEM em um banho de água de 37 °C. Para o tratamento, adicione 25 μL de 10 mg/mL de tunicamicina a 25 mL de meio empobrecido de exossomos, concentração final de 10 μg/mL de tunicamicina para induzir estresse de RE. Para o controle, adicionar 25 μL de DMSO a 25 mL de meio empobrecido de exossomos.
  3. Remova e elimine o DMEM normal de glicose elevada das células e lave suavemente as células e o frasco com 10 ml de PBS 1x. Aspirar e descartar PBS.
  4. Adicionar 25 ml de meio de controlo ao balão rotulado como controlo e 25 ml de 10 μg/ml de tunicamicina em meio ao tratamento marcado com balão. Devolver frascos à incubadora de cultura celular por 24 h.

3. Recolha e concentração de MCC condicionado (Figura 1)

  1. Colocar a PBS num banho de água a 37 °C. Observe frascos sob um microscópio composto com lente objetiva de 10x e 100x. Tome nota das eventuais diferenças entre os frascos. Efectuar os seguintes passos, tanto para os balões de controlo como para os balões tratados.
  2. Retire o meio do balão e coloque num tubo de 50 ml. Centrifugar o tubo a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL.
  3. Centrifugar o tubo a 2.000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL e coloque no gelo.
  4. Obter quatro unidades de ultrafiltração de corte de 3 kDa de 15 mL e adicionar 5 mL de PBS a cada tubo. Prima o filtro centrifugando as unidades de ultrafiltração a 4.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: Unidades de ultrafiltração de corte de peso molecular de 3 kDa foram utilizadas no protocolo atual para reter todas as proteínas extracelulares liberadas das células. Unidades de ultrafiltração de corte de peso molecular maiores (por exemplo, 30 kDa) também funcionariam com esse protocolo, porém proteínas extracelulares menores que 30 kDa seriam filtradas e removidas das amostras20,21.
  5. Remova o PBS das unidades de ultrafiltração. Divida o sobrenadante de cada condição (controle e tunicamicina tratada) em duas unidades de ultrafiltração cada, aproximadamente 12,5 mL de meio em cada.
  6. Centrifugar os tubos a 4.000 x g durante 1 h 45 min a 4 °C, ou até que o meio concentrado (referido como o retentado) em cada unidade de ultrafiltração esteja concentrado a 250 μL ou menos.
  7. Transfira o retentado de ambas as unidades de ultrafiltração de controle para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado. Transfira o retentado de ambas as unidades de ultrafiltração tratadas para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado.
  8. Medir o volume total do retentado em cada tubo de microcentrífuga de 500 μL. Se a amostra for inferior a 500 μL, adicionar 0,22 μm filtrado 1x PBS até que o volume final seja de 500 μL. Coloque os tubos num congelador a -80 °C.

4. Coleta de células

  1. Coloque tripsina, PBS e DMEM empobrecido de exossomas em banho-maria de 37 °C. Adicionar 7 mL de tripsina aos frascos de controle e tratados e colocar na incubadora por 5 min.
  2. Veja sob o microscópio para ver se as células são levantadas. Se as células não estiverem levantadas, bata firmemente o balão contra a palma da mão para desalojar as células.
  3. Lavar o balão com 7 ml de DMEM empobrecido de exossomas. Recolher a suspensão celular do balão e colocar em tubos de 15 ml.
  4. Centrifugar os tubos durante 10 min a 500 x g a 4 °C. Remova o sobrenadante e adicione 5 mL de 1x PBS ao pellet celular. Misture suavemente a pipeta para quebrar o pellet.
  5. Centrifugar os tubos a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e adicione 200 μL de RIPA mais fosfatase e solução inibidora de protease ao pellet celular, pipeta para misturar.
  6. Transfira as células da solução de RIPA para tubos de 1,5 ml. Deixe os tubos assentarem no gelo por 5 min. Centrifugar os tubos a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  7. Transfira o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL. Rotule os tubos com a condição e a data do tratamento. Coloque os tubos num congelador a -80 °C.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

5. Separação do VE por cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2)

NOTA: Execute as seguintes etapas duas vezes, uma vez para retentado de controle e outra para retentado tratado com tunicamicina.
NOTA: O PBS utilizado nesta seção é 0,22 μm filtrado 1x PBS.

  1. Ative o coletor automático de frações (AFC) e ajuste as configurações para coletar oito frações, 0,5 mL por fração e buffer (void) volume por padrão.
    NOTA: As condições de funcionamento do AFC são as seguintes: volume da coluna/leito = 10 mL; volume miccional = 2,70 mL; volume de descarga = 15 mL; tamanho ideal da fração = 500 μL; tampão necessário por execução = 65 mL; vazão a 20 °C = 1,0 mL/min; reutilização da coluna = cinco usos.
  2. Remova a coluna (ver Tabela de Materiais) de 4 °C e deixe a coluna aquecer até à temperatura ambiente antes de começar (normalmente ~30 min).
  3. Retirar as amostras de retentado do congelador a -80 °C e colocar no gelo para descongelar. Enquanto esperava, coloque oito tubos de 1,5 mL rotulados no carrossel AFC com tampas voltadas para dentro.
  4. Insira a coluna no AFC com o código de barras voltado para o leitor. Inicie a coleta seguindo as instruções na tela para verificar se há tubos no carrossel e se o coletor de resíduos está funcionando corretamente.
  5. Comece a lavar a coluna adicionando 15 mL de 1x PBS à coluna depois que o buffer de armazenamento for completamente absorvido pela parte superior da matriz da coluna. Não adicione PBS muito cedo, pois isso diluirá o buffer de armazenamento e impedirá a lavagem adequada.
  6. Pouco antes de todos os 15 mL de PBS serem absorvidos pela matriz, clique em OK para interromper a lavagem e remova qualquer PBS residual do topo da matriz da coluna com uma micropipeta. Não toque na matriz.
  7. Adicionar 500 μL de amostra ao centro da coluna. Clique em OK para iniciar a execução. Observe a amostra absorver na matriz e adicione rapidamente 8 mL de PBS à coluna imediatamente após a amostra ser totalmente absorvida.
  8. O AFC dissipará automaticamente o volume vazio para o centro do carrossel e, em seguida, coletará todas as oito frações de 500 μL cada. Na conclusão da corrida, remova as frações do carrossel e coloque no gelo. As frações 1-4 contêm EVs, enquanto as frações 5-8 contêm proteínas extracelulares. Remova o volume vazio do centro do carrossel.
  9. Adicionar 10 mL de PBS à coluna após a coleta das oito frações para lavar qualquer amostra residual da coluna. Depois que a amostra de retentado tiver sido totalmente lavada através da coluna, adicione 15 mL de 1x PBS à coluna.
  10. À medida que o PBS final está sendo absorvido pela matriz, adicione 500 μL de hidróxido de sódio 0,5 M ao centro da matriz da coluna. À medida que o hidróxido de sódio é absorvido, adicione 30 mL de 1x PBS à coluna e deixe-o lavar.
  11. Se estiver executando outra amostra, adicione oito tubos de microcentrífuga de 1,5 mL rotulados ao carrossel e repita as etapas 5,7-5,10.
  12. Depois de concluir com todos os exemplos, conclua as etapas a seguir para preservar a coluna para uso posterior. Após a lavagem de 30 mL de PBS através da coluna, conforme descrito na etapa 5.10, adicione 15 mL de azida de sódio a 0,05% à coluna.
  13. Deixe aproximadamente 5 mL de azida de sódio no topo da matriz da coluna. Remova a coluna do AFC e anexe as tampas superior e inferior. Coloque a coluna de volta a 4 °C para armazenamento (a coluna pode ser usada até cinco vezes).

6. Ultrafiltração de EV e frações proteicas

  1. Obter duas unidades de ultrafiltração de corte de 2 mL e 3 kDa por amostra. Use uma unidade para concentrar as frações EV (frações 1-4) e a outra para concentrar as frações proteicas (frações 5-8). Cada unidade é composta por três partes: cone, filtro e cilindro de fluxo; rotule cada peça corretamente.
  2. Construa a unidade de ultrafiltração e adicione 1 mL de 0,22 μm filtrado 1x PBS à porção do filtro e tampe com a peça do cone. Centrifugar a unidade de ultrafiltração, do lado cônico a 3.500 x g por 10 min a 4 °C.
  3. Remova o PBS filtrado do cilindro de fluxo. Vire a unidade de ultrafiltração de cabeça para baixo (cone-side-down) e centrifugar durante 2 min a 1.000 x g a 4 °C. Remova qualquer PBS restante do cone.
  4. Adicione as frações apropriadas (todo o volume de 500 μL) a cada unidade de ultrafiltração (o volume total será de 2 mL). Colunas centrífugas do lado cônico por 1 h 45 min a 3.500 x g a 4 °C, ou até que o nível de retentado esteja a 100 μL.
  5. Remova o cilindro de fluxo e descarte o fluxo. Vire a unidade de ultrafiltração de cabeça para baixo (cone-side-down) e centrifugar durante 2 min a 1.000 x g a 4 °C.
  6. Transfira o retentado no cone para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado e traga cada volume de amostra para 150 μL com 0,22 μm filtrado 1x PBS. Coloque os tubos no congelador a -80 °C.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

7. Controles de mídia

  1. Obter dois frascos de cultura celular T175. Rotular um balão de controlo e o outro tratamento. DMEM de alta glicose empobrecida por exossomo quente em banho-maria de 37 °C.
  2. Adicionar 25 μL de solução-mãe de tunicamicina (10 mg/ml) a 25 ml de meio e colocar no balão o tratamento rotulado. Adicionar 25 μL de DMSO a 25 ml de meio e colocar no balão o controlo rotulado. Manter os frascos numa incubadora de cultura celular durante 24 h.
  3. Colete a mídia e o processo para separar os VEs, conforme descrito nas etapas 3.2-3.8. Posteriormente, execute todas as etapas descritas nas seções 5 e 6.

8. Western blotting

  1. Quantificação de proteínas a partir de lisados celulares e frações proteicas com ensaio de BCA
    NOTA: A quantificação de proteínas de amostras tratadas com tunicamicina e controle é realizada com as seguintes etapas.
    1. Descongelar células lisadas e frações proteicas no gelo. Fazer três tubos de diluição para cada amostra; 1:2, 1:10 e 1:100.
    2. Carga em triplicado sobre uma placa de ensaio de fundo transparente de 96 poços, 25 μL de padrões proteicos de albumina sérica bovina (BSA) e 25 μL de cada diluição da amostra. Adicionar um reagente de trabalho de 200 μL a cada alvéolo que contenha uma amostra ou padrão, utilizando uma pipeta multicanal.
    3. Incubar a placa a 37 °C durante 30 min e, em seguida, ler a placa com um leitor de placas a uma absorvância de 562 nm. Calcular a concentração de proteína em cada amostra e determinar o volume de amostra necessário para obter 20 μg de proteína para lisados celulares e 15 μg de proteína para frações proteicas.
  2. Quantificação de proteínas a partir de frações EV com ensaio de microBCA
    1. Descongele amostras de EV no gelo. Efectuar duas diluições para cada amostra: 1:50 e 1:100.
    2. Carga em triplicado numa placa de ensaio de fundo transparente de 96 poços, 100 μL de padrões proteicos BSA e 100 μL de cada diluição da amostra. Adicionar 100 μL de reagente de trabalho microBCA a cada poço que contenha padrão ou amostra, usando uma pipeta multicanal.
    3. Incubar a placa a 37 °C durante 2 h e, em seguida, ler a placa com um leitor de placas a uma absorvância de 562 nm. Calcular a concentração de proteína em cada amostra e determinar o volume de amostra necessário para obter 15 μg de proteína para frações EV.
  3. Mancha ocidental
    NOTA: O protocolo de Western blotting foi realizado de forma semelhante à descrita em22 e modificado conforme descrito abaixo.
    1. Faça géis de poliacrilamida a 10% com um kit de fabricação de gel, usando as instruções do fabricante.
    2. Para eletroforese em gel, prepare amostras de lisado celular combinando em um tubo de 1,5 mL, o volume de lisado celular necessário para 20 μg de proteína, 5 μL de 4x tampão Laemmli e o volume de tampão RIPA necessário para levar o volume total a 20 μL.
    3. Prepare amostras de EV e frações proteicas combinando em um tubo de 1,5 mL o volume de amostra necessário para 15 μg de proteína, 5 μL de 4x tampão Laemmli e tampão RIPA para um volume de 20 μL.
    4. Preparar amostras de controle de meios combinando em um tubo de 1,5 mL 15 μL de amostra e 5 μL de 4x tampão Laemmli.
      NOTA: Dependendo dos anticorpos a serem usados, o tampão Laemmli pode ou não precisar conter um agente redutor, como o ditiotreitol 50 mM (TDT).
    5. Ferva todas as amostras a 95 °C durante 5 min, transfira as amostras para o gelo para arrefecer e centrifugar brevemente durante 30 s a 10.000 x g, depois devolver as amostras ao gelo.
    6. Adicione géis ao tanque de eletroforese e adicione 1x tampão de eletroforese em gel. Carregar 15 μL de escada de proteína e 20 μL de amostra. Execute o gel a 200 V por 30-50 min, ou até que as amostras tenham atingido o fundo do gel, pouco antes de escorrer.
    7. Transferir a proteína para uma membrana PVDF com tampão de transferência 1x a 4 °C durante 30 min a 100 V ou até que a transferência esteja completa. A Figura 1 Suplementar, a Figura 2 Suplementar e a Figura 3 Suplementar mostram imagens sem manchas de cada mancha após a conclusão da transferência.
    8. Bloquear a membrana em 5% de leite/TBS-Tween durante 1 h à temperatura ambiente num agitador. Incubar a membrana em solução de anticorpos primários durante a noite num agitador a 4 °C. Ver Tabela 1 para informações sobre a diluição de anticorpos.
    9. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave a membrana 3x com TBS-Tween por 5 minutos cada um à temperatura ambiente em um agitador.
    10. Preparar anticorpos secundários apropriados em 5% de leite/TBS-Tween. Ver quadro 1 para informações sobre a diluição. Adicione o anticorpo secundário à membrana e incube em um agitador à temperatura ambiente por 1 h, depois lave 3x com TBS-Tween por 5 min cada um à temperatura ambiente em um agitador.
    11. Adicionar substrato quimioluminescente à membrana e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador. Mancha de imagem usando análise colorimétrica e quimioluminescente. A Figura 4 Suplementar, a Figura 5 Suplementar e a Figura 6 Suplementar mostram imagens não cortadas de cada mancha.

9. Imagem TEM

  1. Descarga de incandescência23 400 malha de carbono/formvar revestidas de grelhas para remover hidrocarbonetos e tornar as redes hidrofílicas.
  2. Adicionar 5 μL de EV ou amostra de fração de proteína às grades. Incubar grades à temperatura ambiente por 3-5 min.
  3. Remova o excesso de solução por mecha com papel de filtro. Lave as grades com 5 μL de água nanopura e retire o excesso por mecha.
  4. Aplicar 5 μL de acetato aquoso de uranilo a 1% e imediatamente desligar. Deixe as grades secarem. Grades de imagem a 120 kV em um microscópio eletrônico de transmissão e capturam imagens com uma câmera de dispositivo de casal carregado.

10. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)

  1. Obter amostras de EV e frações proteicas a partir de -80 °C e descongelar no gelo.
  2. Ligue o computador e o instrumento NTA. Abra o software NTA e ele começará a inicializar automaticamente.
  3. Selecione a bomba apropriada que contém água sem partículas e clique em Enxaguar o instrumento para enxaguar a célula. Durante o enxágue, injete 10-20 mL de água livre de partículas na porta de injeção na frente do instrumento usando uma seringa e evite bolhas de ar.
  4. A tela de verificação de qualidade da célula aparecerá; clique em OK e a verificação de qualidade da célula começará. Depois que a verificação for aprovada com sucesso, a tela pop-up de alinhamento automático aparecerá informando: Preencha a célula com suspensão de alinhamento de 100 nm (diluição 1:250.000).
    1. Preparar a diluição 1 da suspensão de alinhamento adicionando 10 ml de água isenta de partículas e 10 μL de grânulos de poliestireno de 100 nm a um tubo (diluição de 1:1.000). Inverta suavemente para misturar. A diluição 1 tem um prazo de validade de 2-3 dias a 4 °C.
    2. Criar diluição 2 de suspensão de alinhamento adicionando 20 mL de água livre de partículas e 80 μL de diluição 1 (1:1.000) em um tubo para criar a diluição de 1:250.000. Inverta suavemente o tubo para misturar. A diluição 2 tem uma vida útil de 30-60 min à temperatura ambiente.
  5. Encha a célula com 2 mL de diluição 2 (1:250.000). Clique em OK e o programa concluirá o autoalinhamento (foco) e a otimização de foco. A guia de análise será aberta criando um perfil que fornece resultados da limpeza e simetria da célula de medição em uma parábola. Uma tela pop-up afirmando: View Video Microscope agora está pronto para experimentos, aparecerá; clique em OK e o programa retornará à guia de verificação da célula.
  6. Lave as contas de poliestireno da célula injetando água sem partículas na porta de injeção para lavar a célula. Continue lavando até que o número de partículas detectadas esteja entre 0-10 (geralmente entre 5-10 mL). Adicione 1 mL de PBS filtrado de 0,22 μm para preparar a célula para a primeira amostra.
  7. Diluir a primeira amostra com PBS filtrado de 0,22 μm (começar com diluição de 1:1000) e introduzir o factor de diluição no programa. Insira 1 mL de amostra na célula e aguarde 5 minutos para que o movimento das partículas diminua, pois elas inicialmente se moverão muito rapidamente pela tela. Defina a sensibilidade e o obturador em 75,0 e 100, respectivamente.
  8. O número de partículas detectadas para diluição ideal da amostra é de 50-200 partículas. Se forem comunicadas menos de 50 ou mais de 200 partículas, ajustar a diluição da amostra. Se uma nova diluição for necessária, lave a célula com água livre de partículas até que haja 0-10 partículas detectadas. Repetir a adição de amostra diluída e a lavagem até se encontrar a diluição ideal.
  9. Verifique todas as 11 posições da câmera para visualizar que o movimento das partículas diminuiu e garantir que o número de partículas detectadas seja semelhante entre todas as posições da câmera. Se o número de partículas diferir muito entre as posições da câmera, adicione mais amostras.
  10. Clique na guia Medição e execute Aquisição de vídeo. Na guia Aquisição de vídeo, insira o nome personalizado da amostra e identifique um local seguro. Marque as caixas de salvamento automático.txt e .pdf salvamento automático para salvar dados.
  11. Defina a temperatura para 25 °C, clique em 488 nm para definir o laser e clique em 11 para as posições da câmera. Clique em OK para executar a coleta de dados. O programa começará a analisar o número de partículas e o tamanho em todas as 11 posições. Na guia de análise, um gráfico de barras aparecerá com diâmetro/nm no eixo x e partículas/mL no eixo y.
  12. Depois que os dados forem coletados, uma tela pop-up intitulada Visão geral das posições aparecerá fornecendo dados para cada uma das 11 posições. Se houver mais de duas posições removidas da análise, repita o procedimento com mais amostra. Caso contrário, clique no botão Continuar . Um arquivo PDF e txt será aberto contendo os resultados. Salve os arquivos em um local seguro.
  13. Para executar outro exemplo, vá para a guia Verificação de Célula e repita as etapas 10.6 a 10.12. Se feito, lave a célula com água livre de partículas até que o número de partículas detectadas seja de 0-10 (cerca de 5-10 mL). Enxaguar a célula com 1 mL de PBS filtrado de 0,22 μm, feche o programa e desligue o computador.

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Resultados

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Western blotting revela separação adequada de EVs de CCM
Para avaliar a efetividade da SEC na separação de EVs dos meios de cultura celular, foi realizado um western blot utilizando cada fração individual das amostras controle para sondar a expressão dos três marcadores canônicos de EV, CD9, CD63 e CD81, bem como GM130 e calexina18, que foram utilizados como controles negativos (Figura 3). A expressão da albumina18 também fo...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEC é um método fácil de usar para separar adequadamente EVs de CCM condicionado. A fim de isolar especificamente os EVs derivados de células, deve-se levar em conta uma consideração cuidadosa do tipo de CCM e seus suplementos. Muitos meios de cultura celular precisam ser suplementados com FBS, que contém EVs derivados do animal em que o soro foi colhido. Esses EVs séricos podem saturar e mascarar qualquer sinal produzido por EVs derivados de células em cultura26. Portanto, ao realizar experimento...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer à Penn State Behrend e à Hamot Health Foundation pelo financiamento, bem como à Penn State Microscopy Facility em University Park, PA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoetanolVWR97064-588
4X Tampão de Amostra LaemmliUnidade
Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC900308kDa de corte
Filtro Centrífugo Amicon Ultra-2 com membrana Ultracel-3Sigma-AldrichUFC2003243 kDa de corte de
amônio PersulfatoSigma-AldrichA3678-100G
Anti coelho IgG, HRP ligado AnticorpoCell Signaling Technology7074V1:1000 Diluição
Anti-Calnexinaanticorpo Abcam  ab225951:500 Anticorpo
monoclonal de camundongo anti-CD9BioLegend3121021:500
anticorpo anti-GM130 de diluição [EP892Y] - cis-Golgi MarcadorAbcamab526491:500 Diluição
Anti-camundongo IgG, HRP-linked AnticorpoTecnologia de sinalização celular7076V1:1000 Diluição
Coletor automático de fraçõesIzon Science
Kit de ensaio BCABio-Rad
CCD câmeraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti BD humano5560191:1000 Diluição
CD81 AnticorpoSanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Diluição
Cellstar Filter Cap Frascos de cultura de célulasGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
desoxicolatoSigma-AldrichD6750-10G
ditiotreitolSigma3483-12-3
DMEM/Alta glicose com L-glutamina; sem sódioCytivaSH300022.
Soro bovino fetal FS Soro bovino premiumVWR97068-085
Soro bovino fetal, esgotado com exossomoThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Leite em pó desnatado de grande valorAmazonB076NRD2TZ
HOG Linha celular de oligodendroglioma humanoSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Colunas de Exclusão de Tamanho 5pkIzon Science
Metanol >99,8% ACSVWRBDH1135-4LP
Placas de vidro Mini-PROTEANBioRad1653310com espaçadores de 0,75 mm
Mini-PROTEAN Placas curtasBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicilina-Estreptomicina, SoluçãoSigma-AldrichP4458-100mL
Solução salina tamponada com fosfato PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Kits de ensaio de proteína e reagentesThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Membranas de transferência ThermoScientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polioxietileno-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Coquetel Inibidor de Protease/fosfatase (100X)Tecnologia de Sinalização Celular5872S
Anticorpo Anti-TSG101 Recombinante [EPR7130(B)]ABCamab125011diluição 1:1000
Hidróxido de eslódioSigma-AldrichSX0603
Azida de sódioFisher ScientificBP922I-500
Cloreto de SódioSigma-AldrichS9888-500G
Dodecil sulfato de sódio,≥ 99,0% (GC), pellets sem poeiraSigma-Aldrich75746-1KG
TetrametiletilenodiaminaSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Kit de acrilamida FastCast sem manchas, 10%BioRad1610183
Microscópio eletrônico de transmissãoFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Tripsina 0,25% protease com tripsina suína, HBSS, EDTA; sem cálcio, magnésioCytivaSH30042.01
TunicamicinaTocris3516
Zeta Ver softwareAnalytikNTA software
de Filtro Centrífugo BioRad 1610747 3 Unidade de diluição

Referências

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  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
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