Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

Resumo

O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas ligadas à membrana lipídica de tamanho nanométrico que são liberadas de todas as células, estão presentes em todos os biofluidos e contêm proteínas, ácidos nucleicos e lipídios que refletem a célula-mãe da qual são derivadas. A separação adequada de EVs de outros componentes em uma amostra permite a caracterização de sua carga associada e fornece informações sobre seu potencial como comunicadores intercelulares e biomarcadores não invasivos para inúmeras doenças. No presente estudo, os EVs derivados de oligodendrócitos foram isolados de meios de cultura celular usando uma combinação de técnicas de ponta, incluindo ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para separar os EVs de outras proteínas extracelulares e complexos proteicos. Usando colunas SEC comercialmente disponíveis, os EVs foram separados de proteínas extracelulares liberadas de células de oligodendroglioma humano sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE). Os marcadores canônicos de EV CD9, CD63 e CD81 foram observados nas frações 1-4, mas não nas frações 5-8. GM130, uma proteína do aparelho de Golgi, e a calexina, uma proteína integral do RE, foram utilizadas como marcadores negativos de EV, e não foram observadas em nenhuma fração. Além disso, ao agrupar e concentrar as frações 1-4 como fração EV e as frações 5-8 como fração proteica, observou-se expressão de CD63, CD81 e CD9 na fração EV. A expressão de GM130 ou calexina não foi observada em nenhum dos tipos de fração. As frações agrupadas das condições de estresse de controle e ER foram visualizadas com microscopia eletrônica de transmissão e vesículas foram observadas nas frações EV, mas não nas frações proteicas. Partículas no EV e frações proteicas de ambas as condições também foram quantificadas com análise de rastreamento de nanopartículas. Juntos, esses dados demonstram que a SEC é um método eficaz para separar EVs de meios de cultura de células condicionadas.

Introdução

A explosão de interesse no estudo de vesículas extracelulares (EVs) tem sido acompanhada por grandes avanços nas tecnologias e técnicas usadas para separar e estudar essas partículas heterogêneas de tamanho nano. No tempo desde sua descoberta, há quase quatro^décadas1,2, descobriu-se que essas pequenas estruturas membranosas contêm lipídios, ácidos nucleicos e proteínas bioativos e desempenham papéis importantes na comunicação intercelular ^3,4. Os EVs são liberados de todos os tipos de células e, portanto, estão presentes em todos os fluidos biológicos,....

Protocolo

1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: Fazer reagentes de cultura celular no exaustor de cultura celular para manter a esterilidade.

1. Preparação de reagentes de cultura celular
   1. Preparar DMEM de glicose alta normal adicionando 50 mL de FBS e 5 mL de penicilina-estreptococo (Pen-Strep) em 500 mL de DMEM de alta glicose e armazenar a 4 °C. Use este meio para cultivar e expandir células.
   2. Preparar DMEM de glicose elevada depletada por exossomo adicionando 50 mL de FBS empobrecido por exossomo e 5 mL de Pen-Strep em 500 mL de DMEM de glicose alta e armazenar a 4 °C. Use este meio para tratamentos ....

Resultados

Western blotting revela separação adequada de EVs de CCM
Para avaliar a efetividade da SEC na separação de EVs dos meios de cultura celular, foi realizado um western blot utilizando cada fração individual das amostras controle para sondar a expressão dos três marcadores canônicos de EV, CD9, CD63 e CD81, bem como GM130 e calexina¹⁸, que foram utilizados como controles negativos (Figura 3). A expressão da albumina¹⁸ também fo.......

Discussão

SEC é um método fácil de usar para separar adequadamente EVs de CCM condicionado. A fim de isolar especificamente os EVs derivados de células, deve-se levar em conta uma consideração cuidadosa do tipo de CCM e seus suplementos. Muitos meios de cultura celular precisam ser suplementados com FBS, que contém EVs derivados do animal em que o soro foi colhido. Esses EVs séricos podem saturar e mascarar qualquer sinal produzido por EVs derivados de células em cultura²⁶. Portanto, ao realizar experimento.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	VWR	97064-588
4X Tampão de Amostra Laemmli	Unidade
Amicon Ultra-15, Ultracel, 3 KDa, 15mL	Sigma-Aldrich	UFC900308	kDa de corte
Filtro Centrífugo Amicon Ultra-2 com membrana Ultracel-3	Sigma-Aldrich	UFC200324	3 kDa de corte de
amônio Persulfato	Sigma-Aldrich	A3678-100G
Anti coelho IgG, HRP ligado Anticorpo	Cell Signaling Technology	7074V	1:1000 Diluição
Anti-Calnexina	anticorpo Abcam	ab22595	1:500 Anticorpo
monoclonal de camundongo anti-CD9	BioLegend	312102	1:500
anticorpo anti-GM130 de diluição [EP892Y] - cis-Golgi Marcador	Abcam	ab52649	1:500 Diluição
Anti-camundongo IgG, HRP-linked Anticorpo	Tecnologia de sinalização celular	7076V	1:1000 Diluição
Coletor automático de frações	Izon Science
Kit de ensaio BCA	Bio-Rad
CCD câmera	Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti BD humano		556019	1:1000 Diluição
CD81 Anticorpo	Santa Cruz Biotechnology	sc-23962	1:1000 Diluição
Cellstar Filter Cap Frascos de cultura de células	Greiner Bio-One	660175
ChemiDoc MP Imager	BioRad
Clarity Western ECL Substrate	BioRad	1705061
desoxicolato	Sigma-Aldrich	D6750-10G
ditiotreitol	Sigma	3483-12-3
DMEM/Alta glicose com L-glutamina; sem sódio	Cytiva	SH300022.
Soro bovino fetal FS Soro bovino premium	VWR	97068-085
Soro bovino fetal, esgotado com exossomo	Thermo Scientific	A2720801
Glycine	BioRad	1610718
Leite em pó desnatado de grande valor	Amazon	B076NRD2TZ
HOG Linha celular de oligodendroglioma humano	Sigma-Aldrich	SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Colunas de Exclusão de Tamanho 5pk	Izon Science
Metanol >99,8% ACS	VWR	BDH1135-4LP
Placas de vidro Mini-PROTEAN	BioRad	1653310	com espaçadores de 0,75 mm
Mini-PROTEAN Placas curtas	BioRad	1653308
NP-40	Sigma-Aldrich	492016
Penicilina-Estreptomicina, Solução	Sigma-Aldrich	P4458-100mL
Solução salina tamponada com fosfato PBS	Fisher Scientific	BP66150
Pierce BCA Kits de ensaio de proteína e reagentes	Thermo Fisher Scientific	23227
Pierce PVDF Membranas de transferência Thermo	Scientific	88518
Pierce Western Blotting Filter Paper	Thermo Scientific	84783
Polioxietileno-20 (TWEEN 20), 500mL	Bio Basic	TB0560
Coquetel Inibidor de Protease/fosfatase (100X)	Tecnologia de Sinalização Celular	5872S
Anticorpo Anti-TSG101 Recombinante [EPR7130(B)]	ABCam	ab125011	diluição 1:1000
Hidróxido de eslódio	Sigma-Aldrich	SX0603
Azida de sódio	Fisher Scientific	BP922I-500
Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Dodecil sulfato de sódio,≥ 99,0% (GC), pellets sem poeira	Sigma-Aldrich	75746-1KG
Tetrametiletilenodiamina	Sigma-Aldrich	T9281-25ML
TGX Kit de acrilamida FastCast sem manchas, 10%	BioRad	1610183
Microscópio eletrônico de transmissão	FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris	BioRad	1610716
Tripsina 0,25% protease com tripsina suína, HBSS, EDTA; sem cálcio, magnésio	Cytiva	SH30042.01
Tunicamicina	Tocris	3516
Zeta Ver software	Analytik		NTA software

de Filtro Centrífugo BioRad 1610747 3 Unidade de diluição