Modelos suínos de doenças aneurismáticas para treinamento e pesquisa

Resumo

Descrição de dois modelos diferentes de aneurismas suínos para cursos de treinamento em neurorradiologia e estudos de pesquisa. Este estudo fornece evidências da viabilidade dessas criações de modelos de aneurisma suíno e os métodos reprodutíveis que estão próximos do ambiente clínico.

Resumo

Modelos animais de grande porte, especificamente suínos, são amplamente utilizados para pesquisar doenças cardiovasculares e terapias, bem como para fins de treinamento. Este artigo descreve dois modelos diferentes de aneurismas suínos que podem ajudar os pesquisadores a estudar novas terapias para doenças aneurismáticas. Esses modelos de aneurisma são criados pela adição cirúrgica de uma bolsa de tecido às artérias carótidas em suínos. Quando o modelo é usado para pesquisa, a bolsa deve ser autóloga; Para fins de treinamento, uma bolsa sintética é suficiente.

Primeiramente, a veia jugular externa direita (EJV) e a artéria carótida comum direita (ACC) devem ser expostas cirurgicamente. O EJV é ligado e uma bolsa de veias formada a partir de um segmento curto. Essa bolsa é então suturada a uma arteriotomia elíptica realizada na CCA. Os animais devem ser mantidos heparinizados durante a criação do modelo, e vasodilatadores locais podem ser usados para diminuir os vasoespasmos. Uma vez concluída a sutura, o fluxo sanguíneo correto deve ser inspecionado, verificando se há sangramento da linha de sutura e patência do vaso. Finalmente, a incisão cirúrgica é fechada por planos e uma angiografia é realizada para obter imagens do modelo aneurismático.

Uma simplificação desse modelo carotídeo aneurismático que diminui a invasividade e o tempo cirúrgico é o uso de uma bolsa sintética, em vez de venosa. Para isso, uma bolsa é previamente confeccionada com um segmento de prótese de politetrafluoretileno (PTFE), sendo que uma extremidade é suturada com sutura vascular de polipropileno e esterilizada antes da cirurgia. Este "saco" é então anexado a uma arteriotomia realizada no CCA conforme descrito.

Embora esses modelos não reproduzam muitos dos eventos fisiopatológicos relacionados à formação de aneurismas, eles são hemodinamicamente semelhantes à situação encontrada no cenário clínico. Portanto, eles podem ser usados para fins de pesquisa ou treinamento, permitindo que os médicos aprendam e pratiquem diferentes técnicas endovasculares em modelos animais próximos ao sistema humano.

Introdução

O aneurisma intracraniano (AI) é uma doença cerebrovascular grave associada a uma taxa de mortalidade de até 50% quando rompido. É uma condição relativamente comum e potencialmente letal, com prevalência relatada entre 3,6% e 6% em estudos angiográficos¹. Os vasos intracranianos estão anormalmente dilatados e sofrem distensão devido a fatores de risco multifatoriais, incluindo, mas não se limitando a, tabagismo, hipertensão, ingestão excessiva de álcool ou idade avançada. Quando não tratada, a IA pode se romper espontaneamente, resultando em hemorragia subaracnóidea (HAS), responsável por morbidade significativa e morte ^2,3,4. Além disso, um terço dos pacientes necessita de hospitalização ou cuidados de enfermagem, e apenas 30% dos pacientes com HAS podem retornar à vida independente, representando uma séria carga de doença em humanos que realmente justifica a necessidade de experimentos com animais⁵.

Atualmente, pacientes com alto risco de ruptura e hemorragia IA são tratados com oclusão principalmente por embolização endovascular, clipagem microcirúrgica ou stents de desvio de fluxo ^6,7. O procedimento endovascular foi avaliado pelo International Subaracnoid Aneurysm Trial (ISAT), demonstrando que a embolização é mais segura, menos invasiva e, portanto, tem efeitos adversos menos significativos do que a terapia microcirúrgica³. Por esses motivos, os procedimentos endovasculares são as técnicas mais utilizadas para o tratamento da IA³. É necessário treinamento especializado para que os médicos realizem esses procedimentos minimamente invasivos^{corretamente 8}.

Além disso, o desenvolvimento de novos dispositivos ou terapias para o tratamento de IA precisa ser bem estabelecido e testado em estudos pré-clínicos antes de sua tradução para o ambiente clínico ^6,9. Existem diferentes modelos animais experimentais de IA de acordo com o objetivo principal dos fins de pesquisa ou treinamento. Esses modelos foram realizados em inúmeras espécies, com suas limitações e vantagens. No entanto, todos eles envolvem indução artificial ou criação cirúrgica devido à ausência de IA natural em animais 2,6,9,10,11,12.

Embora nenhum modelo animal reproduza perfeitamente a fisiopatologia humana, pequenos animais, como roedores, são os mais frequentemente utilizados em estudos de IA⁶. Espécies grandes são geralmente empregadas para o desenvolvimento de novos dispositivos endovasculares ou treinamento em intervenções terapêuticas². Entre os modelos animais de grande porte, é comum o uso de suínos para pesquisar distúrbios e terapias de IA, bem como para cursos de treinamento. Isso se deve à sua capacidade de tolerar o procedimento cirúrgico e ao diâmetro vascular e fluxo sanguíneo semelhantes quando comparados aos vasos cerebrais humanos ^2,13.

O método de escolha para a criação do modelo animal IA varia de acordo com o objetivo principal de cada projeto de pesquisa individual, como se os desfechos angiográficos ou histológicos serão avaliados. Nesse sentido, modelos criados por ligadura cirúrgica ou pela adição de uma bolsa autóloga de tecido à CCA são utilizados para pesquisa de crescimento IA. Os modelos cirúrgicos devem ser combinados com a indução da hipertensão se o desfecho primário do estudo for a ruptura IA. Quando o modelo é utilizado para fins de treinamento, a técnica pode ser simplificada com o uso de uma bolsa sintética suturada na ACC sem a necessidade de hipertensão⁶.

Este artigo descreve dois modelos diferentes de aneurismas suínos que podem ajudar os pesquisadores a estudar novas terapias ou treinamento em intervenções endovasculares para doenças IA. Esses modelos de aneurisma são criados pela adição cirúrgica de uma bolsa de tecido ao CCA em suínos. Quando o modelo é utilizado para pesquisa, a bolsa é autóloga, proporcionando assim a capacidade de estudar a cicatrização do aneurisma após a exclusão sem a interferência de qualquer material exógeno. Para fins de treinamento, basta uma bolsa sintética que recapitula a anatomia endovascular para reproduzir o procedimento.

Protocolo

A experiência foi aprovada pelo comité de ética do Centro de Cirurgia Minimamente Invasiva Jesús Usón, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Real Decreto 53/2013 e o regulamento europeu (2010/63/CE).

1. Preparo pré-cirúrgico e anestesia

1. Suínos brancos de grande porte pesando 35-40 kg individualmente, com livre acesso à água e ração uma vez ao dia. Aclimatar por 2 semanas antes da data da intervenção, para realizar exame clínico e dar tempo para detecção de doenças silenciosas.
2. Administre os seguintes medicamentos orais para prevenir eventos trombóticos durante o estudo: Ácido acetilsalicílico (1 g/animal/24 h) e Clopidogrel (75 mg/animal/24 h) a partir de 7 dias antes da indução do modelo até a terapia IA.
3. Injete cetamina (10 mg / kg) por via intramuscular após um período de jejum de 24 horas. Dez minutos depois, induzir a anestesia com propofol a 1% por via intravenosa (3 mg/kg).
4. Após a intubação endotraqueal, use sevoflurano inalatório para manter a anestesia (3%-4,5% da fração inspiratória). Conecte os tubos endotraqueais a um circuito anestésico circular semifechado conectado a um ventilador com uma taxa de fluxo de gás fresco de 0.5-1 L/min.
5. Para obter normocapnia (35-45 mmHg CO₂), controlar a ventilação por um volume corrente de 8-10 mL/kg. Garanta uma analgesia intraoperatória adequada por uma dose intravenosa inicial de combinação de cetorolaco (1 mg / kg) e tramadol (1 mg / kg) e uma infusão contínua de remifentanil (15-18 μg / kg / h).
6. Confirmar o plano animal adequado de anestesia considerando inconsciência (hipnose), insensibilidade à dor, relaxamento muscular e ausência de respostas reflexas¹⁴.
7. Para evitar o ressecamento durante a anestesia, use uma pomada veterinária nos olhos durante o procedimento cirúrgico.
8. Fixe os animais anestesiados na mesa cirúrgica em decúbito dorsal. Raspe o pescoço dos animais, esfregue com iodopovidona e cubra em condições estéreis.
9. Realize todos os procedimentos em condições estéreis, usando luvas e materiais estéreis.

2. Cirurgia

1. Abordagem cirúrgica
   1. Faça uma incisão longitudinal na pele de 10 cm de comprimento, 2-3 cm à direita da linha média do pescoço.
2. Alfaiataria de bolsa
   1. Bolsa autóloga
      1. Para expor o EJV, dissecar o tecido subcutâneo e adiposo e realizar hemostasia.
      2. Separe o músculo esternocefálico direito do tecido conjuntivo e retraia-o com um afastador Weitlaner para facilitar a exposição ao EJV.
      3. Exponha e identifique o EJV, que é lateral e mais profundo que o CCA (Figura 1A).
      4. Use duas pinças vasculares bulldog para interromper o fluxo sanguíneo dentro do vaso durante a extração do segmento venoso.
      5. Isole um segmento de 15-20 mm do EJV para obter a bolsa autóloga.
      6. Ligue as extremidades proximal e distal do EJV.
      7. Lave o segmento da veia extraída com solução salina heparinizada (5.000 UI/L).
      8. Verifique o interior do EJV excisado e selecione um segmento de 7-8 mm de comprimento onde não haja válvulas venosas.
      9. Transforme este segmento em uma bolsa fechando uma extremidade com uma sutura contínua de polipropileno 7/0 (Figura 1B).
      10. Mantenha a bolsa imersa em solução salina heparinizada até o uso.
      11. Confirme se não há sangramento do EJV ligado.
   2. Bolsa sintética
      1. Corte um segmento de 1 cm de comprimento de uma prótese de PTFE (6-8 mm de diâmetro, dependendo do tamanho do aneurisma que será criado).
      2. Suturar uma extremidade fechada com uma sutura vascular de polipropileno 6/0. Sele esta parte fechada da prótese com cola vascular para evitar sangramento da linha de sutura.
      3. Esterilize este enxerto sintético antes da criação do aneurisma cirúrgico.
3. Cirurgia de criação de aneurisma
   1. Para expor o CCA, dissecar o tecido subcutâneo e adiposo e realizar hemostasia.
   2. Separe o músculo esternocefálico direito do tecido conjuntivo circundante e retraia-o com um afastador Weitlaner para facilitar a exposição ao CCA.
   3. Identifique o CCA. Coloque 2 alças de vasos de silício na extremidade cranial e distal do CCA exposto ( Figura 2A ). Dissecar 5 cm desse vaso, retirando sua adventícia com um dissector (Figura 2B). Durante este acesso cirúrgico, tome cuidado para evitar lesões no nervo vago que podem levar à síndrome de Horner.
   4. Administre vasodilatadores localmente (como 1-2 mL de nimodipina 10 mg / 50 mL) para prevenir vasoespasmos.
   5. Administre heparina por via intravenosa (150 UI/kg) 5 min antes do pinçamento cruzado do CCA.
   6. Coloque uma pinça vascular bulldog na parte caudal dissecada da ACC e outra pinça vascular bulldog a 4-5 cm de distância na parte cranial do vaso (Figura 2C).
   7. Use uma microtesoura para realizar uma arteriotomia elíptica de 8 mm na CCA entre as duas pinças vasculares bulldog (Figura 2D).
   8. Use solução salina heparinizada (5.000 UI/L) para lavar o segmento da CCA por via intraluminal.
   9. Suturar a bolsa autóloga ou sintética à arteriotomia elíptica usando uma sutura contínua de polipropileno 6/0 (Figura 3A,B). Lave as pinças distal e proximal antes de terminar a sutura da bolsa.
   10. Proteja o vaso e as estruturas próximas com solução salina quente e heparinizada durante o procedimento microcirúrgico.
   11. Uma vez suturada a prótese ou bolsa autóloga à ACC, verificar se não há sangramento (Figura 3C,D). Primeiro, remova a pinça vascular do buldogue craniano e depois a caudal.
   12. Realize a hemostasia aplicando pressão com cotonetes úmidos se houver algum sangramento da linha de sutura. Se necessário, aplique tração nas alças dos vasos ou substitua os grampos vasculares bulldog e faça pontos hemostáticos no local do sangramento. Se necessário, coloque um pedaço de esponja de gelatina hemostática ao redor da prótese.
   13. Inspecione o pulso CCA cranial ao saco aneurismático para garantir que a permeabilidade correta da carótida tenha sido recuperada.
   14. Feche a incisão cirúrgica por planos com pontos absorvíveis 2/0 e a pele com pontos simples com pontos 0 inabsorvíveis.
   15. Administrar buprenorfina (10 μg/kg/12 h) por via intramuscular durante as primeiras 24 h e colocar um adesivo de liberação transdérmica de fentanil (25 μg/h) após os procedimentos cirúrgicos para obter analgesia pós-operatória.
   16. Diminua o sevoflurano inalado e aumente a taxa de fluxo de gás fresco (20 L / min) para obter condições de recuperação. Remova o tubo endotraqueal quando os animais respirarem espontaneamente e os parâmetros fisiológicos tiverem sido recuperados, como saturação de oxigênio e frequência cardíaca.
       NOTA: O gás fresco é uma mistura de O₂ puro (100%) e ar medicinal (21% O₂). Finalmente, a fração inspirada de oxigênio é de 50% a 45% (FiO₂ = 0,5-0,45).
   17. Não deixar os animais sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
   18. Manter os animais que foram submetidos a cirurgia isolados de outros animais até que estejam totalmente recuperados.

3. Teste de angiografia e fase pós-operatória

1. Aguarde 24-48 h para evitar danificar a linha de sutura.
2. Anestesie o animal novamente conforme descrito acima e raspe a região da virilha. Prepare a zona com iodopovidona e aplique cortinas estéreis.
3. Acesse uma artéria femoral usando a técnica de Seldinger modificada com uma bainha introdutora de 6Fr.
4. Insira um cateter headhunter 5Fr através da bainha femoral sobre um fio-guia hidrofílico de 0,035 pol. Sob orientação fluoroscópica, avance este cateter até a origem da ACC e remova o fio-guia.
5. Injete meio de contraste (ácido amidotrizóico diluído a 50% com solução salina) através do cateter headhunter para obter imagens do modelo de ACC com aneurisma.
6. Uma vez que a angiografia confirme a criação correta do modelo de aneurisma, use modelos animais para pesquisa ou para treinamento de procedimentos de tratamento endovascular.
7. Eutanasiar os animais quando os estudos ou cursos de treinamento terminarem com uma administração intravenosa letal de cloreto de potássio (2 mmol / kg) sob anestesia profunda.

Resultados

A técnica apresentada tem sido utilizada para diferentes fins, nomeadamente investigação na cicatrização de aneurismas pós-enrolamento e treino em técnicas de embolização. As bolsas venosas têm sido usadas para testar a cicatrização diferencial usando bobinas de platina e bioativas. As bolsas foram suturadas conforme descrito acima e, 24 h após a criação do modelo, foi obtida uma angiografia para documentar as dimensões e a aparência dos aneurismas. A embolização endovascular com mola foi realizada com sucesso em todos o...

Discussão

Existem diferentes técnicas para criar modelos animais de aneurisma com base no objetivo do estudo. Alguns protocolos de modelos de aneurismas incluem procedimentos cirúrgicos combinados com hipertensão ou indução de estresse hemodinâmico pela administração de angiotensina II, nefrectomias ou dieta rica em sal, entre outros, pois o objetivo principal desses estudos é a pesquisa de ruptura de aneurisma. No entanto, no presente estudo, essas condições não são induzidas, uma vez que esses m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido acetilsalicílico	Sanofi	700693	comprimidos 500 mg
Ácido amidotrizoico	Bayer Hispania	914614.6	Meio de contraste 76%
Anesthesia Machine	Maquet Clinical Care AB	6677200	Maquet Flow-i C20
Bulldog grampo vascular	Dimeda	12.092.07	7,5 cm
Buprenorfina	Richter Pharma Ag	578816	0,3 mg/mL
Clopidogrel	Sandoz	704005	75 mg comprimidos
Meio de contraste	Bayer Hispania	914614	Urografin 36%
Dissector	Dimeda	12.421.01	21 cm
Matriz de Fentanil	Kern Pharma	664823	Adesivo de liberação transdérmica 25 µ g/h
Equipamento de fluoroscopia	Philips Medical Systems		Veradius Unity
Esponja de gelatina hemostática	Takeda Farmaceutica Españ a, SA	324459	Agente hemostático absorvível. Espongostan
Cateter de caçador de cabeça	Boston Scientific	RF*YB15110M	5 Fr 100 cm
Heparina	Rovi	641639	Heparina 5%
Fio-guia hidrofílico	Terumo	RF*GA35153M	0,035" 150 cm
Introdutor bainha	Terumo	RS*B60N10MQ	6 Fr 10 cm
Cetamina	Richter Pharma Ag	580395	100 mg/mL
Ketorolac	Laboratorios Normon, S.A.	603079	30 mg/mL
Micropinça	S& T	JFA-5b (1:1)	Fórceps para microsugery
Micro-agulha titular	S & T	Curvo C-14 (Art nº 00088)	Porta-agulhas para microcirurgia
Microtesoura	S& T	Adventitia SAS-15 R-8 (Art nº 00102)	Tesoura reta para microcirurgia Porta-agulha
	Dimeda	24.114.12	12 cm
Nimodipine	Bayer Hispania, S.L	641969	10 mg/50 mL
Iodo-povidona	CV Medica	193203	Solução de iodopovidona (10%)
Propofol	Orion Corporation	588475	10 mg/mL
Prótese em PTFE	Maquet	M00201501086B0	Prótese sintética 6mm
Remifentanil	Laboratorios Normon, S.A.	692295	2 mg
Cabo de bisturi	Dimeda	06.104.00	13,5 cm
Tesoura (Mayo)	Dimeda	07.164.14	14,5 cm
Tesoura  (Metzenbaum)	Dimeda	07.287.15	15 cm
Lâminas cirúrgicas	Dimeda	06.122.00	22
Suturas: sutura absorvível	Medtronic	GL-123	2/0
Suturas: sutura de poplipropileno	Aragó	37803	6/0 e 7/0
Swabs	Texpol	1063.01	20 x 20 cm
Pinça de tecido	Dimeda	10.102.11 /10.120.11	11,5 cm
Cola vascular	Histoacryl Braun	1050060	Adesivo de tecido
Alças de vaso	Braun	B1095218	1,5 mm de diâmetro
Weitlaner	Dimeda	18.670.14	14 cm