Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

Resumo

Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.

Resumo

A microbiota intestinal tem um papel importante na educação do sistema imunológico. Essa relação é extremamente importante para a compreensão de doenças autoimunes que não são apenas impulsionadas por fatores genéticos, mas também por fatores ambientais que podem desencadear o início e/ou piorar o curso da doença. Um estudo publicado anteriormente sobre a dinâmica da microbiota intestinal em camundongos fêmeas MRL/lpr propensas ao lúpus mostrou como as mudanças da microbiota intestinal podem alterar a progressão da doença. Aqui, um protocolo é descrito para extrair amostras representativas da microbiota intestinal para estudos de autoimunidade. Amostras de microbiota são coletadas do ânus e processadas, das quais o DNA é extraído usando um método fenol-clorofórmio e purificado por precipitação de álcool. Após a execução da PCR, os amplificadores purificados são sequenciados usando uma plataforma de sequenciamento de próxima geração no Argonne National Laboratory. Finalmente, os dados de sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S são analisados. Como exemplo, são mostrados dados obtidos a partir de comparações da microbiota intestinal de camundongos MRL/lpr com ou sem CX₃CR1. Os resultados mostraram diferenças significativas em gêneros contendo bactérias patogênicas, como as do filo Proteobacteria, bem como do gênero Bifidobacterium, que é considerado parte da microbiota comensal saudável. Em resumo, este método de isolamento de DNA simples e econômico é confiável e pode ajudar na investigação de alterações da microbiota intestinal associadas a doenças autoimunes.

Introdução

Humanos e bactérias coexistem há muito tempo. Eles estabeleceram uma relação codependente com efeitos benéficos mútuos que influencia as respostas imunes do hospedeiro de forma quantitativa e qualitativa¹. Estudos recentes sugerem uma associação entre a composição da microbiota intestinal e a patogênese de doenças autoimunes que incluem esclerose múltipla 2, artrite reumatoide³, diabetes tipo^{2 4}, doença inflamatória intestinal⁵ e lúpus eritematoso sistêmico (LES)⁶. No entanto, ainda não está claro se a microbiota intestinal é ....

Protocolo

O locus Cx3cr1 gfp/gfp de camundongos B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J foi retrocruzado para camundongos MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) por 10 gerações para gerar camundongos MRL/^lpr-CX ₃ CR1 gfp^/gfp. A triagem do genoma usando painéis de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) confirmou que o fundo genético de camundongos recém-gerados era mais de 97% idêntico ao do LMR/lpr. Depois disso, os camundongos foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos, seguindo os requisitos específicos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. As amostras foram ....

Resultados

Os resultados do Argonne National Laboratory são analisados por um bioinformático qualificado, seguido por uma análise interna dos dados usando métodos estatísticos padrão. As análises típicas do microbioma envolvem o agrupamento de sequências semelhantes em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) ou variantes de sequência amplicon (ASVs) como proxy para diferentes microrganismos em uma amostra. As contagens de OTUs ou ASVs entre amostras podem então ser usadas para testar mudanças na diversidade dentro da amostra (alfa.......

Discussão

A microbiota intestinal equilibrada pode proteger o corpo humano de doenças. Uma vez que esse equilíbrio é interrompido por gatilhos externos ou internos, as consequências podem ser devastadoras. Este método apresenta uma forma de analisar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos murinos. O método é adequado não apenas para comparações entre grupos, mas também para rastrear a microbiota intestinal ao longo do tempo para identificar melhor os fatores dependentes do tempo que perturbam a microbiota intestinal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Contas de vidro de 0,1 mm	Produtos BioSpec	11079101
tubos de tampa de rosca de 2 mL	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Etanol, Grau de Biologia Molecular	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Amônio (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogeneizador
Clorofórmio	FisherScientific	C298-500
DEPC-Água	Tratada Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ácido	Etilenodiamina TetracéticoFisherScientific	BP118-500	EDTA
Vedação da placa	de folha FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL / MpJ-Faslpr / J (MRL / lpr) camundongos	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Fenol: clorofórmio: isoamilalcool (25:24:1)	Escala PCI FisherScientific	BP1752I-400
com 4 casas decimais	de MS205DU		Mettler Toledo
	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Cloreto de sódio	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
	Vortex Indústrias Científicas	SI-0236

Acetato de Placas de 96 poços com contorno