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Summary

O presente protocolo descreve a construção de matrizes de microeletrodos personalizadas para registrar potenciais de campo locais in vivo a partir de múltiplas estruturas cerebrais simultaneamente.

Abstract

Os pesquisadores muitas vezes precisam registrar potenciais de campo locais (LFPs) simultaneamente a partir de várias estruturas cerebrais. A gravação de várias regiões cerebrais desejadas requer diferentes projetos de microeletrodos, mas matrizes de microeletrodos disponíveis comercialmente muitas vezes não oferecem tal flexibilidade. Aqui, o presente protocolo descreve o design simples de matrizes de microeletrodos feitos sob medida para registrar LFPs de múltiplas estruturas cerebrais simultaneamente em diferentes profundidades. Este trabalho descreve como exemplo a construção dos microeletrorgéticos cortical, estiregal, ventrolateral e nigral. O princípio de design delineado oferece flexibilidade, e os microeletrodos podem ser modificados e personalizados para gravar LFPs de qualquer estrutura, calculando coordenadas estereoléxicas e mudando rapidamente a construção de acordo com diferentes regiões cerebrais em camundongos livremente móveis ou anestesiados. O conjunto de microeletrísmo requer ferramentas e suprimentos padrão. Essas matrizes personalizadas de microeletrorosão permitem que os pesquisadores projetem facilmente matrizes de microeletrodos em qualquer configuração para rastrear a atividade neuronal, fornecendo gravações LFP com resolução de milissegundos.

Introduction

Os potenciais de campo locais (LFPs) são os potenciais elétricos registrados a partir do espaço extracelular no cérebro. Eles são gerados por desequilíbrios de concentração de íons fora dos neurônios e representam a atividade de uma pequena população localizada de neurônios, permitindo monitorar precisamente a atividade de uma região cerebral específica em comparação com as gravações de EEG de macroescala¹. Como estimativa, as microeletrões LFP separadas por 1 mm correspondem a duas populações completamente diferentes de neurônios. Enquanto o sinal EEG é filtrado por tecido cerebral, fluido cefalorraquidiano, crânio, músculo e pele, o sinal LFP é um marcador confiável da atividade neuronal local¹.

Os pesquisadores muitas vezes precisam gravar LFPs simultaneamente de várias estruturas cerebrais, mas matrizes de microeletrodos disponíveis comercialmente muitas vezes não oferecem tal flexibilidade. Aqui, o presente protocolo descreve microeletrodos totalmente personalizáveis e facilmente construídos para registrar simultaneamente LFPs de qualquer região cerebral desejada em diferentes profundidades. Embora os LFPs tenham sido amplamente usados para registrar a atividade neuronal de uma região cerebral específica 2,3,4,5,6,7,8,9, o design personalizável atual permite registrar LFPs de várias regiões cerebrais superficiais ou profundas ^11,12 . O protocolo também pode ser modificado para construir qualquer matriz de microeletrodos desejada, determinando coordenadas estereoléxicas das regiões cerebrais e montando a matriz de acordo. Estes microeletrodos com uma taxa de amostragem de 10 kHz e resistência de 60-70 kΩ (2 cm de comprimento) permitem gravar LFPs com precisão de milissegundos. Os dados podem então ser amplificados por um amplificador de 16 canais, filtrado (low pass 1 Hz, high pass de 5 kHz) e digitalizado.

Protocol

O presente trabalho é aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia. C57Bl/6 camundongos de ambos os sexos (7-12 semanas) foram usados para os experimentos. Os animais foram mantidos em um ciclo escuro de 12h/12h e tiveram acesso a ad libitum a alimentos e água.

1. Construção de microeletrodo

1. Para construir os microeletrodos, utilize 50 μm (diâmetro) de fio de níquel-cromo revestido de diamel (ver Tabela de Materiais). Grave uma extremidade do fio na parte de trás da plataforma e enrole o fio três vezes ao redor do botão mais próximo da plataforma (Figura 1A,C).
   NOTA: Uma plataforma acrílica com dois botões (2 x 5 polegadas) foi usada aqui, mas qualquer plataforma pode ser usada.
   1. Estique o fio ao redor do segundo botão mais distante para fazer dois loops entre os botões. Enrole o fio mais três vezes ao redor do primeiro botão para fixar o fio no lugar e tape a extremidade novamente na parte de trás da plataforma.
      NOTA: Depois que os fios forem separados (etapas 1.2-1.3.1), deve haver dois fios em cada lado (quatro fios no total, Figura 1B).
2. Coloque as barras de tensão sob os fios com a fita enrolada ao redor delas (lado pegajoso para cima) (Figura 1C).
   NOTA: Foram utilizadas peças de acrílico triangular para as barras de tensão, com fita enrolada ao redor delas (lado pegajoso do lado de fora para fixar os fios). O lado pegajoso da fita fora das barras de tensão manterá os fios no lugar para ajustar a distância entre eles. As barras de tensão devem estar a ~2,5 cm de distância dos botões, e os fios não devem estar soltos.
3. Utilizando um microscópio e fórceps finos, faça uma lacuna de 3 mm ou 4,5 mm entre os fios (3 mm de distância entre os fios para fazer microeletrodos cortical (Ctx) – núcleo dislamático ventrolateral (VL); 4,5 mm de lacuna para fazer microeletrodos estriais (Str) – nigral (SNR) (Figura 1B).
   1. Se a ampliação for usada no microscópio, certifique-se de calcular e ajustar para a diferença na ampliação e a distância real entre os fios.
      NOTA: Se microeletrodos forem construídos para estruturas diferentes das utilizadas aqui, a distância entre os fios precisa ser ajustada à distância estereotipada entre as estruturas. A Figura 2B fornece um exemplo de como os fios serão organizados; assim, as coordenadas estereotribílicas para outras estruturas devem ser ajustadas.
4. Corte quatro pequenos pedaços de plástico (0,5 mm de espessura) ~6 mm (largura) x 3 mm (altura) (Figura 1C).
   NOTA: Quaisquer peças plásticas podem ser usadas desde que tenham 0,5 mm de espessura; aqui, foi utilizada tubulação quadrada em que os pinos foram vendidos (Pinos, ver Tabela de Materiais). Se for usada uma espessura diferente, adicione mais ou menos pedaços de plástico para caber nas coordenadas estereotribíticas necessárias.
5. Aplique cola (ver Tabela de Materiais) no plástico e coloque-as nos fios (Figura 1C). Coloque peças plásticas ~1,0 cm de distância do meio do fio, que fica a 1,0 cm da barra de tensão. Remova o excesso de supercola com um cotonete.
6. Após a supercola seque, corte os fios usando uma tesoura fina, na ordem indicada na Figura 1C.
7. Corte quatro tubos de vidro de 7 mm usando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e insira os fios de eletrodo nos tubos de vidro, conforme indicado na Figura 2A.
   1. Insira pares de eletrodos VL e SNR nos tubos de vidro.
      NOTA: Apenas os fios para estruturas profundas precisam ser inseridos nos tubos de vidro para suportar a implantação cirúrgica. Certifique-se de não inserir eletrodos corticais no tubo de vidro.
8. Coloque a cola na base dos tubos de vidro para conectá-los ao plástico. Espere algum tempo até a cola ser.
9. Corte os tubos de vidro e os fios usando um bisturi como indicado na Tabela 1; garantir que os comprimentos dos microeletros estejam corretos. Se os microeletrodos atingirem diferentes estruturas, ajuste a distância de corte de acordo com as coordenadas estereotributivas necessárias.

Figura 1: Esquema da construção de microeletrodo. (A) Fixação de fios na plataforma com barras de tensão abaixo dos fios. (B) A distância entre os fios. (C) Quatro pedaços de plástico estão colados nos fios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Ctx	Str	VL	SNR
AP (Anterior/Posterior)	2.2	1.2	-1.3	-3.3
ML (Medial/Lateral)	1.8	1.5	1	1.5
DV (Dorsal/Ventral)	0.5	3.5	4	4.75
Comprimento do eletrodo	4	4.75	5.25	6

Tabela 1: Coordenadas e dimensões de implantação estereotaxic dos microeletrodos.

2. Montagem da matriz de microeletrodos

1. Use a cola para fixar plásticos na ordem desejada das regiões-alvo. Um exemplo para eletrodos cortical, talâmico, estriatal e nigral é mostrado na Figura 2B,C.
   1. Coloque o par de eletrodos Ctx-VL de frente para baixo (lado com fios de eletrodo tem que ficar de frente para baixo) e conecte duas peças vazias de 6 mm x 3 mm de plástico na parte superior com cola.
   2. Em cima das três peças de plástico, coloque o segundo par de eletrodos Ctx-VL com os eletrodos voltados para cima (use um microscópio e certifique-se de que os eletrodos VL estejam alinhados).
      NOTA: O alinhamento dos eletrodos bilaterais (aqui, o alinhamento dos eletrodos VL esquerdo e direito) é essencial para atingir adequadamente as estruturas bilaterais desejadas.
   3. Use a cola para fixar os eletrodos SNR na parte superior com os eletrodos SNR a 2,0 mm de distância dos eletrodos VL e ~5,0 mm de distância dos eletrodos corticais (os fios de eletrodo SNR têm que enfrentar para cima).
   4. Repita o passo 2.1.3. para o outro lado (os fios de eletrodo SNR têm que enfrentar fora da matriz de microeletrodos).
2. Aplique resina epóxi ao redor do plástico para unir os eletrodos. Evite colocar resina epóxi nos eletrodos.
3. Pegue um fio grosso e faça um loop em uma extremidade. Mergulhe o laço na solução epóxi e coloque-o sobre o plástico, garantindo que o fio grosso esteja deitado plano (Figura 2D) para que para os próximos passos, este fio possa ser usado como uma alça. Espere até que os eletrodos estejam totalmente secos.
4. Corte os fios para 2 cm, como mostrado na Figura 2E.

Figura 2: Construção e dimensões microeletrodes. (A) Quatro pares de eletrodos formados após o corte dos fios com tesouras, conforme indicado na Figura 1C (2 pares de eletrodos Ctx-VL e 2 pares de eletrodos Str-SNR). Insira eletrodos de estrutura profunda (VL e SNR) nos tubos de vidro e cole suas bases em plástico (pontos vermelhos). (B) Visão superior: Os pares de eletrodos de (A) são colados em uma pilha para criar o núcleo de microeletrodo. Linhas vermelhas indicam linhas de cola. (C) Vista lateral frontal de (B). (D) O fio espesso foi ligado aos microeletrodos. (E) Os fios são agrupados conforme indicado, e as extremidades isoladas são raspadas e cortadas em 2 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Conexão microeletrísmo ao fone de ouvido

1. Agrupar os fios conforme indicado na Figura 2E e raspar 1 mm das extremidades isoladas com um bisturi.
2. Dobre os eletrodos cortical como mostrado na Figura 3A. Separe os fios conforme mostrado na Figura 3B. Usando fórceps finos, faça um loop na extremidade de cada fio (Figura 3B).
3. Segure um fone de ouvido de 10 pinos com um hemostat (ver Tabela de Materiais) e use a extremidade de madeira de um cotonete para aplicar quantidades mínimas de fluxo nos pinos (Figura 3C). Certifique-se de não colocar o fluxo fora dos pinos para evitar um curto-circuito entre os pinos.
4. Usando a extremidade de madeira de um cotonete, aplique fluxo nas alças do fio.
5. Soldar os laços de fio para o fone de ouvido de 10 pinos, como mostrado na Figura 3C. Após soldar, seque o fone de ouvido para evitar um curto-circuito entre os pinos.
6. Pegue um fio fino (0,005-0,008 polegadas) para a referência e os fios de terra e retire o plástico de uma extremidade. Faça um loop na outra extremidade do fio.
7. Soldar o lado despojado da referência e fios de terra para seus respectivos pinos (Figura 3A,C).
8. Segurando o fio grosso (Figura 2D), aplique cimento cranioplastia ao redor dos microeletrodos, especialmente quando os fios se conectam aos pinos. Evite tocar nas extremidades reais do eletrodo com o cimento.
9. Depois que o cimento secar, coloque resina epóxi na base dos tubos de vidro, fios de microeletrodo striatal, e todo o eletrodo. Evite tocar nas extremidades reais do eletrodo com resina epóxi. Espere até que os eletrodos estejam totalmente secos.
10. Os eletrodos estão prontos. Faça furos no crânio do mouse (de acordo com as coordenadas estereotaxas necessárias) usando uma broca dentária e implante o fone de ouvido como mostrado na Figura 3D , baixando o fone de ouvido com microeletrodos voltados para o crânio e os orifícios apropriados. O fone de ouvido pode ser anexado ao braço estereotaxico para suporte durante a implantação.

Figura 3: Implantação de microeletrodo. (A) Os eletrodos cortical são dobrados conforme indicado. (B) Os fios são separados para fazer loops nas extremidades. (C) O fluxo (nos pontos vermelhos) e os fios em loop são soldados para o fone de ouvido de 10 pinos, garantindo que cada fio vá para o pino apropriado. (D) O fone de ouvido é implantado para gravar LFPs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Marcando localização do eletrodo após gravações

1. Ao final das gravações de LFP, confirme a posição correta dos eletrodos na região alvo aplicando uma corrente nas pontas do eletrodo para fazer uma lesão e esperando por 30 minutos antes de perfumar o mouse.
   NOTA: Configurações de lesão para confirmar a localização das pontas do eletrodo: Estouro único, 40 μA, pulso de onda quadrada monofásica de 0,75 ms, 50 Hz, 30 s.
2. Anestesiar os camundongos com isoflurano (até o rato dormir) e perfumar¹⁰ transcardialmente com 4% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M tampão de fosfato de sódio. Seção o cérebro (40 μm de espessura) em um criostat (ver Tabela de Materiais) e colora com DAPI (0,02% em PBS). Confirme a localização correta dos eletrodos pela presença das lesões da ponta do eletrodo, conforme mostrado na Figura 4B,C.
   NOTA: O percentual do isoflurane precisa ser aplicado seguindo as diretrizes individuais da instituição.

5. Medir a resistência ao eletrodo

1. Meça a resistência dos eletrodos e verifique o curto-circuito entre os eletrodos usando um ohmímetro multi-alcance (ver Tabela de Materiais). Coloque a escala de resistência em R x 10.000, indicando que uma deflexão unitária no ponteiro corresponde à resistência de 1 kΩ. Eletrodos de 2 cm de comprimento precisam ter resistência de 60-70 kΩ.
2. Personalize o fone de ouvido levando dez pinos individuais (ver Tabela de Materiais). Soldar cada pino com um fio de cobre fino e multi-encalhado em um cabo.
   1. Pressione os pinos soldados com as caudas correspondentes do cabo no soquete de acasalamento de linha dupla de 10 pinos (soquetes correspondentes). Pressione os pinos abertos do soquete de acasalamento no fone de ouvido LFP. Desta forma, cada eletrodo LFP tem um fio de cabo designado no conjunto.
3. Mergulhe a ponta de cada eletrodo LFP (a resistência a ser medida) em solução salina NaCl de 0,9% (concentração de NaCl no sangue). Conecte a extremidade do fio do cabo que corresponde ao eletrodo LFP ao terminal positivo do ohmmeter.
   1. Use um fio de baixa resistência (100 Ω) com um lado na água salina e o outro lado como a extremidade aberta. Conecte a extremidade aberta do fio de baixa resistência ao chão do ponteiro ohmmeter.
      NOTA: Este arranjo completa o circuito e solicita uma deflexão do ponteiro ohmmeter.
4. Certifique-se de que não há conexão elétrica entre dois eletrodos no fone de ouvido. Verifique o isolamento elétrico dos eletrodos LFP pairwise (terra: um cabo corresponde a um eletrodo; positivo: outro cabo corresponde a outro eletrodo). Descarte os eletrodos se houver alguma deflexão neste caso.

Representative Results

Discussion

Historicamente, as matrizes de microeletrodos têm sido amplamente utilizadas para registrar atividade neuronal de uma região cerebral específica de interesse 2,3,4,5,6,7,8,9,13. No entanto, nosso design fácil de microeletrídres permite gravar a partir de múltiplas estruturas simultaneamente^11,12. Aqui, a construção dos microeletros cortical, talámico, estriatal e nigral são descritos como exemplo. Os investigadores podem modificar o projeto da microeletromida para se adequar a qualquer estrutura desejada, calculando as distâncias estereotribílicas necessárias e ajustando a construção de acordo.

Por exemplo, nós modificamos anteriormente o design dessas matrizes de microeletrodos para gravar LFPs na direção lamelar e septotemporal no hipocampo¹². Um fio de espaçamento de 50 μm separou eletrodos adjacentes como quatro microeletrodos registrados ao longo da lamina hipocampal para evitar a contaminação cruzada do sinal. Embora não fossem gravações uniduárias, cada eletrodo representava um pequeno grupo de neurônios, como indicado pela variabilidade de uma forma de onda de pico em função da distância do corpo celular.

Durante a construção, a inserção dos fios de microeletrodo tálamo e nigral em tubos de vidro foi necessária para proporcionar estabilidade durante a cirurgia de implantação para atingir essas estruturas profundas. Havia oito microeletroletos bilaterais, quatro dos quais tinham tubos de vidro (2 VL e 2 SNR), que eram um limite antes de elevar a pressão intracraniana e aumentar a mortalidade. Geralmente, os tubos de vidro são necessários quando a profundidade de inserção desejada é de pelo menos 2 mm.

Além disso, foi necessário plástico de 0,5 mm de espessura, limitando a separação mínima de distância entre os eletrodos para 0,5 mm, mas outros plásticos poderiam ser usados. No presente caso, os plásticos foram colocados ao longo do eixo principal do fone de ouvido. Os plásticos também podem ser colocados em todo o eixo do fone de ouvido, onde vários eletrodos têm coordenadas anteriores (AP) anteriores idênticas, mas diferentes medial-lateral (ML). Este método oferece uma ampla gama de configurações possíveis para regiões cerebrais específicas.

O número de pinos em um fone de ouvido limita o número de microeletros. Um fone de ouvido contendo 12 pinos cobre completamente a extensão anterior-posterior de uma cabeça de rato adulto. Cada pino deve ser isolado dos outros pinos durante a solda. Um ohmímetro e 0,9% de água salina foram necessários para testar o isolamento elétrico para cada par de terminais de eletrodos. O fone de ouvido de 12 pinos limita a gravação a 10 regiões (2 são reservadas para o solo e referência).

Materials

Amplifier 16-Channel	A-M Systems	Model 3600	Amplifier
Cranioplasty cement	Coltene	Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade – Clear	Cement to hold microelectrodes
Cryostat Microtome	Precisionary	CF-6100	To slice brain
Diamel-coatednickel-chromium wire	Johnson Matthey Inc.	50 µm	Microelectrode wire
Dremel	Dremel	300 Series	To drill holes in mouse skull
Epoxy	CEC Corp	C-POXY 5	Fast setting adhesive
Hemostat	Any		To hold the headset
Forceps	Any		To hold microelectrodes
Light microscope	Nikon	SMZ-10	To see alignment
Ohmmeter	Any		To measurre resistance
Pins (Headers and matching Sockets)	Mill-Max	Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets	To attach microelectrodes to
Polymicro Tubing Kit	Neuralynx	ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm	Glass tubes
Pulse Stimulator	A-M Systems	Model 2100	To mark the microelectrode location at the end of the recordings
Scissors	Any		To cut microelectrodes
Superglue	Gorilla		Adhesive
Thick wire 0.008 in. – 0.011 in.	A-M Systems	791900	Tick wire to hold the microelectrode array
Thin wire 0.005 in. – 0.008 in.	A-M Systems	791400	Thin wire for reference and ground