Construção de microeletrodos potenciais de campo local para gravações in vivo de múltiplas estruturas cerebrais simultaneamente
14 de março de 2022
O presente protocolo descreve a construção de matrizes de microeletrodos personalizadas para registrar potenciais de campo locais in vivo a partir de múltiplas estruturas cerebrais simultaneamente.
Os pesquisadores muitas vezes precisam registrar potenciais de campo locais a partir de múltiplas estruturas ao mesmo tempo. Nosso design fácil de microeletrodes nos permite gravar LFPs de várias estruturas cerebrais em diferentes profundidades simultaneamente. Microeletros disponíveis comercialmente muitas vezes carecem de flexibilidade e não permitem gravar a partir de múltiplas estruturas cerebrais.
Nosso projeto de microeletrodo permite modificar facilmente a construção para se adequar a qualquer estrutura desejada. Comece tomando um fio de cromo de níquel revestido de dianal de 50 micrômetros de diâmetro. Grave uma extremidade do fio na parte de trás da plataforma e enrole o fio três vezes ao redor do botão mais próximo da plataforma.
Estique o fio ao redor do segundo botão mais distante para fazer dois loops entre os botões. Enrole o fio mais três vezes ao redor do primeiro botão para fixar o fio no lugar e tape a extremidade na parte de trás da plataforma. Coloque as barras de tensão sob os fios com a fita enrolada em volta delas.
Usando um microscópio e fórceps finos, faça uma diferença de três milímetros entre os fios para fazer microeletrodos corticais, ventral-laterais, de núcleo talâmico ou uma lacuna de 4,5 milímetros para fazer microeletrodos estriais-nidral. Se a ampliação for usada no microscópio, certifique-se de calcular e ajustar para a diferença na ampliação e a distância real entre os fios. Corte quatro pequenos pedaços de plástico de 0,5 milímetros de espessura aproximadamente seis milímetros de largura e três milímetros de altura.
Aplique cola no plástico. Coloque as peças de plástico aproximadamente um centímetro de distância do meio do fio, que está a um centímetro da barra de tensão. Remova o excesso de cola com um cotonete.
Depois que a cola secar, corte o fio usando uma tesoura fina. Corte quatro tubos de vidro de sete milímetros usando um kit comercialmente disponível e insira o fio de eletrodo nos tubos de vidro. Coloque a cola na base dos tubos de vidro para conectá-los ao plástico.
Espere até a cola ser, depois corte os tubos de vidro e os fios usando um bisturi. Use super cola para fixar plásticos na ordem desejada das regiões-alvo. Aplique resina epóxi ao redor do plástico para unir os eletrodos.
Pegue um fio grosso e faça um loop em uma extremidade, mergulhe o laço na solução epóxi e coloque-o sobre o plástico, garantindo que o fio grosso esteja deitado plano para que este fio possa ser usado como uma alça. Corte o fio para dois centímetros. Agrupar os fios e raspar um milímetro das extremidades isoladas com um bisturi.
Dobre os eletrodos corticais e separe os fios. Usando fórceps finos, faça um loop na extremidade de cada fio. Segure um fone de ouvido de 10 pinos com um hemosta e use a extremidade de madeira de um cotonete de algodão para aplicar quantidades mínimas de fluxo nos pinos.
Usando a extremidade de madeira do cotonete, aplique fluxo nas alças do fio. Soldar os laços de fio para o fone de ouvido de 10 pinos. Seque o fone de ouvido para evitar um curto-circuito entre os pinos.
Pegue um fio fino de cerca de 0,05 a 0,008 polegadas para referência e fios de terra e retire o plástico de uma extremidade. Faça um loop na outra extremidade do fio. Soldar o lado despojado da referência e fios de terra para seus respectivos pinos.
Segurando o fio grosso, aplique cimento cranioplastia ao redor dos microeletrous, especialmente quando os fios se conectam aos pinos. Evite tocar nas extremidades reais do eletrodo com o cimento. Depois que o cimento secar, coloque resina epóxi na base dos tubos de vidro, fios de microeletroderna escorestar, e ao redor de todo o eletrodo.
Evite tocar nas extremidades do eletrodo com resina epóxi. Gravações potenciais de campo locais foram realizadas a partir do córtex pré-motor direito, da VL esquerda, do estriato e do SNR. O início da convulsão foi identificado como uma deflexão do traço de tensão pelo menos o dobro da linha de base.
O gráfico do espectro de energia mostra a distribuição de frequência para as gravações potenciais locais gravadas. Latências de início de convulsão podem ser comparadas entre cada estrutura com precisão de milissegundo. Um pulso de corrente foi aplicado no final das gravações para marcar e confirmar a localização das pontas dos eletrodos formando a lesão.
Se os microeletrodos forem construídos para diferentes estruturas cerebrais, lembre-se de modificar as lacunas entre os fios de acordo com as coordenadas estereotáticas da estrutura desejada. Coloque os eletrodos da estrutura profunda nos tubos de vidro e ajuste os comprimentos dos microeletrodos. Em seguida, conecte os plásticos na ordem necessária.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para a construção de matrizes personalizadas de microeletrodos capazes de registrar potenciais de campo locais (LFPs) in vivo a partir de múltiplas estruturas cerebrais simultaneamente. A metodologia aumenta a flexibilidade em comparação com microeletrodos comercialmente disponíveis, permitindo gravações simultâneas em diferentes profundidades.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Eletrfisiologia
- Neurociência
- Neurofisiologia
Contexto
- A gravação de potenciais de campo locais de diversas estruturas cerebrais é fundamental na pesquisa em neurociência.
- Os microeletrodos existentes podem limitar as capacidades de gravação multiestrutura.
- O projeto visa superar essas limitações por meio de uma construção personalizável.
- Esta pesquisa concentra-se no aperfeiçoamento do design de eletrodos para coleta eficaz de dados.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema versátil de microeletrodos para gravações in vivo.
- Permitir gravações simultâneas de múltiplas regiões cerebrais.
- Fornecer uma configuração adaptável para estudos eletrofisiológicos.
Métodos Utilizados
- O método envolve a construção de microeletrodos a partir de fios de níquel-cromo com dimensões especificadas.
- Os arranjos-alvo são adaptados com base em coordenadas estereotáxicas.
- As instruções detalhadas incluem manipulação de fios, técnicas de colagem e soldagem aos conjuntos de cabeçote.
- Os eletrodos são projetados para diversas profundidades cerebrais, a fim de aprimorar as capacidades de registro.
- Os eletrodos são fixados usando cimento cranial e resina epóxi para garantir estabilidade.
Resultados Principais
- Os microeletrodos construídos registraram efetivamente potenciais de campo locais em múltiplas regiões cerebrais.
- O estudo demonstrou medição precisa de deflexão de voltagem indicando o início da crise epiléptica.
- Os resultados mostram o potencial para análise comparativa das latências de crise entre estruturas.
- A confirmação da localização do eletrodo por meio de um pulso de corrente marcado aumenta a precisão.
Conclusões
- Esta pesquisa estabelece um método para criar matrizes de microeletrodos personalizáveis para estudos in vivo.
- A construção flexível permite gravações direcionadas de várias regiões cerebrais, aumentando a riqueza dos dados.
- Os achados contribuem para uma melhor compreensão das atividades neuronais relacionadas a crises epilépticas e outros fenômenos neurofisiológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O registro simultâneo in vivo de potenciais de campo locais (LFPs) de múltiplas estruturas cerebrais é essencial para a desmistificação mecanicista e validação de alvos na descoberta de neurofármacos. Arrays personalizáveis de microeletrodos permitem a coleta precisa de dados eletrofisiológicos de múltiplas regiões, apoiando a confiança preditiva em decisões precoces do portfólio do SNC. Essa abordagem flexível supera as limitações dos arrays comerciais, aprimorando a continuidade translacional desde a descoberta até a pesquisa pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função de circuitos neuronais em múltiplas regiões cerebrais em tempo real.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao permitir a comparação direta de padrões de atividade durante eventos relevantes para a doença.
- Facilita a validação funcional de alvos ao correlacionar assinaturas de potenciais de campo locais com intervenções farmacológicas ou genéticas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Oferece uma plataforma para desenvolver e validar ensaios eletrofisiológicos com saídas quantitativas e resolução de milissegundos.
- Permite gravações reprodutíveis em múltiplos sítios para padronizar as condições do ensaio entre experimentos.
- Permite a triagem de compostos para avaliar efeitos regionais específicos sobre a atividade neural.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos com pontos finais de circuitos neurais relevantes para doenças humanas.
- Permite a descoberta e validação de biomarcadores entre estruturas para estudos translacionais.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados neurais robustos e comparativos em diferentes regiões cerebrais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método personalizável de microeletrodo integra desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica, permitindo testes de hipóteses e continuidade de dados de forma contínua.
- Biologia da Descoberta: Facilita o mapeamento orientado por hipóteses de circuitos neurais e a clarificação de vias.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de potenciais de campo locais para avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados de alta resolução de voltagem e frequência para comparação estatística entre condições e regiões.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao permitir o alinhamento de biomarcadores e a validação cruzada de espécies de desfechos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular e adaptável para diversos programas de pesquisa no sistema nervoso central.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho eletrofisiológicos.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao permitir a coleta robusta de dados de múltiplas regiões.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco dos ativos do sistema nervoso central.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica e montagem de microeletrodos.
- Necessita de acesso a ferramentas de precisão, microscópios e sistemas de gravação eletrofisiológica.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de construção e posicionamento de eletrodos.
- Adaptável a diversos modelos de roedores e regiões cerebrais mediante ajuste das coordenadas estereotáxicas e da configuração dos eletrodos.
- Limitações potenciais incluem variabilidade no posicionamento dos eletrodos e a necessidade de manipulação cuidadosa para manter a qualidade da gravação.
