Avaliação da oxidação de ácidos graxos em células ósseas cultivadas

Resumo

O presente protocolo descreve um ensaio para avaliar a capacidade de oxidação de ácidos graxos em culturas de células ósseas primárias ou linhagens celulares relevantes.

Resumo

Espera-se que a formação óssea por osteoblastos diferenciadores exija uma entrada energética significativa, pois essas células especializadas devem sintetizar grandes proteínas da matriz extracelular que compõem o tecido ósseo e, em seguida, concentrar os íons necessários para sua mineralização. Dados sobre os requisitos metabólicos da formação óssea estão surgindo rapidamente. Embora ainda haja muito a ser aprendido, espera-se que os distúrbios no metabolismo intermediário contribuam para a doença esquelética. Aqui, um protocolo é delineado para avaliar a capacidade das células osteoblásticas de oxidar ¹⁴ácidos graxos marcados com C em ¹⁴CO₂ e metabólitos solúveis em ácido. Os ácidos graxos representam uma reserva rica em energia que pode ser retirada da circulação após a alimentação ou após sua liberação dos estoques de tecido adiposo. O ensaio, realizado em frascos de cultura de tecidos T-25, é útil para o estudo do ganho ou perda de função do gene na utilização de ácidos graxos e o efeito de sinais anabólicos na forma de fatores de crescimento ou morfogênios necessários para a manutenção da massa óssea. Detalhes sobre a capacidade de adaptar o protocolo para avaliar a oxidação de glicose ou aminoácidos como a glutamina também são fornecidos.

Introdução

O osteoblasto, derivado de células progenitoras presentes na medula óssea e no periósteo, é responsável pela síntese e secreção da matriz mineralizada e rica em colágeno que compõe o tecido ósseo. Para cumprir esse esforço energeticamente caro e contribuir para a manutenção vitalícia da integridade esquelética, essas células especializadas mantêm um retículo endoplasmático rugoso abundante essencial para sintetizar proteínas da matriz extracelular ^1,2 e numerosas mitocôndrias de alto potencial de membrana para colher a energia química necessária de substratos de combustível

Protocolo

Este protocolo usa a conversão de ácido [^1-14C]-oleico em ¹⁴CO₂ como um indicador da capacidade de oxidação de ácidos graxos. O escritório local de Segurança de Radiação aprovou o protocolo para o uso de materiais radioativos antes de iniciar os experimentos. Todos os procedimentos de radiação foram realizados atrás de um escudo de plexiglass usando equipamento de proteção individual apropriado. O Comitê Local de Cuidados e Uso de Animais aprovou o protocolo antes do uso de células primárias.

1. Oxidação de ácidos graxos em osteoblastos cultivados

Resultados

A atividade enzimática da carnitina palmitoiltransferase-1 (Cpt1) e da carnitina palmitoiltransferase-2 (Cpt2) é necessária para a oxidação mitocondrial de ácidos graxos de cadeia longa. Cpt1 é a enzima limitante da taxa na via metabólica, mas três isoformas (Cpt-1a, Cpt-1b e Cpt-1c) são codificadas em genomas de mamíferos, e a interrupção genética de uma isoforma pode levar à regulação positiva de compensação de outra isoforma¹³. Em contraste, o Cpt2 é codificado por um único gene. No experimento.......

Discussão

O procedimento acima descrito permite a avaliação directa da oxidação dos ácidos gordos, uma vez que as saídas medidas são ¹⁴CO₂ recolhido no papel de filtro embebido em NaOH e metabolitos solúveis em ácido recolhidos após a acidificação da cultura com ácido perclórico. Kits de ensaio disponíveis comercialmente que usam moléculas lipídicas marcadas com fluorescência ou análogos lipídicos podem medir a absorção de lipídios, mas não determinam o catabolismo para a ger.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[1-14C]-Ácido oleico	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rolhas de manga de borracha	VWR	89097-542
Seringa de 1 mL	Agulha de precisão BD	309628
25 G (25 G x 1 1/2 pol)	BD precisão	305127
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A4403
BCA Kit de Ensaio de Proteína	Thermo Fisher	23225	Outros kits também são adequados
Contador de Cintilação Beckman, ou equivalente	Beckman Coulter	LS6000SC
Fosfato de beta-glicerol	Sigma Aldrich	G6626
Soro Bovino Albumina	Sigma Aldrich	126609
Carnitina	Sigma Aldrich	C0283
Tampão de lise celular	O protocolo é passível de tampões de lise típicos (ou seja, RIPA)
s Soro
	Disponível em várias fontes Tubos de
Ácido perclórico	Sigma Aldrich	50439
Poços centrais de polipropileno	VWR	72760-048
Hidróxido de sódio	Sigma Aldrich	S5881
T-25 frasco de cultura de tecidos de pescoço inclinado	Corning	430639
Incubadora
de tecidos Tripsina (0,25%) -EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (solução de cintilação)	PerkinElmer	6013329
Whatman Papel de cromatografia	Sigma Aldrich	WHA3030917

Pinça de dissecação Disponível em várias fontes Kit de quantificação de DNA Disponível em várias fontes Dulbecco ' Fetal Bovino Corning 20-030-CV com Tampão com Fosfatomicrocentrífuga, 1,5 mL Disponível em várias fontes Meio Essensial Mínimo, modificação Alfa Corning 10-022-CV Penicilina-Estreptomicina Gibco 15140122 de cultura