A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.
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Artigo de método
Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio
Neste artigo
Resumo
Resumo
O principal objetivo da terapia celular após o infarto do miocárdio (IM) é aumentar efetivamente a taxa de enxertos celulares, e os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) são uma fonte promissora de células para reparo cardíaco após dano isquêmico. No entanto, uma baixa taxa de enxertos é um obstáculo significativo para a regeneração efetiva do tecido cardíaco após o transplante. Esse protocolo mostra que múltiplas injeções percutâneas guiadas por ultrassom hiPSC-CM em uma área de IM efetivamente aumentam as taxas de transplante celular. O estudo também descreve todo o processo de cultura de hiPSC-CM, pré-tratamento e métodos de parto percutâneo guiados por ultrassom. Além disso, o uso de DNA mitocondrial humano ajuda a detectar a ausência de hiPSC-CMs em outros órgãos de camundongos. Finalmente, este trabalho descreve as alterações na função cardíaca, angiogênese, tamanho celular e apoptose na zona borda infartada em camundongos 4 semanas após a entrega celular. Pode-se concluir que a injeção percutânea do miocárdio ventricular esquerdo guiada por ecocardiografia é uma terapia celular factível, relativamente invasiva, satisfatória, repetível e eficaz.
Introdução
Quando ocorre IAM agudo, as células miocárdicas na área infartada morrem rapidamente devido à isquemia e hipóxia. Vários fatores inflamatórios são liberados após a morte e ruptura celular, enquanto as células inflamatórias infiltram o local do infarto para causar inflamação1. Significativamente, fibroblastos e colágeno, ambos sem contratilidade e condutividade elétrica, substituem as células miocárdicas no local infartado para formar tecido cicatricial. Devido à limitada capacidade de regeneração dos cardiomiócitos em mamíferos adultos, o tecido viável formado após uma grande área de infarto geralmente não é adequado para manter débito cardíaco....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética do Segundo Hospital Xiangya da Universidade Central Sul. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo. Os prazos para injeção celular, imagem e eutanásia são os seguintes: t0- induzir infarto, t1 semana- imagem e implante de células, t2 semanas- imagem e implante de células, t4 semanas- imagem final, eutanásia e coleta de tecido.
1. cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos e purificação celular
- Misturar DMEM/F12 e solução-....
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Resultados
O ecocardiograma para avaliação da função ventricular esquerda dos camundongos de cada grupo revelou que as lesões do IM foram efetivamente revertidas no grupo DM (Figura 2A). Em comparação com o grupo IM, o grupo SD apresentou aumento da fração de ejeção (FE) (de 30% para 35%; Figura 2B) e fração de encurtamento (EF) (de 18% para 22%; Figura 2C) após IM. No entanto, é ainda mais crucial notar que múltiplas injeções de hiPSC-CMs nos.......
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Discussão
As etapas críticas deste estudo incluem cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos, purificação de hiPSC-CM e transplante de hiPSC-CM no local do infarto do miocárdio de camundongos. A chave é usar o ultrassom cardíaco para guiar transcutaneamente o tratamento em direção ao local do infarto na borda do infarto, onde os MC-hiPSC foram injetados na área.
Com o prolongamento do tempo de cultura, o fenótipo hiPSC-CM muda na morfologia (maior tamanho celular), estrutura (músculo, densidade f.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Plano de Pesquisa Principal da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 91539111to JY), Projeto Chave de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (No. 2020SK53420 para JY) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (2021RC2106 para CF).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo | |||
| Troponina cardíaca T | Abcam | ab8295 | |
| Burro Anti-rato IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Burro Anti-Rato IgG H & L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Burro Anti-Coelho IgG H & L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Burro Anti-Coelho IgG H& L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Troponina cardíaca humana T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectina B4 | Vetor | FL-1201 | |
| Alfa actinina sarcomérica | Abcam | ab9465 | |
| Aglutinina de gérmen de trigo | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| < forte > reagente< / forte> | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| Suplemento B27 (menos insulina) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| Suplemento B27 (sem soro) | Thermo Fisher Scientific | 17 504-044 | |
| Solução de Bouin | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| ciclosporina A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| VERMELHO DIRETO | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Kit de Tecidos | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| RPMI 1640 sem glicose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| ácido lático | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Composto | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomiócito Meio de Congelamento/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomiócito Suporte Médio | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| agente de acoplamento de ultrassom | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipamentos e Suprimentos | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Criostato de PCR | |
| Leica | CM1950 | ||
| microscópio de fluorescência | Olympus | IX83 | |
| tesoura anatômica fina | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| pinça de dissecação fina | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro seringa | Hamilton | 7633 | |
| Pequeno animal aparelho de anestesia | MATRX | VMR | |
| Sistema de ultrassonografia para animais de ultra-alta resolução para pequenos animais | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Soluções estatísticas de produtos e serviços | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Mitocondrial humana Primers de DNA | |||
| a sequência de primer direto | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| a sequência de primer reverso | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
Referências
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al.
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Reimpressões e permissões
