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Artigo de método

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

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DOI:

10.3791/63647

30 de março de 2022

Neste artigo

Resumo

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Resumo

O principal objetivo da terapia celular após o infarto do miocárdio (IM) é aumentar efetivamente a taxa de enxertos celulares, e os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) são uma fonte promissora de células para reparo cardíaco após dano isquêmico. No entanto, uma baixa taxa de enxertos é um obstáculo significativo para a regeneração efetiva do tecido cardíaco após o transplante. Esse protocolo mostra que múltiplas injeções percutâneas guiadas por ultrassom hiPSC-CM em uma área de IM efetivamente aumentam as taxas de transplante celular. O estudo também descreve todo o processo de cultura de hiPSC-CM, pré-tratamento e métodos de parto percutâneo guiados por ultrassom. Além disso, o uso de DNA mitocondrial humano ajuda a detectar a ausência de hiPSC-CMs em outros órgãos de camundongos. Finalmente, este trabalho descreve as alterações na função cardíaca, angiogênese, tamanho celular e apoptose na zona borda infartada em camundongos 4 semanas após a entrega celular. Pode-se concluir que a injeção percutânea do miocárdio ventricular esquerdo guiada por ecocardiografia é uma terapia celular factível, relativamente invasiva, satisfatória, repetível e eficaz.

Introdução

Quando ocorre IAM agudo, as células miocárdicas na área infartada morrem rapidamente devido à isquemia e hipóxia. Vários fatores inflamatórios são liberados após a morte e ruptura celular, enquanto as células inflamatórias infiltram o local do infarto para causar inflamação1. Significativamente, fibroblastos e colágeno, ambos sem contratilidade e condutividade elétrica, substituem as células miocárdicas no local infartado para formar tecido cicatricial. Devido à limitada capacidade de regeneração dos cardiomiócitos em mamíferos adultos, o tecido viável formado após uma grande área de infarto geralmente não é adequado para manter débito cardíaco....

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Protocolo

Todos os experimentos com animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética do Segundo Hospital Xiangya da Universidade Central Sul. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo. Os prazos para injeção celular, imagem e eutanásia são os seguintes: t0- induzir infarto, t1 semana- imagem e implante de células, t2 semanas- imagem e implante de células, t4 semanas- imagem final, eutanásia e coleta de tecido.

1. cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos e purificação celular

  1. Misturar DMEM/F12 e solução-....

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Resultados

O ecocardiograma para avaliação da função ventricular esquerda dos camundongos de cada grupo revelou que as lesões do IM foram efetivamente revertidas no grupo DM (Figura 2A). Em comparação com o grupo IM, o grupo SD apresentou aumento da fração de ejeção (FE) (de 30% para 35%; Figura 2B) e fração de encurtamento (EF) (de 18% para 22%; Figura 2C) após IM. No entanto, é ainda mais crucial notar que múltiplas injeções de hiPSC-CMs nos.......

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Discussão

As etapas críticas deste estudo incluem cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos, purificação de hiPSC-CM e transplante de hiPSC-CM no local do infarto do miocárdio de camundongos. A chave é usar o ultrassom cardíaco para guiar transcutaneamente o tratamento em direção ao local do infarto na borda do infarto, onde os MC-hiPSC foram injetados na área.

Com o prolongamento do tempo de cultura, o fenótipo hiPSC-CM muda na morfologia (maior tamanho celular), estrutura (músculo, densidade f.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Plano de Pesquisa Principal da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 91539111to JY), Projeto Chave de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (No. 2020SK53420 para JY) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (2021RC2106 para CF).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo
Troponina cardíaca TAbcamab8295
Burro Anti-rato IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150105
Burro Anti-Rato IgG H & L (Alexa Fluor 555)Abcamab150110
Burro Anti-Coelho IgG H & L (Alexa Fluor 488)Abcamab150073
Burro Anti-Coelho IgG H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150062
Troponina cardíaca humana TAbcamab91605
Isolectina B4VetorFL-1201
Alfa actinina sarcoméricaAbcamab9465
Aglutinina de gérmen de trigoThermo Fisher ScientificW11261
< forte > reagente< / forte>
AccutaseThermo Fisher Scientific00-4555-56
Suplemento B27 (menos insulina)Thermo Fisher ScientificA1895601
Suplemento B27 (sem soro)Thermo Fisher Scientific17 504-044
Solução de BouinThermo Fisher ScientificSDHT10132
CHIR99021SelleckCT99021
ciclosporina AMedchemexpressHY-B0579
VERMELHO DIRETOSigma-Aldrich365548-25G
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320033
DNeasy Blood & Kit de TecidosQiagen69504
FAST GREEN FCFSigma-Aldrich  F7252-5G
RPMI 1640 sem glicoseThermo Fisher Scientific11879020
IWR1SelleckS7086
ácido láticoSigma-AldrichL6661
MatrigelBD BiosciencesBD356234
mTeSR1Stem Cell Technologies72562
O.C.T. CompostoSAKURA4583
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
PowerUP SYBR Green MasterMix kitThermo Fisher ScientificA25742
RPMI1640Thermo Fisher Scientific11875119
STEMdif Cardiomiócito Meio de Congelamento/STEMdiffStem Cell Technologies5030
STEMdiff Cardiomiócito Suporte MédioStem Cell Technologies5027
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
agente de acoplamento de ultrassomCARENT22396269389
Y-27632SelleckS6390
Equipamentos e Suprimentos
Applied BiosystemsThermo Fisher Scientific7500 Criostato de PCR
LeicaCM1950
microscópio de fluorescênciaOlympusIX83
tesoura anatômica finaFine Science Tools15000-08
pinça de dissecação finaFine Science Tools11255-20
Micro seringaHamilton7633
Pequeno animal aparelho de anestesiaMATRXVMR
Sistema de ultrassonografia para animais de ultra-alta resolução para pequenos animaisVisualSonicsVevo 2100
Software
Soluções estatísticas de produtos e serviçosIBM21
Image JNIH1.48
Mitocondrial humana Primers de DNA
a sequência de primer diretoCCGCTACCATAATCATCGCTAT
a sequência de primer reversoTGCTAATACAATGCCAGTCAGG
em tempo real

Referências

  1. Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
  2. Lázár, E., et al.

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Células Tronco Pluripotentes InduzidasInfarto do MiocárdioOrientação por UltrassomInjeção PercutâneaReparo CardíacoTransplante CelularEntrega Guiada por EcocardiografiaDNA Mitocondrial HumanoAvaliação de Angiogênese