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Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

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DOI:

10.3791/63664

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28 de abril de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Neste artigo

Resumo

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Resumo

O espalhamento de nêutrons oferece a possibilidade de sondar a dinâmica dentro das amostras para uma ampla gama de energias de forma não destrutiva e sem marcação além do deutério. Em particular, a espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons registra os sinais de espalhamento em vários ângulos de espalhamento simultaneamente e é adequada para estudar a dinâmica de sistemas biológicos na escala de tempo ps-ns. Ao empregar D2O - e possivelmente componentes tampão deuterizados - o método permite monitorar tanto a difusão do centro de massa quanto os movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral (dinâmica interna) de proteínas em estado líquido.

Adicionalmente, a dinâmica da água de hidratação pode ser estudada empregando-se pós de proteínas perdeuteradas hidratadas com H2O. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho empregado no instrumento IN16B no Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar a dinâmica da água e proteína de hidratação. A preparação de amostras de solução e amostras de proteína hidratada em pó usando troca de vapor é explicada. O procedimento de análise de dados para a dinâmica da proteína e da água de hidratação é descrito para diferentes tipos de conjuntos de dados (espectros quasielásticos ou varreduras de janela fixa) que podem ser obtidos em um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons.

O método é ilustrado com dois estudos envolvendo proteínas amiloides. A agregação da lisozima em agregados esféricos de tamanho μm - partículas denotadas - é mostrada para ocorrer em um processo de uma etapa no espaço e intervalo de tempo sondados em IN16B, enquanto a dinâmica interna permanece inalterada. Posteriormente, a dinâmica da água de hidratação da tau foi estudada em pós hidratados de proteína perdeuterada. Mostra-se que os movimentos de translação da água são ativados na formação de fibras amiloides. Finalmente, etapas críticas no protocolo são discutidas quanto ao posicionamento do espalhamento de nêutrons em relação ao estudo da dinâmica em relação a outros métodos biofísicos experimentais.

Introdução

O nêutron é uma partícula massiva e sem carga que tem sido usada com sucesso ao longo dos anos para sondar amostras em vários campos, da física fundamental à biologia1. Para aplicações biológicas, o espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, o espalhamento inelástico de nêutrons, a cristalografia e a reflectometria de nêutronssão extensivamente utilizados 2,3,4. O espalhamento inelástico de nêutrons fornece uma medida média da dinâmica sem a necessidade de marcação específica per se, e uma qualidade de sinal que não depende do tamanho ou da proteína5. A medida pode ser feita utilizando um ambiente de alta complexidade para a proteína em estudo que mimetiza o meio intracelular, como um lisado bacteriano deuterado ou mesmo invivo3,6,7. Diferentes configurações experimentais podem ser usadas para estudar a dinâmica, a saber: i) tempo de voo dando acesso à dinâmica sub-ps-ps, ii) retroespalhamento-dando acesso à dinâmica ps-ns, e iii) spin-eco-dando acesso à dinâmica de ns a centenas de ns. O retroespalhamento de nêutrons faz uso da lei de Bragg 2d sinθ = nλ, onde d é a distância entre planos em um cristal, θ o ângulo de espalhamento, n a ordem de espalhamento e λ o comprimento de onda. O uso de cristais para retroespalhamento em direção aos detectores permite alcançar uma alta resolução de energia, tipicamente ~0,8 μeV. Para medir a troca de energia, um drive Doppler carregando um cristal em retroespalhamento é usado para definir e sintonizar o comprimento de onda de nêutrons de entrada 8,9,10 (Figura 1), ou uma configuração de tempo de voo pode ser usada ao custo de uma diminuição na resolução de energia 11.

figure-introduction-1
Figura 1: Esboço de um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons com acionamento Doppler. O feixe de entrada atinge o chopper42 de transformação do espaço de fase (PST), o que aumenta o fluxo na posição da amostra. Em seguida, ele é retroespalhado em direção à amostra pelo drive Doppler, que seleciona uma energia E1 (seta ciano). Os nêutrons são então espalhados pela amostra (com diferentes energias representadas pela cor das setas) e os analisadores, feitos de cristais de Si 111, só retroespalharão nêutrons com uma energia específica E0 (setas de cor vermelha aqui). Assim, a transferência de momento q é obtida a partir da posição detectada do nêutron no arranjo do detector, e a transferência de energia é obtida a partir da diferença E1- E0. O tempo de voo esperado para o pulso de nêutrons produzido pelo PST é usado para descartar o sinal dos nêutrons espalhados diretamente em direção aos tubos do detector. Abreviação: PST = transformação do espaço de fase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para a espectroscopia de retroespalhamento, a principal contribuição para o sinal de amostras ricas em prótons de hidrogênio, como proteínas, vem do espalhamento incoerente, para o qual a intensidade de espalhamento Sinc(q, ω) é mostrada por Eq (1)12

figure-introduction-2 (1º)

Onde σinc é a seção transversal incoerente do elemento considerado, k' é a norma do vetor de onda disperso, k a norma do vetor de onda de entrada, q (= k - k') a transferência de momento, r j(t) o vetor de posição do átomo j no tempo t, e ω a frequência correspondente à transferência de energia entre o nêutron de entrada e o sistema. Os colchetes angulares denotam a média do conjunto. Assim, o espalhamento incoerente sonda a autocorrelação de partícula única média do conjunto das posições dos átomos com o tempo e fornece a autodinâmica média sobre todos os átomos no sistema e diferentes origens de tempo (média do conjunto). A função de espalhamento é a transformada de Fourier no tempo da função de espalhamento intermediário I(q, t), que pode ser vista como a transformada de Fourier no espaço da função de correlação de van Hove mostrada por Eq (2):

figure-introduction-3 (2º)

Onde ρ(r,t) é a densidade de probabilidade de encontrar um átomo na posição r e no tempo t 13.

Para um processo de difusão fickiano, a função de autodifusão resulta (ver Eq (3)) após uma transformada dupla de Fourier em uma função de espalhamento consistindo em um Lorentziano de largura de linha dado por γ = Dq2.

figure-introduction-4 (3º)

Modelos mais sofisticados foram desenvolvidos e considerados úteis, como o modelo de difusão por salto de Singwi e Sjölander para dinâmica interna de proteínas ps-ns14 ou o modelo de rotação por Sears para água de hidratação15,16,17.

No instrumento de retroespalhamento de nêutrons (NBS) IN16B 8,9 no ILL, Grenoble, França (Figura Suplementar S1), uma configuração comumente usada com proteínas consiste em cristais de Si 111 para os analisadores com um drive Doppler para sintonizar o comprimento de onda de entrada (Figura Suplementar S2A), dando acesso à faixa de transferência de momento ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 e faixa de transferência de energia de -30 μeV < figure-introduction-5 < 30 μeV-correspondente a escalas de tempo que variam de alguns ps a alguns ns e distâncias de alguns Å. Além disso, o IN16B oferece a possibilidade de realizar varreduras de janela fixa elástica e inelástica (E/IFWS)10, que incluem a aquisição de dados em uma transferência de energia fixa. Como o fluxo é limitado quando se trabalha com nêutrons, o E/IFWS permite maximizar o fluxo para uma transferência de energia, reduzindo assim o tempo de aquisição necessário para obter uma relação sinal-ruído satisfatória. Uma opção mais recente é o modo11 do espectrômetro de retroespalhamento e tempo de voo (BATS), que permite a medição de uma ampla faixa de transferências de energia (por exemplo, -150 μeV < < figure-introduction-6 150 μeV), com um fluxo maior do que com o acionamento Doppler, mas ao custo de uma resolução de energia menor (Figura Suplementar S2B).

Uma propriedade importante do espalhamento de nêutrons é que a seção transversal incoerente σinc tem um valor 40 vezes maior para o hidrogênio do que para o deutério e é insignificante para outros elementos comumente encontrados em amostras biológicas. Portanto, a dinâmica de proteínas em ambiente líquido pode ser estudada usando um tampão deuterado, e o estado de pó permite o estudo da dinâmica interna de proteínas com proteína hidrogenada em pó hidratadacom D 2 O, ou o estudo de água de hidratação para proteína perdeuterada em pó hidratada com H2O. No estado líquido, o retroespalhamento de nêutrons normalmente permite o acesso simultâneo do centro de massa de autodifusão de proteínas (difusão tipo fickiano) e sua dinâmica interna. Estes últimos são movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral usualmente descritos pelo chamado modelo de salto-difusãoou outros3,18. Em pós de proteína hidrogenada, a difusão da proteína está ausente e apenas a dinâmica interna precisa ser modelada. Para a água de hidratação, as contribuições dos movimentos de translação e rotação das moléculas de água apresentam uma dependência diferente da transferência de momento q, o que permite sua distinção no processo de análise dos dados17.

Este trabalho ilustra o método de retroespalhamento de nêutrons com o estudo de proteínas que se mostraram capazes de se desdobrar, agregar em uma forma canônica composta por pilhas de fitas de β - o chamado padrão de β cruzada19,20 - e formar fibras alongadas. Trata-se da chamada agregação amiloide, que é extensivamente estudada devido ao seu papel central em doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer ouParkinson21,22. O estudo das proteínas amiloides também é motivado pelo papel funcional que elas podem desempenhar23,24 ou seu alto potencial para o desenvolvimento de novosbiomateriais25. Os determinantes físico-químicos da agregação amiloide permanecem obscuros, e nenhuma teoria geral da agregação amiloide está disponível, apesar do enorme progresso nos últimosanos21,26.

A agregação amiloide implica mudanças na estrutura e estabilidade de proteínas com o tempo, cujo estudo implica naturalmente dinâmica, ligada à estabilidade da conformação proteica, função proteica e paisagem energética proteica27. A dinâmica está diretamente ligada à estabilidade de um estado específico através da contribuição entrópica para os movimentos mais rápidos28, e a função da proteína pode ser sustentada por movimentos em várias escalas de tempo, desde sub-ps para proteínas sensíveis à luz29 até ms para movimentos de domínio, o que pode ser facilitado pela dinâmica picossegundo-nanossegundo30.

Dois exemplos de uso de espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons para estudar proteínas amiloides serão apresentados, um no estado líquido para estudar a dinâmica de proteínas e outro no estado pó hidratado para estudar a dinâmica da água de hidratação. O primeiro exemplo diz respeito à agregação de lisozima em esferas de tamanho μm (chamadas partículas) seguidas em tempo real5, e o segundo uma comparação da dinâmica da água em estados nativos e agregados da proteína humana tau31.

A lisozima é uma enzima envolvida na defesa imunológica e é composta por 129 resíduos de aminoácidos. A lisozima pode formar partículas em tampão deuterado a pD de 10,5 e a uma temperatura de 90 °C. Com o espalhamento de nêutrons, mostramos que a evolução temporal do coeficiente de difusão do centro de massa da lisozima segue a cinética exponencial única da fluorescência da tioflavina T (uma sonda fluorescente usada para monitorar a formação de padrões de β cruzada amiloide32), indicando que a formação de superestruturas particuladas e padrões de β cruzada ocorrem em uma única etapa com a mesma taxa. Além disso, a dinâmica interna permaneceu constante durante todo o processo de agregação, o que pode ser explicado por uma rápida mudança conformacional que não pode ser observada nos instrumentos NBS, ou pela ausência de mudança significativa na energia interna da proteína na agregação.

A proteína humana tau é uma proteína intrinsecamente desordenada (IDP) constituída por 441 aminoácidos para a chamada isoforma 2N4R, que está notavelmente envolvida na doença de Alzheimer33. Usando retroespalhamento de nêutrons em pós de proteína perdeuterada tau, mostramos que a dinâmica da água de hidratação está aumentada no estado de fibra, com uma maior população de moléculas de água sofrendo movimentos de translação. O resultado sugere que um aumento na entropia da água de hidratação pode conduzir a fibrilação amiloide da tau.

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Protocolo

1. Preparar o tampão deuterado para proteínas no estado líquido

  1. Dissolva todos os componentes do tampão em D2O puro.
  2. Se o eletrodo de pH foi calibrado em H2O, ajustar o pD de acordo com a fórmula pD = pH + 0,4 usando NaOD ou DCl34.
    NOTA: A utilização de D2 O em vez de H2O pode afectar a solubilidade das proteínas e as condições de tampão poderão ter de ser adaptadas (por exemplo, por uma ligeira alteração na concentração de sal).

2. Preparar os pós H2O-hidratados de proteína perdeuterizada

  1. Prepare o porta-amostras.
    1. Limpe cuidadosamente um suporte plano de amostra de alumínio com sua vedação de fio de índio e parafusos com água e etanol e deixe secar.
      NOTA: Um suporte de amostra plano é usado de tal forma que o pó pode ser distribuído homogeneamente sobre a superfície. A quantidade de pó deve ser suficiente para que possa ser mantida entre as paredes e não caia quando o porta-amostras é colocado verticalmente.
    2. Pese as diferentes partes do suporte da amostra - fundo, tampa e fio de índio - separadamente em uma balança de precisão.
    3. Coloque o selo de fio de índio de 1 mm no sulco da parte inferior do porta-amostras, deixando uma pequena sobreposição onde as duas extremidades se unem (Figura 2A).
    4. Coloque uma quantidade adequada de proteína liofilizada (normalmente ~100 mg de proteína) de modo a preencher a superfície interior da parte inferior do porta-amostras.
  2. Hidrate a proteína em pó.
    1. Colocar o porta-amostras num exsicador com uma placa de Petri contendo pó de P2O5 durante 24 h para secar completamente o pó proteico35 (figura 2B). Pesar a parte do fundo seco do porta-amostras que contém o selo de índio e o pó seco para obter mseco.
      CUIDADO: P2O5 pó é muito corrosivo.
    2. Retire o P 2 O5 do exsicador e coloque uma placa de Petri com D2O dentro. Controle a massa do pó regularmente para verificar o nível de hidratação h = m hyd / m seco onde mhyd e m seco são a massa do pó hidratado e pó seco, respectivamente.
      NOTA: Para proteínas altamente hidrofóbicas, como a insulina, pode ser necessário aumentar a temperatura dentro do exsicador para obter uma pressão de vapor mais alta e atingir o nível de hidratação desejado h.
    3. Repetir os passos 2.2.1 e 2.2.2 pelo menos três vezes para converter correctamente todos os hidrogénios permutáveis em deuterons.
      NOTA: Alternativamente, ciclos de liofilização e dissolução em D2O puro podem ser utilizados para uma melhor troca H/D, desde que a proteína não seja afectada por ela.
    4. Hidrate o pó até um pouco acima do nível desejado, deixe a parte inferior do porta-amostras com o fio de índio e o pó hidratado permanecer na balança de precisão e espere que a massa diminua lentamente até o valor desejado para obter o h alvo (tipicamente 0,2-0,4 se uma proteína globular de tamanho médio for coberta por uma camada de hidratação completa).
    5. Coloque rapidamente a tampa na parte inferior e feche primeiro o porta-amostras com quatro parafusos para interromper a troca de vapor (Figura Suplementar S3A).
    6. Coloque e aperte todos os parafusos restantes até que não seja visível nenhum espaço entre a parte inferior e a tampa (Figura Suplementar S3B).
    7. Pesar o porta-amostras selado para verificar se existe qualquer potencial perda de hidratação devido a fugas após a experiência com neutrões.

3. Realizar o experimento de espalhamento de nêutrons incoerente

  1. Discutir e verificar novamente a configuração do instrumento necessário para o experimento com o contato local algumas semanas antes do tempo de feixe designado.
  2. Prepare a amostra no estado líquido.
    1. Dissolva a proteína no tampão deuterado.
    2. Determinar o volume adequado de líquido a colocar no porta-amostras utilizando água (certifique-se de que não há transbordamento quando o porta-amostras estiver fechado; Figura 2C).
      NOTA: As etapas a seguir (3.3 e 3.4) descrevem um experimento realizado com o espectrômetro NBS IN16B no ILL8,9, usando um crioforno como ambiente de amostra. O sistema de controlo de instrumentos mudará de um instrumento para outro, mas os princípios de funcionamento permanecem os mesmos.
  3. Insira o exemplo.
    1. Secar completamente o bastão da amostra (Figura 2D) e remover a amostra anterior, se houver, depois de verificar se a dose de radiação ionizante é inferior a 100 μSv/h antes de manusear qualquer material (no ILL).
    2. Colocar a amostra, verificar se há centralização adequada em relação ao centro do feixe (Figura Suplementar S4) e inserir o bastão da amostra no crioforno (Figura 2D). Ligue a bomba de vácuo para atingir menos de 10-3 bar e lave o ar dentro do crioforno repetindo as três vezes a seguir: encha o crioforno com gás hélio até que a pressão atmosférica seja atingida e remova o gás novamente usando a bomba de vácuo.
      NOTA: No caso de um porta-amostras plano, o porta-amostras deve ser orientado num ângulo de 45° em relação ao feixe de entrada. A faixa de transferência de momento útil pode ser reduzida devido à absorção e espalhamento pela célula. Um absorvedor de nêutrons forte, como o cádmio, pode ser usado para mascarar certas partes do suporte da amostra (por exemplo, parafusos, partes grossas).
    3. Introduza um pouco de gás hélio no crioforno de tal forma que a pressão seja de ~0,05 bar.
  4. Adquira dados (por exemplo, usando NOMAD em IN16B no ILL, supõe-se que o usuário prefere uma temperatura de 200 K antes de adquirir um espectro de nêutrons quasielástico (QENS), depois E/IFWS durante uma rampa de temperatura para 310 K a 0,5 K por minuto e, finalmente, um QENS a 310 K).
    1. Usando NOMAD, na guia de execução, arraste e solte um controlador FurnaceCryostat na Plataforma de Inicialização. Ajuste a temperatura para 200 K. Use o modo rápido e um tempo limite de 30 minutos para que a temperatura tenha tempo para estabilizar. Clique no ícone de setas giratórias para executá-lo em segundo plano para que os dados possam ser adquiridos durante a diminuição da temperatura.
    2. Arraste e solte o controlador IN16DopplerSettings , defina o perfil de velocidade como Velocidade precisa definida por Max ΔE, um valor de 0,00 μeV e 128 canais para obter uma configuração EFWS.
    3. Arraste e solte um controlador de Contagem , preencha o campo Legenda com um nome que permita fácil identificação dos dados e defina 60 repetições de varreduras de 30 s (Figura Suplementar S5A).
    4. Arraste e solte um controlador IN16DopplerSettings , defina o perfil de velocidade como Sine definido por Velocidade com um valor de 4,5 m/s e 2.048 canais para obter uma configuração QENS.
    5. Arraste e solte um controlador de contagem com 4 repetições de varreduras de 30 min (Figura suplementar S5B).
    6. Para a rampa de temperatura, arraste e solte um controlador FurnaceCryostat , ajuste a temperatura para 310 K, ajuste a rampa para SetPoint com Δ = 0,05 K e 6 s. Use um tempo limite de 220 min (Figura suplementar S6A).
    7. Use um loop for com 65 repetições. No interior, insira um controlador IN16DopplerSettings como na etapa 3.4.2, seguido por uma contagem única de 30 s. Posteriormente, insira IN16DopplerSettings, conforme descrito anteriormente, mas usando um deslocamento de energia de 1,5 μeV e 1.024 canais seguido por uma contagem única de 3 min (Figura Suplementar S6B).
    8. Para adquirir o último QENS em 310 K, arraste e solte os controladores IN16DopplerSettings e Count configurados conforme descrito nas etapas 3.4.4 e 3.4.5, respectivamente.
    9. Pressione o botão Iniciar (triângulo retângulo na parte inferior da janela) para executar o script.
      OBS: Todo experimento exigirá a aquisição de dados de calibração; isto é, a célula vazia para correções de subtração ou absorção, o tampão sozinho nas diferentes temperaturas usadas para modelar o fundo, e uma medição de vanádio (ou equivalentemente, a amostra a uma temperatura de 10 K ou inferior) para obter a função de resolução do instrumento.

4. Análise dos dados - QENS

  1. Importe o conjunto de dados usando o método 'IN16B_QENS.process()' no software Python nPDyn v3.x36
    >>>> de nPDyn.dataParsers importar IN16B_QENS

    >>> amostra = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... formato>]
    ... ). processo()

    >>> amostra = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Execute correções de dados (opcional) com os seguintes comandos (consulte a documentação do nPDyn para obter mais informações, Figura 3):
    #it é assumido que os dados para célula vazia, vanádio e buffer
    # foram importados já no conjunto de dados chamado 'empty_cell', 'vanádio',
    # e 'buffer', respectivamente.

    # para subtração de célula vazia com um fator de escala
    # (os erros são propagados automaticamente)
    >>> amostra = amostra - 0,95 * empty_cell

    # para correção usando o coeficiente de Paalman-Ping
    # (mutuamente exclusivo com o exemplo acima)
    >>> amostra = amostra.absorçãoCorrection(empty_cell)

    # para normalização
    >>> amostra = sample.normalize(vanádio)

    # para binning ao longo do eixo observável
    # observável é o tempo de agregação aqui
    >>> amostra = amostra.bin(3, eixo=0)
  3. Ajuste os dados de calibração. O conjunto de dados - amostras, célula vazia, buffer deuterado (se necessário) e vanádio - pode ser ajustado usando modelos internos ou um modelo definido pelo usuário (consulte a documentação do nPDyn):
    >>> da importação nPDyn.models.builtins (
    ... modeloPVoigt,
    ... modeloÁgua,
    ... modelCalibratedD2O,
    ...     )

    # Os modelos incorporados usam um vetor de coluna do momento
    # transferir valores q
    >>> q = vanádio.q[:, Nenhum]

    # o vanádio é ajustado usando um perfil pseudo-Voigt
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Use o modelo embutido para água de hidratação chamado 'modelWater'. Este modelo lê-se como mostra a Eq (4)17
    figure-protocol-1 (4º)
    Onde a0, ar e at são escalares que representam a contribuição relativa do sinal elástico, movimentos rotacionais e movimentos de translação, respectivamente; j1(qd) é a função esférica de Bessel del ésima ordem, com q sendo a transferência de momento; d a distância O-H na molécula de água; δ(ω) é o delta de Dirac, que é multiplicado pelo EISF aqui; N é a ordem mais alta da função esférica de Bessel usada (tipicamente ~5); figure-protocol-2 e são os movimentos rotacionais e figure-protocol-3 translacionais de Lorentziano, respectivamente; b(q) é um termo de fundo plano. As funções esféricas de Bessel dão a contribuição relativa de cada estado de momento angular das moléculas de água, e o número N é determinado com base na faixa q de transferência de momento. No caso de um espectrômetro NBS típico, os termos até N = 4 explicam quase inteiramente o sinal (Figura Suplementar S7).
    # Aqui, a equação 2 é usada para água de hidratação
    # convolução com função de resolução e adição de
    # O fundo D2O é feito automaticamente com o
    # argumentos fornecidos
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanádio,
    ... bkgd=tampão,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    NOTA: As contribuições dos movimentos rotacionais e translacionais devem ser complicadas para serem perfeitamente rigorosas. O sucesso de um modelo aditivo deve ser atribuído à presença de populações distintas de água na superfície da proteína e à limitada faixa de energia acessível.
  5. Use o seguinte para plotar os dados (Figura 4):
    >>> do gráfico de importação nPDyn.plot
    >>> parcela(amostra)

5. Análise de dados - rampa de temperatura, varreduras elásticas de janela fixa (EFWS)

  1. Use um procedimento semelhante ao da seção 4 para normalizar os dados da rampa de temperatura pelo sinal na temperatura mais baixa (normalmente 10 K):
    >>> de nPDyn.dataParsers importar IN16B_FWS

    >>> amostra = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). processo()

    # normalização com os 5 primeiros pontos no observável
    # eixo, que correspondem à temperatura
    >>> amostra /= amostra[:5].média(0)

    # O intervalo Momentum Transfer Q usado aqui é menor
    # como o modelo utilizado é válido apenas para baixo q
    >>> amostra = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Use um modelo gaussiano simples para começar, cuja largura é dada pelo chamado deslocamento quadrático médio (MSD). Crie e ajuste o modelo usando os seguintes comandos:
    >>> Importar numpy como NP
    >>> de nPDyn.models importar Parâmetros, Modelo, Componente

    # a é um fator de escala
    >>> params = Parâmetros(
    ... a={'valor': 1, 'limites': (0, np.inf)},
    ... msd={'valor': 1, 'limites': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> modelo = Modelo (params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... «Gaussiano»,
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Nenhum])

    >>> parcela(amostra)
    NOTA: A aproximação gaussiana sempre vale para q2MSD << 1, mas uma faixa de transferência de momento mais ampla pode ser usada para comparação relativa entre amostras. Modelos mais sofisticados, que vão além da aproximação gaussiana, têm sido desenvolvidos37,38,39.

6. Análise dos dados - varreduras de janela fixa elástica e inelástica (E/IFWS)

  1. Semelhante à etapa 4, importe o conjunto de dados, mas usando a classe 'IN16B_FWS':
    >>> de nPDyn.dataParsers importar IN16B_FWS

    >>> amostra = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). processo()

    >>> amostra = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Ajuste os dados de calibração e os dados de amostra.
    1. Analise os dados E/IFWS usando um MSD40 generalizado ou considerando-os como espectros QENS grosseiros (tendo apenas alguns pontos de dados no eixo de energia). Quando E/IFWS é visto como QENS-grosso, os modelos usados para QENS são usados para ajustar todo o conjunto de dados E/IFWS de uma só vez (ajuste global de transferências de energia e transferências de momento).
      NOTA: A última solução - usando modelos para QENS em dados E/IFWS - é usada aqui onde a dependência de transferência de momento da difusão do centro de massa e da dinâmica interna da proteína são impostas.
    2. Modele a dinâmica de proteínas em líquidos usando a seguinte Eq (5) ('modelProteinJumpDiff' em nPDyn):
      figure-protocol-4 (5º)
      Onde R(q,ω) é a função de resolução; β um escalar independente para cada transferência de momento q; a0 é o fator de estrutura incoerente elástica (EISF); figure-protocol-5 uma explicação lorentziana para o centro de difusão de massa com uma largura dada por Eq (6); figure-protocol-6 é um Lorentziano que inclui o centro de difusão de massa e uma contribuição seguindo o modelo de salto-difusão14 levando em conta a dinâmica interna (Eq (7); figure-protocol-7 sendo o sinal ajustado de D2O redimensionado por sua fração volumétrica na amostra.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds sendo o coeficiente de autodifusão.
      figure-protocol-8 (7º)
      Di sendo o coeficiente de difusão aparente para a dinâmica interna e τ um tempo de relaxamento para movimentos difusivos.
      >>> da importação nPDyn.models.builtins (
      ... modeloPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modelCalibratedD2O,
      ... )

      # Os modelos incorporados usam um vetor de coluna do momento
      # transferir valores q
      >>> q = vanádio.q[:, Nenhum]

      # o vanádio é ajustado usando um perfil pseudo-Voigt
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # para D2O puro, um modelo com largura de linha calibrada
      # para diferentes temperaturas está incluído no nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Aqui, a equação 3 é usada para amostras líquidas
      # convolução com função de resolução e adição de
      # O plano de fundo do D2O é feito automaticamente com os argumentos # fornecidos
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanádio,
      ... bkgd=tampão,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Plote os dados ajustados usando:
    >>> do gráfico de importação nPDyn.plot
    >>> parcela(amostra)

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Resultados

A agregação da lisozima em partículas foi realizada a 90 °C com concentração proteica de 50 mg/mL em tampão deuterado (NaCl 0,1 M a pD 10,5). A formação de particulados é desencadeada pelo aumento da temperatura para 90 °C e ocorre dentro de 6 h (Figura Suplementar S8). A aquisição de dados foi realizada no IN16B, conforme descrito no protocolo acima (os dados são permanentemente curados pelo ILL e acessíveis em http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Um espectro QENS fo...

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Discussão

A espectroscopia de nêutrons é o único método que permite sondar a dinâmica ps-ns média do conjunto de amostras de proteínas, independentemente do tamanho da proteína ou da complexidade da solução quando a deuteração é usada6. Especificamente, investigando a autodifusão de conjuntos de proteínas em solução, o tamanho hidrodinâmico de tais montagens pode ser determinado de forma inequívoca. No entanto, o método é comumente limitado pelo baixo fluxo de nêutrons, o que implica longos tempos de aquisi...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Os autores são gratos a Michaela Zamponi, do Jülich Centre for Neutron Science no Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemanha, por parte dos experimentos de espalhamento de nêutrons realizados no instrumento SPHERES. Este trabalho beneficiou das actividades do consórcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado pela União Europeia ao abrigo dos contratos HPRI-2001-50065 e RII3-CT-2003-505925, e da actividade financiada pelo UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) no âmbito do Institut Laue Langevin EMBL DLAB ao abrigo das subvenções GR/R99393/01 e EP/C015452/1. É reconhecido o apoio da Comissão Europeia no âmbito do 7.º Programa-Quadro através da Acção-chave: Reforçar o Espaço Europeu da Investigação, as infraestruturas de investigação [Contrato 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot e Christian Beck agradecem ao Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF, bolsa número 05K19VTB) pelo financiamento de suas bolsas de pós-doutorado.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suporte de amostraNão disponível comercialmente. O contato local no instrumento pode fornecê-los ou eles podem ser fabricados com base em um desenho técnico que pode ser fornecido pelo contato local.
Cloreto de deutério, 35 % em peso em D2O, ≥ 99 átomos % DSigma-Aldrich
543047
Óxido de deutério (D, 99,9%)EurisotopDLM-4DR-PK
Graxa de silicone de alto vácuo Dow CorningSigma-AldrichZ273554-1EA
Etanol 96%, EMSURE Reag. Ph EurSigma-Aldrich1.5901
Dessecador de vidroVWR75871-660
Placa dessecadora de vidro, 140 mmVWR89038-068
Fio de índio, 1,0 mm (0,04 pol) de diâmetro, Puratrônico, 99,999%Alfa Aesar00470.G1
Lisozima de clara de ovo de galinha dialisada, liofilizada, pó, ~100.000 U/mgSigma-Aldrich62970
nPDynv3.xveja github.com/kpounot/nPDyn, funções do modelo para encaixe também incluídas no software
OHAUS AX324 Balança Adventurer, calibração internaDutscher92641
Pentóxido de fósforo, ReagentPlus, 99%Sigma-Aldrich214701
Pipeta ErgoOne 0.5-10 μ LStarlabS7100-0510
Pipeta ErgoOne 100-1,000 μ LStarlabS7100-1000
Pipeta ErgoOne 20-200 μ LStarlabS7100-2200
Ponta de pipeta TipOne 1,000 μ LStarlabS1111-6001
Ponta de pipeta TipOne 10 μ LStarlabS1111-3200
Ponteira de pipeta TipOne 200 μ LStarlabS1111-0206
Solução de deuteróxido de sódio, 40% em peso em D2O, 99,5 átomos % DSigma-Aldrich372072
de alumínio

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