Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

Resumo

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Resumo

O espalhamento de nêutrons oferece a possibilidade de sondar a dinâmica dentro das amostras para uma ampla gama de energias de forma não destrutiva e sem marcação além do deutério. Em particular, a espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons registra os sinais de espalhamento em vários ângulos de espalhamento simultaneamente e é adequada para estudar a dinâmica de sistemas biológicos na escala de tempo ps-ns. Ao empregar D₂O - e possivelmente componentes tampão deuterizados - o método permite monitorar tanto a difusão do centro de massa quanto os movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral (dinâmica interna) de proteínas em estado líquido.

Adicionalmente, a dinâmica da água de hidratação pode ser estudada empregando-se pós de proteínas perdeuteradas hidratadas com H₂O. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho empregado no instrumento IN16B no Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar a dinâmica da água e proteína de hidratação. A preparação de amostras de solução e amostras de proteína hidratada em pó usando troca de vapor é explicada. O procedimento de análise de dados para a dinâmica da proteína e da água de hidratação é descrito para diferentes tipos de conjuntos de dados (espectros quasielásticos ou varreduras de janela fixa) que podem ser obtidos em um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons.

O método é ilustrado com dois estudos envolvendo proteínas amiloides. A agregação da lisozima em agregados esféricos de tamanho μm - partículas denotadas - é mostrada para ocorrer em um processo de uma etapa no espaço e intervalo de tempo sondados em IN16B, enquanto a dinâmica interna permanece inalterada. Posteriormente, a dinâmica da água de hidratação da tau foi estudada em pós hidratados de proteína perdeuterada. Mostra-se que os movimentos de translação da água são ativados na formação de fibras amiloides. Finalmente, etapas críticas no protocolo são discutidas quanto ao posicionamento do espalhamento de nêutrons em relação ao estudo da dinâmica em relação a outros métodos biofísicos experimentais.

Introdução

O nêutron é uma partícula massiva e sem carga que tem sido usada com sucesso ao longo dos anos para sondar amostras em vários campos, da física fundamental à biologia¹. Para aplicações biológicas, o espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, o espalhamento inelástico de nêutrons, a cristalografia e a reflectometria de nêutrons^são extensivamente utilizados ^2,3,4. O espalhamento inelástico de nêutrons fornece uma medida média da dinâmica sem a necessidade de marcação específica per se, e uma qualidade de sinal que não depende do tamanho ou da prot....

Protocolo

1. Preparar o tampão deuterado para proteínas no estado líquido

1. Dissolva todos os componentes do tampão em D₂O puro.
2. Se o eletrodo de pH foi calibrado em H₂O, ajustar o pD de acordo com a fórmula pD = pH + 0,4 usando NaOD ou DCl³⁴.
   NOTA: A utilização de D2 O em vez de H₂O pode afectar a solubilidade das proteínas e as condições de tampão poderão ter de ser adaptadas (por exemplo, por uma ligeira alteração na concentração de sal).

2. Preparar os pós H₂O-hidratados de proteína perdeuterizada

1. P....

Resultados

A agregação da lisozima em partículas foi realizada a 90 °C com concentração proteica de 50 mg/mL em tampão deuterado (NaCl 0,1 M a pD 10,5). A formação de particulados é desencadeada pelo aumento da temperatura para 90 °C e ocorre dentro de 6 h (Figura Suplementar S8). A aquisição de dados foi realizada no IN16B, conforme descrito no protocolo acima (os dados são permanentemente curados pelo ILL e acessíveis em http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Um espectro QENS fo.......

Discussão

A espectroscopia de nêutrons é o único método que permite sondar a dinâmica ps-ns média do conjunto de amostras de proteínas, independentemente do tamanho da proteína ou da complexidade da solução quando a deuteração é usada⁶. Especificamente, investigando a autodifusão de conjuntos de proteínas em solução, o tamanho hidrodinâmico de tais montagens pode ser determinado de forma inequívoca. No entanto, o método é comumente limitado pelo baixo fluxo de nêutrons, o que implica longos tempos de aquisi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte de amostra			Não disponível comercialmente. O contato local no instrumento pode fornecê-los ou eles podem ser fabricados com base em um desenho técnico que pode ser fornecido pelo contato local.
Cloreto de deutério, 35 % em peso em D2O, ≥ 99 átomos % D	Sigma-Aldrich	543047
Óxido de deutério (D, 99,9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Graxa de silicone de alto vácuo Dow Corning	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Etanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Dessecador de vidro	VWR	75871-660
Placa dessecadora de vidro, 140 mm	VWR	89038-068
Fio de índio, 1,0 mm (0,04 pol) de diâmetro, Puratrônico, 99,999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lisozima de clara de ovo de galinha dialisada, liofilizada, pó, ~100.000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	veja github.com/kpounot/nPDyn, funções do modelo para encaixe também incluídas no software
OHAUS AX324 Balança Adventurer, calibração interna	Dutscher	92641
Pentóxido de fósforo, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipeta ErgoOne 0.5-10 μ L	Starlab	S7100-0510
Pipeta ErgoOne 100-1,000 μ L	Starlab	S7100-1000
Pipeta ErgoOne 20-200 μ L	Starlab	S7100-2200
Ponta de pipeta TipOne 1,000 μ L	Starlab	S1111-6001
Ponta de pipeta TipOne 10 μ L	Starlab	S1111-3200
Ponteira de pipeta TipOne 200 μ L	Starlab	S1111-0206
Solução de deuteróxido de sódio, 40% em peso em D2O, 99,5 átomos % D	Sigma-Aldrich	372072

de alumínio