Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

Summary

Este artigo foca no uso de espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica para sondar e quantificar a termodinâmica de(II) vinculando-se a peptídeos e proteínas.

Abstract

O cobre(II) é um metal essencial em sistemas biológicos, conferindo propriedades químicas únicas às biomoléculas com as quais interage. Foi relatado para se ligar diretamente a uma variedade de peptídeos e desempenhar papéis necessários e patológicos que vão desde a estrutura mediadora até propriedades de transferência de elétrons até a função catalítica de transmissão. Quantificar a afinidade vinculante e a termodinâmica desses complexos(II)-peptídeos in vitro fornece insights sobre a força motriz termodinâmica de vinculação, competições potenciais entre diferentes íons metálicos para o peptídeo ou entre peptídeos diferentes para(II), e a prevalência do complexo(II)-peptídeo in vivo. No entanto, quantificar a termodinâmica de ligação pode ser desafiador devido a uma miríade de fatores, incluindo a contabilização de todos os equilíbrios concorrentes dentro de um experimento de titulação, especialmente nos casos em que há falta de alças espectroscópicas discretas representando o peptídeo, o íon metálico d-block e suas interações.

Aqui, um conjunto robusto de experimentos é fornecido para a quantificação precisa da termodinâmica(II)-peptídeo. Este artigo foca no uso da espectroscopia de absorção eletrônica na presença e ausência de ligantes cromofóricos para fornecer a alça espectroscópica necessária em(II) e o uso de calorimetria isotérmica isotermal livre de rótulos. Em ambas as técnicas experimentais, um processo é descrito como responsável por todo o equilíbrio concorrente. Embora o foco deste artigo esteja em(II), o conjunto descrito de experimentos pode ser aplicado além das interações(II)-peptídeos, e fornecer uma estrutura para quantificação precisa de outros sistemas de metal-peptídeos em condições fisiologicamente relevantes.

Introduction

A biologia evoluiu para utilizar a diversificada química dos íons metálicos necessários para que a vida se adapte e sobreviva em seu ambiente circundante. Estima-se que 25%-50% das proteínas usam íons metálicos para estrutura e função¹. O papel particular e o estado redox do íon metálico estão diretamente relacionados com a composição e geometria dos ligantes biológicos que o coordenam. Além disso, íons metálicos ativos de redox, como(II), devem ser fortemente regulados para que não interajam com agentes oxidantes através da química fenton para formar espécies reativas de oxigênio (ROS)

Protocol

1. Espectroscopia de absorção eletrônica: titulação direta com competição de buffer

1. Preparação da amostra
   1. Prepare uma solução tamponada de 50 mM 2-[bis(2-hidroxitila)amino]-2-(hidroximetila)propano-1,3-diol (bisTris) em pH 7.4 usando água ultrapura (resistência >18 MΩ). Remova íons metálicos de traço incubando com uma resina de alta afinidade por pelo menos 2 h com filtragem subsequente.
   2. Dissolva ou dilua uma quantidade conhecida do peptídeo no buffer sem metal.
      NOTA: Ao monitorar bandas d-d com pequenos coeficientes de extinção²¹, devem ser utilizadas concentrações mais elevadas de peptídeos. Aq....

Results

O objetivo foi quantificar e corroborar a termodinâmica de(II) vinculando-se ao C-peptídeo utilizando as técnicas complementares de espectroscopia de absorção eletrônica e ITC. Devido à natureza robusta da espectroscopia de absorção eletrônica, foi realizada uma titulação direta de(II) em 300 μM C-peptídeo (Figura 1). A adição de 150 μM de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nm, atribuída à banda d-d de(II), e continuou a aumentar até 300 μM(II) foi adicionado. Além disso, acima d.......

Discussion

Este artigo fornece um método robusto para quantificar a afinidade e termodinâmica de(II) vinculando-se aos peptídeos. Complexos com(II) são idealmente adequados para monitorar a banda de absorção d-d no local do metal devido à sua configuração de elétrons d⁹ . Embora o coeficiente de extinção seja pequeno, exigindo concentrações maiores do complexo para produzir um sinal confiável, as titulações de(II) em peptídeo podem rapidamente fornecer uma visão da estoquiometria vinculante e afinidade aproximada de liga.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,10-fenantrolina	Sigma Aldrich	131377-25G
tampão bis-Tris	Fisher	BP301-100
Membrana de 0,45 mícron	Nalgene	296-4545	Qualquer sistema de filtração que remova a resina sem introduzir contaminantes é aceitável
Cloreto de cobre(II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Espectrofotômetro de absorção eletrônico	Varian	Cary 5000	Outro espectrofotômetro sensível adequado é a
resina de alta afinidade	Sigma Aldrich	C7901-25G
Calorímetro de titulação isotérmica (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Software
	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137– 148) também pode ser usado
Software ITC	TA Instruments	ITCRun
limpador delicado leve	Kimwipe	34155
seringa de carregamento	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
cubetas combinadas	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20 Certifique-se	de que a janela para a cubeta de pequeno volume corresponda à altura do feixe do espectrofotômetro
Amortecedor MOPS	Alfa Aesar	A12914
software de espectrofotômetro	Cary	WinUV Programa
	Microsoft	Excel	Qualquer programa de planilha adequado funcionará
seringa de titulação	TA Instruments	5346
água ultrapura	Millipore Sigma	Milli-Q	Qualquer água é boa desde que >18 MΩ resistência