Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.
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Artigo de método
Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os dentes são de fundamental importância na vida não só para a mastigação alimentar e a fala, mas também para o bem-estar psicológico. O conhecimento sobre desenvolvimento dentário humano e biologia é escasso. Em particular, pouco se sabe sobre as células-tronco epiteliais do dente e sua função. Conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido dentário humano (ou seja, folículo dentário, isolado dos dentes do siso extraído). Os organoides são robustos e expansíveis a longo prazo e recapitulam o compartimento de células-tronco do dente humano proposto em termos de expressão de marcador, bem como atividade funcional. Em particular, os organoides são capazes de desdobrar um processo de diferenciação ameloblast como ocorre in vivo durante a amelogênese. Este modelo organoide único fornecerá uma ferramenta poderosa para estudar não apenas o desenvolvimento dentário humano, mas também a patologia dentária, e pode abrir caminho para a terapia regenerativa dentária. Substituir dentes perdidos por um dente biológico baseado neste novo modelo organoide pode ser uma alternativa atraente para a implantação padrão atual de materiais sintéticos.
Introdução
Os dentes têm papéis essenciais na mastigação alimentar, fala e bem-estar psicológico (autoimagem). O dente humano consiste em tecidos altamente mineralizados de densidade e durezavariadas 1. O esmalte dentário, o principal componente da coroa dentária, é o tecido mineralizado mais alto do corpo humano. Durante a formação do esmalte (amelogênese), quando os dentes se desenvolvem, as células-tronco epiteliais dentárias (DESCs) se diferenciam em células formadoras de esmalte (ameloblasts). Uma vez formado, o esmalte raramente é reparado ou renovado devido à perda apoptótica dos ameloblastas no início da erupção dentária1. ....
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Protocolo
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa UZ/KU Leuven (13/0104U). Os terceiros molares extraídos (dentes do siso) foram obtidos após o consentimento informado dos pacientes.
1. Preparativos
- Pré-aquecimento uma placa de cultura de 48 poços para 15-20 h em uma incubadora de CO2 de 1,9% a 37 °C.
- Liquefazer uma alíquota de Matrigel (fator de crescimento reduzido; livre de fenol; ainda mais referida como matriz de membrana do porão; BMM) no gelo (4 °C) pela mínima de 2h antes da etapa 2.1.
NOTA: Evite ciclos de congelamento/degelo do BMM. Liquefafique o BM....
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Resultados
Desenvolvimento organoide dentário
Fornecemos um protocolo detalhado para estabelecer culturas organoides a partir do tecido DF humano adquirido após a extração do dente do siso (Figura 1A). O DF isolado é enzimaticamente e mecanicamente dissociado. As células obtidas são cultivadas dentro da BMM em mídias que foram empiricamente definidas para o desenvolvimento e crescimento organoide ideal (meio organoide dentário; TOM)19.
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Discussão
Este protocolo descreve a geração eficiente e reprodutível de organoides a partir do dente humano. Para nosso conhecimento, esta é a primeira metodologia para o estabelecimento de organoides de conceito atual (epitelial) a partir do tecido dentário humano. Os organoides são expansíveis a longo prazo e apresentam um fenótipo de caule epitelial dentário, duplicando DESCs previamente relatados no compartimento ERM do DF7. Além disso, os organoides replicam características funcionais de DESC/ERM, incl.......
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Divulgações
O autor correspondente garante que todos os autores tenham divulgado todo e qualquer conflito de interesse.
Agradecimentos
Somos gratos a todos os membros da equipe da Cirurgia Oral e Maxilofacial (MKA) da UZ Leuven, bem como aos pacientes, por sua ajuda inestimável na coleta de terceiros molares recém-extraídos. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Reinhilde Jacobs e à Dra. Este trabalho foi apoiado por subvenções da KU Leuven (BOF) e FWO-Flanders (G061819N). L.H. é um Ph.D. Fellow (1S84718N).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Eppendorf | 30120.086 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| Placas de fundo plano de 48 poços | Corning | 3548 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | ||
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumina Bovina (grau de cultura celular) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX anticorpo | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Anfotericina B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (sem vitamina A) | Gibco | 12587-010 | |
| VWR | |||
| Catalase de fígado bovino | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 anticorpo | Abcam | ab34485 | |
| Filtro de células, 40 µ m | Falcon | 352340 | |
| Toxina da cólera | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 anticorpo | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Colagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Vidro de cobertura | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 sem Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM pó alta glicose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Soro de burro | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Estação de trabalho de embutimento, 220 a 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Etanol absoluto, ≥ 99,8% (EtOH) | Fisher Chemical | E / 0650DF / 15 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= FGF básico) | R & D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Inclui 1% de β-mercaptoetanol dissolvido em tampão de lise |
| Pipeta de vidro Pasteur | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (inibidor de ROCK, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulina do pâncreas | bovino Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 anticorpo | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (fator de crescimento reduzido; sem fenol vermelho) | Corning | 15505739 | |
| lâmina de microscópio | Millex-GV J1800AMNZ | Thermo Fisher Scientific | |
| , 0.22 μ m | Millipore | SLGV033R | |
| Águia média essencial mínima (α MEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| camundongo IgG (Alexa 555) anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetil L-cisteína | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| Anticorpo P63 | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Caneta de marcação |
| Paraformaldeído (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicilina G sal de sódio | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Placa | de PetriCorning | 353002 | |
| Fosfato tampolado com solução salina (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipeta (P20, P200, P1000) | Eppendorf ou outros | 2231300006 | |
| Pipeta de transferência de plástico (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Coelho IgG (Alexa 488) anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Bisturi (lâmina cirúrgica) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R & D Systems | 464-SH-200 | |
| Moldes de silicone (bloco de aquecimento) | VWR | 720-1918 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| piruvato de sódio (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| Anticorpo SOX2 | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | de PCR em Tempo Real | |
| Stericup-GP, 0.22 µ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Unidade de Filtro Superior de Tubo de Centrífuga Estéril, 0.22 μ m | Millipore | SCGP00525 | |
| Estéril 1000 μ L ponteiras de pipeta com filtro | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μ L ponteiras de pipeta com filtro | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μ L ponteiras de pipeta com e sem filtro | Greiner | 739288 | |
| Estéril H2O | Fresenius | B230531 | |
| Sal de sulfato de estreptomicina | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III supermix de síntese de primeira fita | Invitrogen | 11752-050 | Kit de transcrição reversa |
| Processador de tecidos | Thermo Scientific | ||
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Meio de montagem Vectashield+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Meio de montagem antifade com DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xilenos, 99%, para bioquímica e histologia | VWR | 2,89,75,325 |
Referências
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....
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Reimpressões e permissões
